醫(yī)學分子生物學原理：第7章 第1節(jié) 重組DNA技術(shù)

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1、基因操作基因操作第七章第七章Gene ManipulatingGene Manipulating2022年年2月月11日日21時時59分分12022年年2月月11日日21時時59分分2 20世紀世紀70年代以來，生物技術(shù)年代以來，生物技術(shù)(biotechnology)的出現(xiàn)和發(fā)展為醫(yī)學研究領域帶來了巨大變化。的出現(xiàn)和發(fā)展為醫(yī)學研究領域帶來了巨大變化。 基因工程基因工程( (genetic engineering) )是生物技術(shù)最是生物技術(shù)最主 要 的 研 究 內(nèi) 容 之 一 ， 又 稱 為主 要 的 研 究 內(nèi) 容 之 一 ， 又 稱 為 D N A 重 組 技 術(shù)重 組 技 術(shù)( (reco

2、mbinant DNA technique) )或分子克隆或分子克隆( (molecular cloning) )。 它涉及到特定基因（被稱為目的基因或外源它涉及到特定基因（被稱為目的基因或外源DNA片段）的制備、分離、鑒定、改造及其在不同生物間片段）的制備、分離、鑒定、改造及其在不同生物間的轉(zhuǎn)移等多項技術(shù)。的轉(zhuǎn)移等多項技術(shù)。2022年年2月月11日日21時時59分分3第七章第七章 基因操作基因操作 第一節(jié)第一節(jié) 基因工程基本技術(shù)基因工程基本技術(shù) 第第二二節(jié)節(jié) 聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應 第第三三節(jié)節(jié) DNA序列分析序列分析 第第四四節(jié)節(jié) 分子雜交和印跡技術(shù)分子雜交和印跡技術(shù) 第第五五節(jié)節(jié) 基因

3、組文庫和基因組文庫和cDNA文庫文庫 第第六六節(jié)節(jié) 基因重組動物模型基因重組動物模型 第第七七節(jié)節(jié) 基因操作在醫(yī)學發(fā)展中的意義基因操作在醫(yī)學發(fā)展中的意義第一節(jié)第一節(jié) Genetic Engineering Technology 2022年年2月月11日日21時時59分分42022年年2月月11日日21時時59分分5 DNA重組技術(shù)之所以能夠付諸實現(xiàn)，主要得益重組技術(shù)之所以能夠付諸實現(xiàn)，主要得益于于DNA限制性內(nèi)切酶（限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease）和和DNA連接酶（連接酶（DNA ligase）的發(fā)現(xiàn)。的發(fā)現(xiàn)。u 1972 1972年，美國斯坦福大學年，美國斯坦

4、福大學Paul BergPaul Berg等在實驗室制等在實驗室制造出了第一個人工重組造出了第一個人工重組DNADNA：首先用首先用限制酶限制酶EcoRI從從SV40切下一段切下一段DNA，同時，同時 將將噬菌體噬菌體DNA進行切割；將其導入細菌體內(nèi)。進行切割；將其導入細菌體內(nèi)。然后用然后用DNA末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在DNA片段的末端分別加片段的末端分別加 上同聚上同聚A或同聚或同聚T尾；尾；最后在體外用最后在體外用連接酶將連接酶將SV40DNA與與噬菌體噬菌體DNA 連接后將其導入細菌體內(nèi)。連接后將其導入細菌體內(nèi)。2022年年2月月11日日21時時59分分6u此后的另外三項起到了決定性的作

5、用工作：此后的另外三項起到了決定性的作用工作： （1）Janet Mertz和和Ronald Davis在同一年發(fā)現(xiàn)在同一年發(fā)現(xiàn)EcoRI酶切后的酶切后的DNA片段留下的是一種片段留下的是一種粘性末端粘性末端； （2）Herbert Boyer和和Stanley Cohen等式分別于等式分別于1973年和年和1974年利用質(zhì)粒作為載體年利用質(zhì)粒作為載體，導入細菌后載體，導入細菌后載體可以自我復制擴增，而且質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性基可以自我復制擴增，而且質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性基因可以用于篩選；因可以用于篩選； （3）1974年，年，Boyer和和Cohen又證明了，外源基因又證明了，外源基因用質(zhì)粒

