本科課件發(fā)酵工程

本科課件發(fā)酵工程,本科課件,發(fā)酵工程,本科,課件,發(fā)酵,工程 第二章第二章生產(chǎn)中常用菌種的分離、生產(chǎn)中常用菌種的分離、選育和保藏選育和保藏第一節(jié)第一節(jié)菌種的分離篩選菌種的分離篩選第二節(jié)第二節(jié)培養(yǎng)分離培養(yǎng)分離第三節(jié)第三節(jié)工業(yè)微生物育種工業(yè)微生物育種第四節(jié)第四節(jié)菌種的保藏及活化菌種的保藏及活化帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種顯微觀察裝置顯微觀察裝置第一節(jié)第一節(jié)菌種的分離簡介菌種的分離簡介一、菌種的來源一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。二、分離思路二、分離思路新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設(shè)備與之配合。定定方方案案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：采樣：有針對性地采集樣品。增增殖殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)發(fā)酵酵性性能能測測定定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟三、新種分離與篩選的步驟菌種篩選主要步驟調(diào)查研究及查閱充分的資料設(shè)計實驗方案確定采集樣品的生態(tài)環(huán)境采樣確定特定的增殖條件增殖培養(yǎng)確定特殊的選擇培養(yǎng)基及可能的定性或半定量快速檢出法平板分離分離原種斜面確定發(fā)酵培養(yǎng)基礎(chǔ)條件篩選初篩（1株1瓶）復(fù)篩（1株35瓶）結(jié)合初步工藝條件摸索再復(fù)篩（1株35瓶）35株單株純種分離分離生產(chǎn)性能試驗毒性試驗菌種鑒定（一）采樣一）采樣1、采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主；富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。從自然界篩選從自然界篩選2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。（二）增殖培養(yǎng)（二）增殖培養(yǎng)為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。（三）培養(yǎng)分離（三）培養(yǎng)分離盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進一步應(yīng)用，而且控制得細一點，好一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。1.稀釋平皿分離法1.稀釋平皿分離法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀釋1.稀釋平皿分離法b.涂布平皿分離法a.傾注平皿分離法2.平皿劃線分離法a.連續(xù)劃線分離法b.分區(qū)劃線分離法（四）篩（四）篩選選這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。（五）毒性試驗（五）毒性試驗自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。第二節(jié)第二節(jié)培養(yǎng)分離培養(yǎng)分離從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟。到目前為止，還沒有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類。在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株；在工業(yè)微生物篩選過程中，應(yīng)及時調(diào)整檢測方法，以與各種不同類型的生長和代謝之微生物相適應(yīng)。因此，建立一更為科學(xué)的和針對性不強的分離方法是必要的。一、成功的分離培養(yǎng)方法一、成功的分離培養(yǎng)方法(1)認真考它所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過程；(2)制訂初步的篩選標(biāo)準(zhǔn)；(3)將生態(tài)學(xué)方法運用到分離和篩選過程。三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離的一般思路要點的一般思路要點1羅列出所要分離的微生物類群；2根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù)，描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地：3將若干樣本分成若干類型，如植物和植物各部，土壤(類型和土層)、巖石、水、昆蟲和發(fā)酵食品等；4羅列出所要考察和測量的環(huán)境參數(shù)，如pH、鹽分、水分、氧化還原電勢及溫度等；5列出生物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質(zhì)、葡萄表皮的果膠；6根據(jù)上述1-5項中所獲得的數(shù)據(jù)，設(shè)計分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養(yǎng)條件；7用標(biāo)準(zhǔn)方法作對照來評價生態(tài)學(xué)分離方法；8根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要，修改已知的方法；9運用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類群。四、自然界中細菌的分離四、自然界中細菌的分離(一一)采樣和采集方法采樣和采集方法為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時，必須十分重視樣本的采集。樣本采集時所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。采樣的注意事項采樣的注意事項1、采樣時應(yīng)盡可能保持相對無菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類及采集日期、地點以及采集地點的地理、生態(tài)參數(shù)等；4、應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，因為真正的原地菌群的出現(xiàn)可能是短暫的；5、采好的樣應(yīng)及時處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4下，但貯存時間不宜過長。