本科課件發(fā)酵工程

本科課件發(fā)酵工程,本科課件,發(fā)酵工程,本科,課件,發(fā)酵,工程 第二節(jié) 氨基酸生產(chǎn)工藝氨基酸是構(gòu)成蛋白成分目前世界上可用發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸有20多種。氨基酸 碳原子分別以共價鍵連接氫原子、羧基和氨基及側(cè)鏈。側(cè)鏈不同，氨基酸的性質(zhì)不同。氨基酸的用途1.食品工業(yè)：強化食品(賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸于小麥中)增鮮劑：谷氨酸單鈉和天冬氨酸苯丙氨酸與天冬氨酸可用于制造低熱量二肽甜味劑(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此產(chǎn)品1981年獲FDA批準,現(xiàn)在每年產(chǎn)量已達數(shù)萬噸。2.飼料工業(yè)：甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造動物飼料 3.醫(yī)藥工業(yè)：多種復(fù)合氨基酸制劑可通過輸液治療營養(yǎng)或代謝失調(diào) 苯丙氨酸與氮芥子氣合成的苯丙氨酸氮芥子氣對骨髓腫瘤治療有效,且副作用低。4.化學(xué)工業(yè)：谷氨基鈉作洗滌劑,丙氨酸制造丙氨酸纖維。氨基酸的生產(chǎn)方法發(fā)酵法：直接發(fā)酵法：野生菌株發(fā)酵、營養(yǎng)缺陷型突變發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵和營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株發(fā)酵。添加前體法酶法：利用微生物細胞或微生物產(chǎn)生的酶來制造氨基酸。提取法：蛋白質(zhì)水解，從水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。傳統(tǒng)的提取法、酶法和化學(xué)合成法由于前體物的成本高,工藝復(fù)雜,難以達到工業(yè)化生產(chǎn)的目的。生產(chǎn)氨基酸的大國為日本和德國。日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭。它們能生產(chǎn)高品質(zhì)的氨基酸,可直接用于輸液制劑的生產(chǎn)。日本在美國、法國等建立了合資的氨基酸生產(chǎn)廠家,生產(chǎn)氨基酸和天冬甜精等衍生物。國內(nèi)生產(chǎn)氨基酸的廠家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前無論生產(chǎn)規(guī)模及產(chǎn)品質(zhì)量還難于與國外抗衡。在80年代中后期,我國從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿(mào)合作的方式引進輸液制劑的制造技術(shù)和仿造產(chǎn)品,1991年銷售量為二千萬瓶,1996年達六千萬瓶,主要廠家有無錫華瑞,北京費森尤斯,昆明康普萊特,但生產(chǎn)原料都依賴進口。據(jù)專家估計,到2000年,世界氨基酸產(chǎn)值可達45億美元,占生物技術(shù)市場的7%,國內(nèi)的氨基酸產(chǎn)值可達40億元,占全國發(fā)酵產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值的12%。氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)展的歷史回顧所謂氨基酸發(fā)酵,就是以糖類和銨鹽為主要原料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物,積累特定的氨基酸。這些方法成立的一個重要原因是使用選育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。菌株的育種從自然界中篩選有產(chǎn)酸能力的菌株,并建立其培養(yǎng)條件.在確立突變技術(shù)和闡明氨基酸生物合成系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制的基礎(chǔ)上發(fā)展為營養(yǎng)缺陷變異株、抗藥性菌株的育種。隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展,接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、細胞融合等手段首先用于體內(nèi)基因重組,是早期用基因重組方法構(gòu)建生產(chǎn)菌株的嘗試。隨著載體、受體系統(tǒng)的構(gòu)建及體外基因重組技術(shù)的日益完善,氨基酸生物工程菌的構(gòu)建有了長足的發(fā)展。蘇氨酸等的生產(chǎn)菌株被成功地構(gòu)建并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。2.1用野生株的方法 這是從自然界獲得的分離菌株進行發(fā)酵生產(chǎn)的一種方法。典型的例子就是谷氨酸發(fā)酵。