6、導入細菌后不僅可以在其中復制，而且可以用質(zhì)粒導入細菌后不僅可以在其中復制，而且可以在在其中轉(zhuǎn)錄為其中轉(zhuǎn)錄為RNA。2022年年2月月11日日21時時59分分7u推動基因工程技術(shù)快速發(fā)展的主要因素：推動基因工程技術(shù)快速發(fā)展的主要因素：（1）更多的限制性內(nèi)切酶的純化、鑒定及商品化，）更多的限制性內(nèi)切酶的純化、鑒定及商品化，使獲得適合克隆的使獲得適合克隆的DNA片段變得極為容易；片段變得極為容易；（2）DNA瓊脂糖電泳分析技術(shù)的建立使得人們可以瓊脂糖電泳分析技術(shù)的建立使得人們可以較為容易地分離純化所需要的較為容易地分離純化所需要的DNA片段；片段；（3）核酸分子雜交和）核酸分子雜交和DNA序列分析技

7、術(shù)的發(fā)展，發(fā)序列分析技術(shù)的發(fā)展，發(fā)推動了重組推動了重組DNA的鑒定；的鑒定；（4）大量高效率的克隆和表達載體的構(gòu)建和商品化，）大量高效率的克隆和表達載體的構(gòu)建和商品化，尤其是用于構(gòu)建尤其是用于構(gòu)建cDNA或基因組文庫載體的發(fā)展；或基因組文庫載體的發(fā)展；（5）成功地將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎⒃谄渲校┏晒Φ貙⑼庠椿驅(qū)氩溉閯游锛毎⒃谄渲斜磉_等等。表達等等。 獲取這類相同的獲取這類相同的DNADNA分子群體、分子群體、細胞群體或個體群體的過程，即無性繁殖。細胞群體或個體群體的過程，即無性繁殖。又稱嵌合又稱嵌合DNADNA（chimera DNAchimera DNA），采用克隆技術(shù)把來自不同生

8、物的），采用克隆技術(shù)把來自不同生物的外源外源 DNADNA插入載體分子所形成的雜合插入載體分子所形成的雜合DNADNA分子。分子。2022年年2月月11日日21時時59分分8指從指從來自同一始祖的一群相同分子、來自同一始祖的一群相同分子、細菌、細胞或動物（常被稱為副本或拷貝）。細菌、細胞或動物（常被稱為副本或拷貝）。2022年年2月月11日日21時時59分分9思考題思考題 1 12022年年2月月11日日21時時59分分102022年年2月月11日日21時時59分分11 在克隆載體的基礎上，增添了與宿主細胞相適在克隆載體的基礎上，增添了與宿主細胞相適應的應的強啟動子等式強啟動子等式元件，元件，

9、復制起始點復制起始點oriCoriC，2022年年2月月11日日21時時59分分12復制起始點，復制起始點，2022年年2月月11日日21時時59分分13最常用的對目的基因克??；最常用的對目的基因克隆；用于克隆大片段用于克隆大片段DNADNA用于用于SangerSanger雙脫氧雙脫氧DNADNA測序測序構(gòu)建基因組構(gòu)建基因組DNADNA或或cDNAcDNA文庫文庫包括人或哺乳動物病毒、昆蟲及植物病包括人或哺乳動物病毒、昆蟲及植物病 毒用于在真核細胞中表達目的蛋白毒用于在真核細胞中表達目的蛋白用于更大用于更大DNADNA片段的克隆片段的克隆2022年年2月月11日日21時時59分分14細菌培養(yǎng)細