這是因為一旦采樣結(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長(二二)生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基的組成原則的組成原則1、加入培養(yǎng)基中的天然提取物種類和用量、環(huán)境生物物理學(xué)參數(shù)以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會影響實驗中所要分離的細菌的數(shù)量和種類。2、就分離培養(yǎng)基的組成而言，部分培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養(yǎng)基中的天然提取物，部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳、氮源，如幾丁質(zhì)、纖維素或果膠。3、所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50gm1，以抑制真菌的生長。4、瓊脂平板在使用前應(yīng)置于37培養(yǎng)箱中孵育l、2天。5、培養(yǎng)基的生物物理學(xué)參數(shù)，如pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。二、分離分離目的微生物不純，需分離分離純化。采用簡便迅速，有一定準(zhǔn)確性的檢出方法，提高篩選效率。常用平皿反應(yīng)法：紙片培養(yǎng)顯色法：浸有指示劑濾紙。透明圈透明圈法：混濁底物被分解后形成透明圈透明圈。如可溶性淀粉、碳酸鈣等。變色圈法：直接用顯色劑或指示劑。生長圈法：利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，要分離分離的微生物能在一般培養(yǎng)條件下生長而合成該營養(yǎng)物而使工具菌能生長，形成生長圈。抑制圈法：瓊脂塊培養(yǎng)法。用剛果紅染色法鑒定篩選降解纖維素的菌株羧甲基纖維素鈉作培養(yǎng)物抗生素篩選檢定菌培養(yǎng)，加上發(fā)酵液五、放線菌的分離培養(yǎng)基的組成原則五、放線菌的分離培養(yǎng)基的組成原則大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落。在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。選擇性地添加抗生素。分離瓊脂平板制備好后，一般皆應(yīng)在37培養(yǎng)箱中存放3天。放線菌的分離放線菌的分離土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。水中放線菌的分離：為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或濾紙過濾，取離心沉積或濾紙表面沉積進行系列稀釋和涂布。次代培養(yǎng)及純化次代培養(yǎng)及純化菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。通過高倍放大進行鏡檢，可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況。成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不同的生長形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時顯得尤為重要。將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點接到瓊脂平板上進行影印培養(yǎng)，以進一步篩選和分離。放線菌菌落形態(tài)六六、真菌分離1、利用低碳氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長菌落分散，利于計數(shù)，分離和鑒定。這里主要是利用營養(yǎng)成分的減少而使生長減慢，并由此限制真菌的遷徙生長。2、改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的分離。3、有時，真菌子實體形成必須有光線，這在分離培養(yǎng)時應(yīng)加以考慮。4、選擇性富集：是通過一定的方式使樣本中一種或一群微生物數(shù)量上的增加而利于分離的一種技術(shù)。富集可以是種水平的，如通過營養(yǎng)要求的改變來富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。5、在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效地抑制細菌生長及菌落形成。真菌的分離方法真菌的分離方法土中真菌的分離：稀釋法，混入法，壓貼法，粘附法，浮選法，注射器采集法，土過篩法，庶糖密度梯度離心法。植物材料中真菌的分離：植入法，壓貼法，洗滌法，浸泡法。水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離。餌誘技術(shù)常用于水中真菌的富集。子實體直接分離培養(yǎng)擔(dān)子菌：新采集的子實體組織植入平板內(nèi)或在放于液體培養(yǎng)基表面放一小塊無菌濾紙上培養(yǎng)。七、生產(chǎn)選種七、生產(chǎn)選種是在長年累月的生產(chǎn)實踐中，在培養(yǎng)工藝條件沒有任何可見變更情況下，突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大，這就有可能是個別自然變異朝更好的方向變的細胞，在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件，并逐漸顯示出它的生長優(yōu)勢，這種優(yōu)勢的發(fā)展，促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露。第四節(jié)第四節(jié) 工業(yè)菌種的育種方針工業(yè)菌種的育種方針工業(yè)菌種的育種：是運用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對某個用于特定生物技術(shù)目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。工業(yè)菌種育種的方法工業(yè)菌種育種的方法誘變基因轉(zhuǎn)移基因重組育種過程育種過程包括下列3個步驟：(1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的選出。(3)改良菌種的評價(包括實驗規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模)。選擇育種方法時綜合考慮的因素選擇育種方法時綜合考慮的因素(1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗)；(2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬面認識的明了程度；(3)經(jīng)濟費用。