改變培養(yǎng)條件的發(fā)酵轉(zhuǎn)換法中,有變化銨離子濃度、磷酸濃度，使谷氨酸轉(zhuǎn)向谷氨酰胺和纈氨酸發(fā)酵 2.2用營養(yǎng)缺陷變異株的方法這一方法是誘變出菌體內(nèi)氨基酸生物合成某步反應(yīng)阻遏的營養(yǎng)缺陷型變異體，使生物合成在中途停止，不讓最終產(chǎn)物起控制作用。這種方法中有用高絲氨酸缺陷株的賴氨酸發(fā)酵，有用精氨酸缺陷株的鳥氨酸發(fā)酵，還有用異亮氨酸缺陷株的脯氨酸發(fā)酵。2.3類似物抗性變異株的方法用一種與自己想獲得的氨基酸結(jié)構(gòu)相類似的化合物加入培養(yǎng)基內(nèi)，使其發(fā)生控制作用，從而抑制微生物的生長。這樣，就可以得到在這種培養(yǎng)基中能夠生長的變異株，而這種變異株正是解除了調(diào)控機制的，能夠生成過量的氨基酸。利用此方法發(fā)酵的有:蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、組氨酸和精氨酸。2.4 體內(nèi)及體外基因重組的方法基因工程包括細胞內(nèi)基因重組方法和試管內(nèi)的體外基因重組方法。體內(nèi)基因重組在應(yīng)用上又稱為雜交育種，主要方法包括：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞融合等，這都是在細胞內(nèi)暫時地產(chǎn)生染色體的局部二倍體，在兩條DNA鏈之間引起兩次以上的交叉，是遺傳性重組現(xiàn)象。細胞內(nèi)基因重組技術(shù)的缺點是，現(xiàn)在只在同種或有近緣關(guān)系的微生物之間進行并較難成功。代謝工程在闡明代謝途徑及其調(diào)控規(guī)律的基礎(chǔ)上，應(yīng)用重組DNA技術(shù)可以改變代謝途徑分支點上的流量或引入新的代謝步驟與構(gòu)建新的代謝網(wǎng)絡(luò)。其主要步驟為:鑒定目標代謝途徑涉及的酶(特別是限速酶);取得酶基因，必要時可用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，如定點誘變，基因剪接等，使蛋白具有新的特點(增強活性或穩(wěn)定性、解除反饋抑制等);將一種或多種異源的或改造后的酶基因與調(diào)節(jié)元件一起克隆進目標生物;使調(diào)節(jié)元件的作用及培育條件最優(yōu)化。3.1載體-受體系統(tǒng)及克隆表達的研究 3.1.1受體的獲得目前使用的氨基酸工程菌受體主要是大腸桿菌K-12及棒狀桿菌家族，通常是通過誘變選育出的基礎(chǔ)產(chǎn)率較高的菌株。大腸桿菌遺傳背景研究得清楚，載體系統(tǒng)完善，利于工程菌的構(gòu)建，但它含有內(nèi)毒素且不能將蛋白產(chǎn)物分泌至胞外，為應(yīng)用帶來困難。棒狀桿菌能克服這兩個缺點，但載體受體系統(tǒng)研究較晚且有限制修飾系統(tǒng)的障礙，所以獲得利于外源基因?qū)爰氨磉_且能穩(wěn)定遺傳的受體菌是尚待解決的問題。3.1.2載體的構(gòu)建 有效的載體需要有在受體菌中可啟動的復(fù)制起始位點，這可從棒狀桿菌家族內(nèi)源小質(zhì)粒中獲得;載體所需的篩選標記及外源基因插入的多克隆位點，可從常用的克隆載體中獲得。3.1.3基因轉(zhuǎn)移手段由于棒狀桿菌是革蘭氏陽性菌，CaCl2轉(zhuǎn)化法對它不適用。通常采用的方法有:原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)，電轉(zhuǎn)化，接合轉(zhuǎn)移。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法是較早采用的方法，由于受到原生質(zhì)體再生條件的局限，效率不高;電轉(zhuǎn)化方法由于高效，快速被廣泛使用，目前它的轉(zhuǎn)化效率可達到原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的1001000倍。接合轉(zhuǎn)移可用于基因在親緣關(guān)系遠的物種之間的轉(zhuǎn)移，并且可將外源基因整合于染色體上，易于穩(wěn)定遺傳。氨基酸發(fā)酵的代謝控制控制發(fā)酵的條件控制細胞滲透性控制旁路代謝降低反饋作用物的濃度消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用促進ATP的積累，以利氨基酸的生物合成控制發(fā)酵的條件專性需氧菌，控制環(huán)境條件可改變代謝途徑和產(chǎn)物?？刂萍毎麧B透性生物素、油酸和表面活性劑，引起細胞膜的脂肪酸成分的改變。青霉素：抑制細胞壁的合成，由于細胞面內(nèi)外的滲透壓而泄露出來?？刂婆月反x降低反饋作用物的濃度利用營養(yǎng)缺陷型突變株進行氨基酸發(fā)酵必須限制所要求的氨基酸的量。限制精氨酸的濃度可解除反饋抑制，實現(xiàn)鳥氨酸的生物合成。消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用使用抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的方法。