10、菌培養(yǎng)染色質(zhì)染色質(zhì)質(zhì)粒質(zhì)粒 嚴緊型質(zhì)粒（嚴緊型質(zhì)粒（stringent plaxmidstringent plaxmid） 松弛型松弛型質(zhì)粒（質(zhì)粒（relaxed plaxmidrelaxed plaxmid）AmprORITetr兩個抗性基因，用兩個抗性基因，用于篩選陽性克隆。于篩選陽性克隆。兩個酶切位點，用兩個酶切位點，用于插入目的基因于插入目的基因復制起始點，保證復制起始點，保證高拷貝自我復制高拷貝自我復制。2022年年2月月11日日21時時59分分16TetTet平板平板123456789101112123456789101112Amp2022年年2月月11日日21時時59分分17Ba

11、mH I酶切插入目的基因，酶切插入目的基因，2022年年2月月11日日21時時59分分18AmpTetOripUC192686 bpAmprP(BLA)PlacAva I (413)BamHI (418)Eco RI (397)Hin dIII (448)Pst I (440)Sma I (415)Xma I (413)Apa LI (178)Apa LI (1121)Apa LI (2367)MCS提供多個單酶提供多個單酶切位點用于克切位點用于克隆操作隆操作Lac Z藍白斑篩選陽藍白斑篩選陽性克隆性克隆2022年年2月月11日日21時時59分分192022年年2月月11日日21時時59分分2

12、02022年年2月月11日日21時時59分分21藍色菌落：陰性克隆藍色菌落：陰性克隆; 白色菌落：陽性克隆白色菌落：陽性克隆 2022年年2月月11日日21時時59分分22能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體 由由pUCpUC系列質(zhì)粒載體派生而來，帶有來自噬菌體系列質(zhì)粒載體派生而來，帶有來自噬菌體T7T7、SP6SP6的啟動子的啟動子，為，為RNARNA聚合酶的附著提供了特異聚合酶的附著提供了特異性識別位點。如性識別位點。如pGEM-3Z/4Z.pGEM-3Z/4Z.穿梭質(zhì)粒載體（穿梭質(zhì)粒載體（shuttle plasmid vectorshuttle plasmid

13、vector） 是一類人工構(gòu)建的，具有是一類人工構(gòu)建的，具有兩種不同復制起始點兩種不同復制起始點和選擇標記，可在兩種不同的宿主細胞中存活和復和選擇標記，可在兩種不同的宿主細胞中存活和復制的質(zhì)粒載體。制的質(zhì)粒載體。2022年年2月月11日日21時時59分分23 許多耐熱的許多耐熱的DNADNA聚合酶聚合酶( (如如等等) )擴增時，擴增時，都在都在PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物3-3-末端加上了末端加上了A A堿基堿基。335PCR產(chǎn)物產(chǎn)物AA5Taq酶酶T載體載體TT55332022年年2月月11日日21時時59分分24在連接酶的作用下可直接將在連接酶的作用下可直接將PCRPCR產(chǎn)物克隆到產(chǎn)物克隆到TA

14、TA載體中。載體中。 野生野生噬菌體的基因組為噬菌體的基因組為線狀雙鏈線狀雙鏈 DNADNA，兩端兩端為為12bp12bp彼此完全互補，稱之為彼此完全互補，稱之為 的的；進入宿主細胞后形成壞狀雙鏈結(jié)構(gòu)，；進入宿主細胞后形成壞狀雙鏈結(jié)構(gòu)，按按方式及滾環(huán)方式進行復制。方式及滾環(huán)方式進行復制。 感染細菌后，可進入感染細菌后，可進入及溶及溶。 2022年年2月月11日日21時時59分分25 可容納可容納7 kb7 kb以下以下的外源片段。的外源片段。在阻遏劑在阻遏劑CICI基因和基因和lacZlacZ基因上，基因上，有供外源有供外源基因片段插入的單一內(nèi)切酶位點?；蚱尾迦氲膯我粌?nèi)切酶位點。 可容納可