如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術(shù)：如果對其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。工業(yè)菌種改良方法工業(yè)菌種改良方法(1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。(2)增加前體物的濃度。(3)改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。(4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。(5)改進菌種外泌產(chǎn)品的能力。(6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。提高特定基因的表達水平提高特定基因的表達水平(1)引入強轉(zhuǎn)錄及翻譯信號，可通過在一高效表達載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強啟動子；修改現(xiàn)有表達信號，提高基因效力等。(2)誘導(dǎo)解除基因表達抑制的突變。改進菌種的生長效率改進菌種的生長效率提高菌株對底物的利用率方法：a.通過確定并改變代謝中的耗能部分;b.由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來實現(xiàn)。c.賦予菌種對多種底物，特別是價廉而豐富的底物的利用能力，由此可降低操作費用。第四節(jié)第四節(jié) 誘變育種誘變育種以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。誘變物理、化學(xué)或生物誘變方法物理、化學(xué)或生物誘變方法一、誘變劑和誘變處理物理誘變劑：射線如紫外線、X射線、射線，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用，否則有一定危險性。超凈工作臺小型小型X射線衍射儀射線衍射儀Co60射線機化學(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類似物、5氟尿嘧啶、烷化劑等。化學(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟的，因為只需要少量的合適的誘變劑，設(shè)備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射行工作時，設(shè)備費用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當(dāng)心。誘變劑的選擇誘變劑的選擇1堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。2亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。3吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。二、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選(一一)出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇1自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果。2在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4出發(fā)菌株開始時可以同時選23株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。5要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。6根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復(fù)處理會使細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期的細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。(二二)處理菌懸液的制備處理菌懸液的制備這一步驟的關(guān)鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。帶玻璃珠的三角瓶內(nèi),加無菌水(三三)誘變處理誘變處理根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實際，設(shè)計誘變處理方案。(四四)中間培養(yǎng)中間培養(yǎng)由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。此過程稱為中間培養(yǎng)這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。方法：讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。(五五)分離和篩選分離和篩選篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。搖床復(fù)篩降解纖維素產(chǎn)生產(chǎn)透明圈病毒產(chǎn)生產(chǎn)空斑紫外線的誘變育種紫外線的誘變育種紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為2537A燈與處理物的距離為1530cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在7080%為宜。被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為106個/ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為106107個/ml。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約0.51.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進行。(二)操作步驟1將細菌培養(yǎng)液以3000rmin離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。2將菌懸液放入一已滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數(shù)可達108個ml左右，作為待處理菌懸液。3取24m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外線10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射1050s。操作均應(yīng)在紅燈下進行，或用黑紙包住，避免白熾光。