促進ATP的積累，以利氨基酸的生物合成ATP的積累可促進氨基酸的生物合成氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基pH溫度氧培養(yǎng)基1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烴 碳源濃度過高時，對菌體生長不利，氨基酸的轉(zhuǎn)化率降低。菌種性質(zhì)、生產(chǎn)氨基酸種類和所采用的發(fā)酵操作決定碳源種類2、氮源：銨鹽、尿素、氨水；同時調(diào)整pH值。營養(yǎng)缺陷型添加適量氨基酸主要以添加有機氮源水解液。需生物素和氨基酸，以玉米漿作氮源。尿素滅菌時形成磷酸銨鎂鹽，須單獨滅菌?？煞峙骷?。氨水用pH自動控制連續(xù)流加3、合適C/N氮源用于調(diào)整pH。合成菌體生成氨基酸，因此比一般微生物發(fā)酵的C/N高。4、磷酸鹽：對發(fā)酵有顯著影響。不足時糖代謝受抑制。5、鎂：是已糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶和羧化酶的激活劑，并促進葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力。6、鉀：促進糖代謝。谷氨酸產(chǎn)酸期鉀多利于產(chǎn)酸，鉀少利于菌體生長。7、鈉：調(diào)節(jié)滲透壓作用，一般在調(diào)節(jié)pH值時加入。8、錳：是許多酶的激活劑。9、鐵：是細胞色素、細胞色素氧化酶和過氧化氫酶的活性基的組成分，可促進谷氨酸產(chǎn)生菌的生長。10、銅離子：對氨基酸發(fā)酵有明顯毒害作用。生長因子：生物素 作用：影響細胞膜透性和代謝途徑。濃度：過多促進菌體生長，氨基酸產(chǎn)量低。過少菌體生長緩慢，發(fā)酵周期長。與其它培養(yǎng)條件的關(guān)系：氧供給不足，生物素過量時，發(fā)酵向其它途徑轉(zhuǎn)化。種類：玉米漿、麩皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜為來源。pH對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制作用機理：主要影響酶的活性和菌的代謝?？刂苝H方法：流加尿素和氨水流加方式：根據(jù)菌體生長、pH變化、糖耗情況和發(fā)酵階段等因素決定?？刂疲海?）菌體生長或耗糖慢時，少量多次流加尿素，避免pH過高（2）菌體生長或耗糖過快時，流加尿素可多些，以抑制菌體生長。（3）發(fā)酵后期，殘?zhí)巧?，接近放罐時，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困難。（4）氨水對pH影響大，應(yīng)采取連續(xù)流加。溫度對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制菌體生長達一定程度后再開始產(chǎn)生氨基酸，因此菌體生長最適溫度和氨基酸合成的最適溫度是不同的。菌體生長溫度過高，則菌體易衰老，pH高，糖耗慢，周期長，酸產(chǎn)量低。采取措施：少量多次流加尿素，維持最適生長溫度，減少風(fēng)量等，促進菌體生長。氧對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸發(fā)酵：生物合成與TCA循環(huán)有關(guān)。適宜在缺氧條件下進行的亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸發(fā)酵：菌體呼吸受阻時產(chǎn)量最大。供氧不足時產(chǎn)酸受輕微影響的天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵谷氨酸生產(chǎn)工藝工業(yè)化生產(chǎn)開始于由水解小麥面筋或大豆蛋白質(zhì)而制取。1957年，日本率先采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，并投入大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，這是被譽為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的重大創(chuàng)舉，使發(fā)酵工業(yè)進入調(diào)節(jié)代謝的調(diào)控階段。目前世界產(chǎn)谷氨酸鈉30噸/年，占氨基酸總量的2/3。我國現(xiàn)已有200余家生產(chǎn)，年產(chǎn)量達15萬噸，居世界首位。產(chǎn)生菌株特點：革蘭氏陽性不形成芽胞沒有鞭毛，不能運動需要生物素作為生長因子在通氣條件下才能產(chǎn)生谷氨酸。谷氨酸生物合成機理：由三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脫氫酶和氫供體存在下進行還原性氨化作用而得到。一、淀粉水解糖的制備：酸水解或酶水解1、調(diào)漿：干淀粉用水調(diào)成10-11Bx的淀粉乳，加鹽酸0.5-0.8至pH1.5。2、糖化：蒸汽加熱，加壓糖化25min。冷卻至80下中和。3、中和：燒堿中和，至pH4.0-5.04、脫色：活性炭脫色和脫色樹脂?；钚蕴坑昧繛?.6-0.8，在70度及酸性條件下攪拌后過濾。