15、容納9 923kb23kb的外源片段。具有兩個或兩組內(nèi)的外源片段。具有兩個或兩組內(nèi)切酶位點，經(jīng)酶切除去基因組中噬菌體正常生長非切酶位點，經(jīng)酶切除去基因組中噬菌體正常生長非必需的序列，由外源基因片段取代。必需的序列，由外源基因片段取代。2022年年2月月11日日21時時59分分26 分子小，分子小，； 含質(zhì)粒自主復制成分含質(zhì)粒自主復制成分ORIORI，和耐藥基因，和耐藥基因AmpAmpr r； 含帶有一個或多個單一酶切位點的多聚物接頭；含帶有一個或多個單一酶切位點的多聚物接頭； 含含 噬菌體噬菌體coscos黏性末端及與包裝有關的短序列；黏性末端及與包裝有關的短序列； 又稱又稱柯斯質(zhì)粒柯斯質(zhì)粒(

16、 (coscos site-carrying site-carrying plasmid, plasmid, cosmidcosmid),),是由是由 噬菌體的噬菌體的coscos黏性末黏性末端和細菌的質(zhì)粒構(gòu)建而成。端和細菌的質(zhì)粒構(gòu)建而成。 接上在真核細胞生活的元件，如接上在真核細胞生活的元件，如SV40SV40復制區(qū)及啟復制區(qū)及啟 動子，動子，2022年年2月月11日日21時時59分分292022年年2月月11日日21時時59分分30ORIORI基因組為閉環(huán)單鏈基因組為閉環(huán)單鏈DNADNA，感染雄性大，感染雄性大腸埃希菌后，在菌體內(nèi)復制成相當于質(zhì)粒的腸埃希菌后，在菌體內(nèi)復制成相當于質(zhì)粒的雙鏈

17、雙鏈DNADNA，可用作基因克隆，可用作基因克隆載體。載體。 M13mp M13mp系列系列( (攜帶有攜帶有 含含MCSMCS序列的序列的lacZlacZ基因基因),),外源外源DNADNA不宜大于不宜大于1500 1500 bpbp。是一類從是一類從pUCpUC載體派生載體派生而來的噬菌粒載體。而來的噬菌粒載體。 當當RFRF型型M13M13在細菌內(nèi)達到在細菌內(nèi)達到100100200200個拷貝后，個拷貝后，M13M13只合成單鏈只合成單鏈DNADNA，并包裝成噬菌體顆粒分泌到細胞外，并包裝成噬菌體顆粒分泌到細胞外?？捎糜诳捎糜贒NADNA測序、體外定點突變和核酸雜交。測序、體外定點突變和

18、核酸雜交。2022年年2月月11日日21時時59分分31 pBluescript SK（+/ -）噬菌粒載體的分子結(jié)構(gòu)示意圖。）噬菌粒載體的分子結(jié)構(gòu)示意圖。SK表示多克隆位點表示多克隆位點區(qū)的一種取向，即區(qū)的一種取向，即lacZ基因是按照基因是按照SacIKpnI的方向轉(zhuǎn)錄；（的方向轉(zhuǎn)錄；（+/ -）表示單）表示單鏈噬菌體鏈噬菌體f1復制起點的兩種相反的取向。復制起點的兩種相反的取向。 ，簡稱，簡稱YACYAC載體，由酵母染載體，由酵母染色體、酵母色體、酵母2 2mDNAmDNA質(zhì)粒的復制起始序列等元件衍生質(zhì)粒的復制起始序列等元件衍生而成；可插入而成；可插入100kb100kb2,000kb2