4取未照射的制備菌液和照射菌液各0.5ml進行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。5取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120rmin振蕩培養(yǎng)46h。6取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。7挑取菌落進行篩選。亞硝基胍誘變曲霉菌亞硝基胍誘變曲霉菌N甲 基 N-硝 基-N-亞 硝 基 胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很清楚，據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強。(二)操作步驟1單孢子懸液制備取斜面，加入6ml0.1molLpH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達l06個ml，此為待處理孢子懸液。2MNNG溶液的制備用分析天平稱取2mg，加入2ml0.1molLpH6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。3誘變處理吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子懸液中，30振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分離培養(yǎng)，303天后計數(shù)。4死亡率計算將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離，30下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計算出死亡率。5挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選第五節(jié)第五節(jié) 營養(yǎng)缺陷型的選育營養(yǎng)缺陷型的選育營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。與營養(yǎng)缺陷型對應(yīng)的是野生型。與篩選營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型有關(guān)的三類培養(yǎng)基基 本 培 養(yǎng) 基（M M，minimalmedium）能滿足某一菌種的野生型或原養(yǎng)型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。補充培養(yǎng)基（SM，supplementalmedium）在基本培養(yǎng)基中有針對性地補加某一種或幾種營養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的營營養(yǎng)養(yǎng)缺缺陷陷型型菌株生長需要（其他營營養(yǎng)養(yǎng)缺缺陷陷型型仍不能生長）的培養(yǎng)基。完 全 培 養(yǎng) 基（C M，completemedium）可滿足該菌各種營營養(yǎng)養(yǎng)缺缺陷陷型型菌株營養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。營養(yǎng)缺陷型的用途營養(yǎng)缺陷型的用途營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜一、誘變方法一、誘變方法物理誘變化學(xué)誘變二、淘汰野生型二、淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生長，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。由于細菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。三、檢出缺陷型三、檢出缺陷型原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。具體方法：影印法、點種法、夾層法1將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。2將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標(biāo)記方位。3將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。(一一)影印法影印法4 將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。5二平皿相同方位進行比較，即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長出的菌落少于GM平板上的。MM上未長而相應(yīng)于CM上長出的那幾個菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。(二二)點種法點種法也就是任意法。用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。此法結(jié)果明確，但工作量大。(三三)夾層法夾層法先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。此法缺點是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。四、營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定四、營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定驗證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長譜測定。生長譜測定的方法生長譜測定的方法將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的56個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)。個平皿測一個菌。以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子。在56個平皿上可測20株菌以上。第六節(jié)第六節(jié) 基因育種基因育種基因重組育種：是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細菌質(zhì)粒或其他載體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復(fù)制和表達，或者通過細胞間的相互作用，使一個細胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另個細胞的方法。一個完整的基因克隆過程包括以一個完整的基因克隆過程包括以下步驟下步驟、獲得待克隆的DNA片段（基因）；、目的基因與載體在體外連接；、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞；、篩選、鑒定陽性重組子；、重組子的擴增與或表達。