酶法糖化：以大米或碎米為原料時采用大米進行浸泡磨漿，再調(diào)成15Bx，調(diào)pH6.0，加細菌a-淀粉酶進行液化，85 30min，加糖化酶60 糖化24h，過濾后可供配制培養(yǎng)基。糖蜜原料：不宜直接用來作為谷氨酸發(fā)酵的碳源，因含豐富的生物素。預(yù)處理方法：活性碳或樹脂吸附法和亞硝酸法吸附或破壞生物素。也可以在發(fā)酵液中加入表面活性劑吐溫60或添加中青霉素。二、菌種擴大培養(yǎng)1、斜面培養(yǎng)：主要產(chǎn)生菌是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬、節(jié)桿菌屬。我國各工廠目前使用的菌株主要是鈍齒棒桿菌和北京棒桿菌及各種誘變株。生長特點：適用于糖質(zhì)原料，需氧，以生物素為生長因子。斜面培養(yǎng)基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉組成的pH7.0-7.2瓊脂培養(yǎng)基，32培養(yǎng)18-24h。2、一級種子培養(yǎng)：由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳組成。pH6.5-6.8。1000ml裝200-250ml振蕩，32 培養(yǎng)12h。3、二級種子培養(yǎng)：用種子罐培養(yǎng)，料液量為發(fā)酵罐投料體積的1，用水解糖代替葡萄糖，于32 進行通氣攪拌7-10h。種子質(zhì)量要求：二級種子培養(yǎng)結(jié)束時，無雜菌或噬菌體污染，菌體大小均一，呈單個或八字排列?；罹鷶?shù)為108-109/ml。三、谷氨酸發(fā)酵1、適應(yīng)期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。措施：接種量和發(fā)酵條件控制使期縮短。2、對數(shù)生長期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急劇下降后維持在一定水平。菌體濃度迅速增大，菌體形態(tài)為排列整齊的八字形。不產(chǎn)酸。12h。措施：及時供給菌體生長必須的氮源及調(diào)節(jié)pH，在pH7.5-8.0時流加尿素；維持溫度30-323、菌體生長停止期：谷氨酸合成。措施：提供必須的氨及pH維持在7.2-7.4。大量通氣，控制溫度34-37。4、發(fā)酵后期：菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑?。措施：營養(yǎng)物耗盡酸濃度不增加時，及時放罐。發(fā)酵周期一般為30h。谷氨酸發(fā)酵控制（1）生物素：作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA的輔酶，參與脂肪酸的生物合在，進而影響磷酯的合成。當磷酯含量減少到正常時的一半左右時，細胞發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內(nèi)滲出，積累于發(fā)酵液中。生物素過量，則發(fā)酵過程菌體大量繁殖，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，你謝產(chǎn)物中乳酸和琥珀酸明顯增多。（2）種齡和種量的控制一級種子控制在11-12h，二級控制在7-8h。種量為1。過多，菌體嬌嫩，不強壯，提前衰老自溶，后期產(chǎn)酸量不高。（3）pH。發(fā)酵前期，幼齡細胞對pH較敏感，pH過低，菌體生長旺盛，營養(yǎng)成分消耗大，轉(zhuǎn)入正常發(fā)酵慢，長菌不長酸。谷氨酸脫氫酶最適pH為7.0-7.2，轉(zhuǎn)氨酶最適pH 7.2-7.4。在發(fā)酵中后期，保持pH不變。過高轉(zhuǎn)為谷氨酰胺，過低氨離子不足。（4）通風(fēng)：不同種齡、種量，培養(yǎng)基成分，發(fā)酵階段及發(fā)酵罐大小要求通風(fēng)量不同。在長菌體階段，通風(fēng)量過大，生物素缺乏，抑制菌體生長。在發(fā)酵產(chǎn)酸階段，需要大量通風(fēng)供氧，以防過量生成乳酸和琥珀酸，但過大通風(fēng)，則大量積累a-酮戊二酸。防止噬菌體和雜菌的污染從空氣過濾、培養(yǎng)基、設(shè)備、環(huán)境等環(huán)節(jié)嚴格把關(guān)。四、谷氨酸的提取1、等電點法：操作簡單，收率60。周期長，占地面積大。2、離子交換法：用陽離子交換樹脂提取吸附谷氨酸形成的陽離子，再用熱堿洗脫，收集相應(yīng)流分，再加鹽酸結(jié)晶。谷氨酸發(fā)酵研究新進展繼續(xù)選育各種生化突變菌株：轉(zhuǎn)化率提高，或可在富含生物素的培養(yǎng)基中保持較高產(chǎn)酸水平。提高原料利用率，拓寬原料來源或簡化操作工藝。生物工程新技術(shù)的應(yīng)用：體外DNA重組的基因工程和原生質(zhì)體融合技術(shù)和固定化細胞技術(shù)使產(chǎn)量提高近1倍。改進發(fā)酵工藝：開拓原料，改進流加工藝，通過電子計算機控制發(fā)酵條件。非糖質(zhì)原料的谷氨酸發(fā)酵醋酸發(fā)酵谷氨酸 機理：醋酸形成乙酰CoA，再進入TCA，因此凡能利用葡萄糖原料的菌種也可作為醋酸發(fā)酵谷氨酸的菌株。以醋酸鈉或醋酸銨與醋酸的混合液為原料，且濃度不超過4。發(fā)酵過程中也需流加以保持pH。