19、,000kb外源外源DNADNA片段，是人類片段，是人類基因組計劃中物理圖譜繪制采用的主要載體?；蚪M計劃中物理圖譜繪制采用的主要載體。 ，簡稱，簡稱BACBAC載體，以細菌載體，以細菌F F因因子為基礎構(gòu)建而成；可插入子為基礎構(gòu)建而成；可插入100kb100kb300kb300kb外源外源DNADNA片片段，是人類基因組計劃中序列分析采用的主要載體。段，是人類基因組計劃中序列分析采用的主要載體。2022年年2月月11日日21時時59分分332022年年2月月11日日21時時59分分34逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus, RV )(retrovirus, RV )慢病毒慢病毒( (l

20、entiviruslentivirus):):也屬于也屬于RVRV家族家族腺病毒腺病毒( (adenovirus,Adadenovirus,Ad) )腺相關病毒腺相關病毒( (adenoadeno-associated -associated virus,AAVvirus,AAV) )單純皰疹病毒單純皰疹病毒(herpes simplex (herpes simplex virus,HSVvirus,HSV) ) 埃埃- -巴二氏病毒巴二氏病毒 (Epstein-Barr (Epstein-Barr virus,EBVvirus,EBV) )痘苗病毒痘苗病毒( (vacciniavaccini

21、a virus) virus)2022年年2月月11日日21時時59分分35 是一類能識別雙鏈是一類能識別雙鏈DNADNA中的某些中的某些特定核苷酸序特定核苷酸序列列，并由此切割，并由此切割DNADNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶，又稱為雙鏈的核酸內(nèi)切酶，又稱為限限制酶制酶（restriction enzyme）。）。主要是從原核生物中主要是從原核生物中分離純化而來。分離純化而來。與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源制外源DNADNA，保護自身，保護自身DNADNA。2022年年2月月11日日21時時59分分36第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫斜體

22、；第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫斜體；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫斜體；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫斜體；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。H Hinind d 屬屬 種種 株株 序序Haemophilus Haemophilus ininfluenzae fluenzae d d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌 d d株的第三種酶株的第三種酶2022年年2月月11日日21時時59分分37和和型限制酶通常是相對型限制酶通常是相對分子量較大的多亞分子量較大的多亞基基蛋白質(zhì)復合物，蛋白質(zhì)復合物，同時具有內(nèi)切酶和

23、甲基化酶活性同時具有內(nèi)切酶和甲基化酶活性，反應過程中反應過程中需有需有MgMg2+2+和和ATPATP參與參與。、和和型（基因工程技術(shù)中常用型（基因工程技術(shù)中常用型）。型）。型限制酶通常以型限制酶通常以同源二聚體同源二聚體形式存在，形式存在，只具只具有核酸內(nèi)切酶活性有核酸內(nèi)切酶活性而無而無甲基化酶活性，反應過程中甲基化酶活性，反應過程中只需有只需有MgMg2+2+參與參與而不需而不需有有ATPATP參與參與。2022年年2月月11日日21時時59分分38 類酶識別序具有類酶識別序具有回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome)(palindrome)特點，特點， 即具有即具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)雙重旋

24、轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)的兩條的兩條DNADNA鏈的堿基序列的鏈的堿基序列的反向重復。反向重復。型型 大部分大部分型限制酶都能識別由型限制酶都能識別由4 48 8個核苷酸組個核苷酸組成的特定序列。成的特定序列。2022年年2月月11日日21時時59分分392022年年2月月11日日21時時59分分40圖圖20-3 20-3 限制酶限制酶EcoEcoRR對雙鏈對雙鏈DNADNA分子的切割作用分子的切割作用Bam Bam HHG G A T C CG G A T C CC C T A G GC C T A G GGTCGTCCAGCAGGACGACCTGCTG平端切口平端切口G GCCTAGCCTAGGATCC