2.2基因重組一、質(zhì)粒的特點一、質(zhì)粒的特點1、質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動必需。2、每個細胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異，同一質(zhì)粒在不同條件下，拷貝數(shù)也可能差異很大，有嚴(yán)緊型和松弛型兩種。3、質(zhì)粒DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見的一種是共價、閉環(huán)狀DNA(CCCDNA)；其次是由于條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán)DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性DNA。質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細胞的二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細胞的不同表現(xiàn)型不同表現(xiàn)型抗生素抗性：抗生素的產(chǎn)生；大腸桿菌素的產(chǎn)生；腸毒素的產(chǎn)生；復(fù)雜有機化合物的降解；限制性核酸內(nèi)切酶和修飾酶的產(chǎn)生；殺傷性能。在自然條件下，許多質(zhì)?？山?jīng)細菌接合或相似方式在宿主間相互轉(zhuǎn)移。在實驗室條件下，質(zhì)粒也可經(jīng)人工手段將其轉(zhuǎn)化入宿主細胞內(nèi)。載體宿主系統(tǒng)載體宿主系統(tǒng)載體(vector)是攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增和表達的DNA；一般是通過改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。載體應(yīng)具備以下條件：載體應(yīng)具備以下條件：、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷毎袕?fù)制；、具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆位點）以便外源DNA插入；、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽性與陰性重組分子；、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體DNA與宿主DNA便于分離；、對于表達型載體還應(yīng)具有與宿主細胞相適應(yīng)的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。宿主細胞必須符合以下條件宿主細胞必須符合以下條件、對載體的復(fù)制和擴增沒有嚴(yán)格的限制；、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA；、在重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾；、重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組；、容易導(dǎo)入重組DNA分子；、符合重組DNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。目的基因的獲取目的基因的獲取一、通過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內(nèi)切酶。cDNA：用mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，再經(jīng)DNA聚合酶的作用產(chǎn)生雙鏈DNA?？扇コ婧松锘蛑胁槐磉_的內(nèi)含子。二、化學(xué)合成法制備DNA片段從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴增基因片段對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（），以基因組DNA或cDNA模板擴增得到目的基因片段。PCRPCR技術(shù)技術(shù)根據(jù)需擴增片段的兩端設(shè)計引物。使DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長）反應(yīng)。特點：需要很少的DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。DNADNA擴增擴增PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)DNADNA片斷的克隆片斷的克隆載體的條件載體的條件：a 復(fù)制起點 b 適宜的限制酶切點c 選擇標(biāo)記DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組DNA技術(shù)的關(guān)鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。一、一、DNADNA連接酶連接酶DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段相鄰的5-磷酸和3-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自噬菌體的DNA 連接酶。T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于：、連接具有同源互補粘性末端的片段；、連接雙鏈DNA分子間的平端；、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。重組重組DNADNA導(dǎo)入宿主菌導(dǎo)入宿主菌 體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。一、轉(zhuǎn)一、轉(zhuǎn) 化化指以細菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細胞的過程。轉(zhuǎn)化時，細菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細菌，它的優(yōu)點是操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。二、轉(zhuǎn)染和感染二、轉(zhuǎn)染和感染利用噬菌體DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。重組克隆的篩選與鑒定重組克隆的篩選與鑒定基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過細菌培養(yǎng)以及重組子的擴增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達該基因的產(chǎn)物。