25、GATCC G G粘端切口粘端切口HinHinddG T C G A CG T C G A CC A G C T GC A G C T G平或鈍末端（平或鈍末端（blunt end)blunt end)粘性末端（粘性末端（sticky end)sticky end)2022年年2月月11日日21時時59分分41GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst 來源不同但能識別相同序列的酶，又稱同功異來源不同但能識別相同序列的酶，又稱同功異源酶。源酶。2022年年2月月11日日21時時59分分42 GGATCC CCTAGG A

26、GATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 識別序列不完全相同，但切割識別序列不完全相同，但切割 DNADNA后，產(chǎn)生相同的黏后，產(chǎn)生相同的黏性末端，這類限制性內(nèi)切酶稱為同尾酶。這兩個相同的黏性末端，這類限制性內(nèi)切酶稱為同尾酶。這兩個相同的黏性末端稱為配伍未端性末端稱為配伍未端(compatible end)(compatible end)。2022年年2月月11日日21時時59分分43 識別識別DNADNA序列中的一個或幾個堿基是可變的，并且序列中的一個或幾個堿基是可變的，并且識別序列往往超過識別序列往往超過6 6個核苷酸。為個核苷酸。為型限制酶的特例。

27、型限制酶的特例。 Bstp GGTNACC CCANTGG2022年年2月月11日日21時時59分分44 Bbl CGGN(N)4CCG; GCC(N)4NGGC 重組重組DNADNA技術(shù)、基因組技術(shù)、基因組DNADNA物理圖譜繪制、基因組物理圖譜繪制、基因組DNADNA同源性研究、切割基因組同源性研究、切割基因組DNADNA或或cDNAcDNA構(gòu)建基因組文構(gòu)建基因組文庫或庫或cDNAcDNA文庫等。文庫等。 DNADNA純度、結(jié)構(gòu)及甲基度程度；酶切反應的溫度、純度、結(jié)構(gòu)及甲基度程度；酶切反應的溫度、時間及緩沖液體系等。時間及緩沖液體系等。2022年年2月月11日日21時時59分分45 只能封

28、閉只能封閉DNADNA鏈上的鏈上的缺口（缺口（nicknick）, ,而不能封閉而不能封閉裂口（裂口（gapgap）。）。 需要在一條需要在一條DNADNA鏈的鏈的3 3 末端具有游離的羥基、另末端具有游離的羥基、另一條一條DNADNA鏈的鏈的5 5 末端有磷酸基團，而且反應過程需要末端有磷酸基團，而且反應過程需要由由ATPATP提供能量。提供能量。2022年年2月月11日日21時時59分分46 連接的底物可以是兩個雙鏈連接的底物可以是兩個雙鏈DNADNA分子的互補分子的互補黏黏性末端性末端或平或平末端末端。最早是從。最早是從T4T4噬菌體感染的噬菌體感染的大腸埃大腸埃希菌分離，希菌分離，易制

29、備，應用廣。易制備，應用廣。 只能連接具有互補只能連接具有互補黏性末端黏性末端的兩個雙鏈的兩個雙鏈DNADNA分分子底物。需要子底物。需要NADNAD+ +作為輔助因子。作為輔助因子。2022年年2月月11日日21時時59分分47*G AATTC*CTTAA G*5353EcoR IDNA連接酶連接酶*G*C T T A A 5335OHPA A T T C* G*5335 P OH+2022年年2月月11日日21時時59分分48*AGCT*TCGA*5353Alu IT4 DNA連接酶連接酶OHP5335 *TC *AG5335 OHPCT*GA*+2022年年2月月11日日21時時59分分

30、492022年年2月月11日日21時時59分分502022年年2月月11日日21時時59分分51 能夠催化以能夠催化以DNADNA或或RNARNA為模板合成為模板合成DNADNA的反應，的反應，把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地添加到雙鏈把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地添加到雙鏈DNADNA分子或引分子或引物鏈的物鏈的3 3 -OH-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。末端，催化核苷酸的聚合作用。 具有具有 具有具有2022年年2月月11日日21時時59分分52依賴依賴RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。 具有具有活性活性對對MgMg2+2+濃度非常敏感。濃度非常敏感。 是第一個被發(fā)現(xiàn)的、耐熱的、依賴是第一個被