一、抗藥性標(biāo)志的篩選一、抗藥性標(biāo)志的篩選如果克隆載體帶有某種抗藥性標(biāo)志基因如ampr或tetrr，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來。如果重組DNA時將外源基因插入標(biāo)志基因內(nèi)，該標(biāo)志基因失活，通過有無抗菌素培養(yǎng)基對比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉(zhuǎn)化菌落。二、二、半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選很多載體都攜帶一段細菌的lacZ基因，它編碼半乳糖苷酶N-端的146個氨基酸，稱為肽，它表達半乳糖苷酶的C-端肽鏈。當(dāng)載體與宿主細胞同時表達兩個片段時，宿主細胞才有半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal 變?yōu)樘m色化合物，這就是所謂的互補。而重組子由于基因插入使肽基因失活，不能形成互補，在含X-gal的平板上，含陽性重組子的細菌為無色菌落或噬菌斑。三、菌落快速裂解鑒定法從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質(zhì)粒大小，判斷有無插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。四、內(nèi)切酶圖譜鑒定經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNA，用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入的方向。重組重組DNADNA的鑒定的鑒定遺傳學(xué)方法遺傳學(xué)方法第七節(jié)第七節(jié) 原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會上提出來的。一、原生質(zhì)體融合育種的特點一、原生質(zhì)體融合育種的特點(一)雜交頻率較高：細胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體。(二)受接合型或致育型的限制較小：二親株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。(三)遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細胞質(zhì)和細胞核進行類似的合二為一的過程。(四)存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性。（五有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。(六)提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。(七)有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。二、原生質(zhì)體融合育種步驟二、原生質(zhì)體融合育種步驟1標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證。2原生質(zhì)體制備。3等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進融合。4涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。5選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進一步試驗、保藏。6生產(chǎn)性能篩選。三、原生質(zhì)體融合育種的要點三、原生質(zhì)體融合育種的要點（一）標(biāo)記菌種的選擇 獲得標(biāo)記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或和抗藥性菌株。這里最重要的是標(biāo)記必須穩(wěn)定。采用抗藥性菌株除可作標(biāo)記外，在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標(biāo)記菌種。(二二)原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細胞壁分解酶，將細胞壁分離剝離，結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細胞，它保持原細胞的一切活性。在放線菌和細菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。影響原生質(zhì)體制備的因素影響原生質(zhì)體制備的因素1菌體的前處理 為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些前處理。如細菌加入亞抑制劑量的青霉素。2菌體的培養(yǎng)時間 為了使細胞易于原生質(zhì)體化，一般選擇增殖期的菌體。3 酶濃度 對于不同種屬的微生物，不僅對酶的種類要求不同，就是對酶的濃度也有差異。另外，最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化。4酶處理溫度 5破壁時的pH值6滲透壓穩(wěn)定劑 等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機物和KCl和NaCl等無機物。第八節(jié)第八節(jié) 篩選新的代謝產(chǎn)物篩選新的代謝產(chǎn)物一、開發(fā)新的代謝產(chǎn)物的途徑一、開發(fā)新的代謝產(chǎn)物的途徑(1)從自然界分離新的微生物菌株，或采用新的檢閱方法篩選新的代謝產(chǎn)物。(2)對已知微生物的代謝產(chǎn)物進行化學(xué)修飾。(3)利用微生物轉(zhuǎn)化改造代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。(4)通過原生質(zhì)體融合獲得新的代謝產(chǎn)物。(5)DNA重組技術(shù)。二、篩選微生物新的代謝產(chǎn)物二、篩選微生物新的代謝產(chǎn)物的程序的程序突變型菌株的篩選突變型菌株的篩選一、產(chǎn)量性狀突變株的篩選三、篩選微生物代謝產(chǎn)物的目標(biāo)三、篩選微生物代謝產(chǎn)物的目標(biāo)篩選克服抗生素抗性菌株的活性物質(zhì)；篩選抗腫瘤、抗病毒的活性物質(zhì)；研究有藥理活性的酶抑制劑及免疫調(diào)節(jié)劑；尋找食品工業(yè)最好的酵母培養(yǎng)物；篩選降解有害物質(zhì)的微生物以及治療上具有低毒、長效的化學(xué)藥物等。四、篩選微生物代謝產(chǎn)物的方法四、篩選微生物代謝產(chǎn)物的方法(一)直接方法為了盡快確定微生物代謝產(chǎn)物的利用前途，在體外試驗測得活性后，可以將培養(yǎng)液的有效成分直接作用于機體，觀察被測樣品的療效。