31、發(fā)現(xiàn)的、耐熱的、依賴DNADNA的的DNADNA聚聚合酶，合酶， 普遍使用的是來源于普遍使用的是來源于AMV(鳥類成髓細胞白血鳥類成髓細胞白血病病毒病病毒)及及M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒莫洛尼鼠白血病病毒)的反轉(zhuǎn)錄的反轉(zhuǎn)錄酶，酶，具有具有2022年年2月月11日日21時時59分分53 （terminal terminal deoxynucleotidyldeoxynucleotidyl transferasetransferase） (1) (1) 底物是底物是或有或有。5533OHMg2+dNTPnppi5533( (A/G/C/T)n)n2022年年2月月11日日21時時59分分54(

32、2) (2) 底物是底物是或或的雙鏈的雙鏈DNADNA。Co2+dNTPnppi53OH53(A/G/C/T)nCo2+dNTPnppi53OH53(A/G/C/T)n （1 1）主要作用是在載體或目的基因）主要作用是在載體或目的基因 33末端加上末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNADNA重組。重組。 （2 2）DNA 3DNA 3末端的同位素標記。末端的同位素標記。2022年年2月月11日日21時時59分分55 （alkaline phosphatasealkaline phosphatase） 能特異地切除能特異地切除DNADNA、RNAR

33、NA和和dNTPdNTP上上5-5-磷酸基團磷酸基團。 （polynuleotide kinasepolynuleotide kinase） 又稱又稱T4T4多核苷酸激酶，能催化多核苷酸激酶，能催化ATPATP的的- -磷酸基磷酸基團轉(zhuǎn)移到團轉(zhuǎn)移到DNADNA或或RNARNA片段的片段的5-OH5-OH末端末端。2022年年2月月11日日21時時59分分56重組重組DNADNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶 要求已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的要求已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。氨基酸序列。 要求已知目的基因的全序列或基因片段兩側(cè)要求已知目的基因的全序列或基因片段兩側(cè)的的

34、DNADNA序列。序列。 要求建有或購有要求建有或購有g(shù) gDNADNA文庫或文庫或cDNAcDNA文庫。文庫。2022年年2月月11日日21時時59分分58思考題思考題 2 2* 已知氨基酸序列推測可能的已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。序列。2022年年2月月11日日21時時59分分59* 避免使用稀缺密碼子，及宿主細胞的密碼偏好。避免使用稀缺密碼子，及宿主細胞的密碼偏好。反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄AAnATTnT 55mRNA反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核糖核酸酶核酸酶HTTnT3cDNA核酸酶核酸酶S1雙鏈雙鏈cDNA35 35 5加熱變性加熱變性加入加入特異性引物特異性

35、引物DNA聚合酶聚合酶重復上述步驟重復上述步驟擴增出大量的產(chǎn)物擴增出大量的產(chǎn)物聚聚合合酶酶鏈鏈式式反反應應退火退火延伸延伸mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA cDNA分子分子 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復制復制(1) cDNA文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建2022年年2月月11日日21時時59分分61限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應連接反應 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 7 Kb DNA 片段片段 cos

36、 LR cos7 Kb 外源外源 cDNA 片段片段 cDNA文庫文庫c DNA 片段片段 2022年年2月月11日日21時時59分分622022年年2月月11日日21時時59分分63限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應連接反應 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 gDNA

37、文庫文庫2022年年2月月11日日21時時59分分64gDNA文庫：文庫：g-文庫文庫cDNA文庫：文庫：c-文庫文庫方法：方法： 用 目 的 基 因用 目 的 基 因上的一段上的一段DNADNA做成做成探針與文庫中的探針與文庫中的DNADNA作核酸雜交，作核酸雜交，從 基 因 文 庫 中從 基 因 文 庫 中“釣出釣出”有目的有目的基因的克隆?；虻目寺?。(3)從基因文庫中篩選目的基因從基因文庫中篩選目的基因2022年年2月月11日日21時時59分分65Screening a genomic library by colony hybridization. 在分別獲得了目的基因在分別獲得了目