這種直接確定代謝產(chǎn)物用途的方法亦稱動物體內(nèi)治療試驗。(二)間接方法 篩選醫(yī)用抗生素，可用細茵、真菌、病毒或腫瘤模型，尋找抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤抗生素、酶抑制劑、免疫制劑等有效物質(zhì)。在預(yù)篩選時，多用瓊脂平扳擴散抑菌法。通過預(yù)篩選，直接測定最初分離物的生物活性，能加速篩選過程。五、檢測系統(tǒng)五、檢測系統(tǒng)篩選過程的成功依賴于排除那些已知的或并非需要的代謝產(chǎn)物的檢驗方法，這樣才能識別出人們需要的化合物。性能簽別性能簽別性能鑒別是分離和篩選微生物代謝產(chǎn)物中最基礎(chǔ)的工作。鑒別可分為兩方面：一是對微生物方面進行形態(tài)、培養(yǎng)、生化功能答試驗觀察，并確定微生物產(chǎn)生菌的類群；二是從化學(xué)的早期鑒別來鑒別微生物的代謝產(chǎn)物。化學(xué)的早期鑒別一般對產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進行紙上層析、薄板層析、紙上電泳、抗菌譜、高壓電泳、紫外分光光度法、液相和氣相色譜等試驗，井獲得各種圖譜，與已知圖譜進行比較鑒別。薄板層析結(jié)果如果認為是有實用前途的代謝產(chǎn)物，則要進一步大量培養(yǎng)，并進行動物試驗、毒性考查、藥物代謝等實驗，并進行提高發(fā)酵水平和改善提取工藝的工作，以備投入生產(chǎn)。如果是新的代謝產(chǎn)物一般要進一步確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，井在此基礎(chǔ)上進行合成法的研究或進行化學(xué)改造，研究結(jié)構(gòu)與生物活性的相互關(guān)系，并對作用機制、生物合成過程作進一步的研究。菌種篩選方法菌種篩選方法誘變處理后，突變細胞只占存活細胞的百分之幾，而能使生產(chǎn)狀況提高的細胞又只是突變細胞中的少數(shù)。為了花費最少的工作量，在最短的時間內(nèi)取得最大的篩選成效，就要求采用效率較高的科學(xué)篩選方案和手段。菌種篩選方案菌種篩選方案初篩：目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良菌種不致于漏網(wǎng)。初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次。初篩的手段應(yīng)盡可能快速、簡單。復(fù)篩的目的是確認符合生產(chǎn)要求的菌株，所以，復(fù)篩步驟以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。菌種篩選的手段菌種篩選的手段初篩從菌體形態(tài)變異分析 平皿快速檢測法具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等 搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法也可用于初篩。初篩的搖瓶培養(yǎng)一般是一個菌株只做一次發(fā)酵測定，從大量菌株中選出10-20%較好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而復(fù)篩中搖瓶培養(yǎng)一般是一個菌株培養(yǎng)3瓶，選出3-5個較好的菌株，再做進一步比較，選出最佳的菌株。特殊變異菌的篩選方法特殊變異菌的篩選方法 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 經(jīng)誘變處理后的菌懸液在篩選前一般應(yīng)先進行誘變后培養(yǎng)，以促使變異細胞發(fā)生分離，防止出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，篩選出不純的菌株。營養(yǎng)缺陷型的篩選一般包括濃縮、進一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。抗性突變菌株的篩選抗性突變株的篩選相對比較容易，只要有10-6頻率的突變體存在，就容易篩選出來。抗性突變株的篩選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段。一次性篩選法噬菌體抗性菌株、耐高溫菌株 階梯性篩選法藥物抗性突變株。組成酶變異株的篩選 許多水解酶是誘導(dǎo)酶，只有在含有底物或底物類似物的培養(yǎng)環(huán)境中，微生物才會合成這些酶類，所以，誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)不僅需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物的種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物的影響。具體的篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導(dǎo)抑制物法。1)恒化器法：常被用于微生物的“馴化”。在培養(yǎng)基中添加不能起誘導(dǎo)作用的低濃度底物，菌生長速率極慢，而群體中少數(shù)組成型變異株則可合成有關(guān)的酶，分解利用該底物，生長速率較快。為了提高組成酶變異株的優(yōu)勢，即它在群體中的比例，可以應(yīng)用恒化器培養(yǎng)技術(shù)。隨著恒化器培養(yǎng)中不斷加入新鮮基質(zhì)而逐漸增大組成酶變異株的優(yōu)勢，這樣就能夠比較容易地做進一步的純化分離。2)循環(huán)培養(yǎng)法：利用不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境進行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。當(dāng)接種到不含誘導(dǎo)物而含有其它可利用碳源的培養(yǎng)基中時，兩種類型菌株同樣能較好地生長，但在此環(huán)境中組成型突變株已能合成有關(guān)的水解酶，而誘導(dǎo)型菌株就不能合成。將它們轉(zhuǎn)接入含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中時，變異株能迅速利用誘導(dǎo)底物進行生長繁殖，而誘導(dǎo)型出發(fā)菌株需經(jīng)歷一個誘導(dǎo)合成酶的階段，兩類菌株的生長就不同步，組成酶變異株所占的比例將逐漸增大。3)誘導(dǎo)抑制劑法：有些化合物能阻止某些誘導(dǎo)酶的合成，當(dāng)在誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)抑制劑同時存在的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)待分離菌群時，誘導(dǎo)型菌株不能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，無法正常生長，只有組成型變異株能夠利用底物進行生長繁殖。