38、的基因DNA片段及純化的質(zhì)粒片段及純化的質(zhì)粒閉環(huán)載體后，還要利用凝膠電泳分別將目的片段和閉環(huán)載體后，還要利用凝膠電泳分別將目的片段和載體片段分離純化后才相互連接為重組體。載體片段分離純化后才相互連接為重組體。 目的基因和載體的限制酶切設計和應用目的基因和載體的限制酶切設計和應用目的基因和線狀載體目的基因和線狀載體DNA片段分離和回收片段分離和回收目的基因與載體的連接目的基因與載體的連接Bam H切割反應切割反應 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶，連接酶，15C目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCG

39、GATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG目的基因自連目的基因自連載體自連載體自連GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點切割位點GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位點切割位點AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAG

40、AATTCGGATCTAT4 DNA連接酶，連接酶，15C重組體重組體2022年年2月月11日日21時時59分分69目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連連接酶，接酶，15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連2022年年2月月11日日21時時59分分70Eco RCCGAATTCG GGCTTAAGC5 -3 -Eco R由平端加由平端加上新的酶切位上新的酶切位點，再用限制點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進性末端，而進行粘端連接行粘端連接。 2022年年2月月11日日21時時59分分715 3 3 5 載體載體D

41、NA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機械剪切限制酶或機械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 T(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nT重組體重組體3 A(A)nA A(A)nA3 5 5 2022年年2月月11日日21時時59分分72PCR擴增擴增+335PCR產(chǎn)物產(chǎn)物AA5T載體載體TT5533藍白篩選藍白篩選Taq酶酶2022年年2月月11日日21時時59分分73 處于感受態(tài)處于感受態(tài) 對載體無嚴格限制對載體無嚴格限制 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷 不對外源不對外源DNADNA進行修飾進行修飾 能表達重組體所

42、提供表型特征能表達重組體所提供表型特征 將體外構(gòu)建的重組將體外構(gòu)建的重組DNADNA分子導入用于復制、分子導入用于復制、擴增和表達的擴增和表達的原核或真核受體細胞原核或真核受體細胞。2022年年2月月11日日21時時59分分74 指將質(zhì)粒指將質(zhì)粒DNADNA或以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組或以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNADNA導入導入細菌（原核細胞）的過程。如大腸桿菌細菌（原核細胞）的過程。如大腸桿菌K12K12突變株低突變株低滲滲CaClCaCl2 2,0,0處理進入感受態(tài)。處理進入感受態(tài)。 指將噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的重組指將噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的重組DNA DNA 分子導入真核細

43、胞的過程。分子導入真核細胞的過程。 指以人工改造的噬菌體或病毒為載體構(gòu)建的重組指以人工改造的噬菌體或病毒為載體構(gòu)建的重組DNADNA，經(jīng)體外包裝成具有感染性的噬菌體或病毒顆粒經(jīng)體外包裝成具有感染性的噬菌體或病毒顆粒后，通過感染宿主細胞而借助外殼蛋白將重組后，通過感染宿主細胞而借助外殼蛋白將重組DNADNA注注入到細菌或真核細胞內(nèi)復制擴增的過程。入到細菌或真核細胞內(nèi)復制擴增的過程。2022年年2月月11日日21時時59分分751.1.磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染2.DEAE-2.DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染2022年年2月月11日日21時時59分分76非轉(zhuǎn)化子非轉(zhuǎn)化子( (不能

44、生長）不能生長）自身環(huán)化載體自身環(huán)化載體未酶解完全載體未酶解完全載體非目的基因插入載體非目的基因插入載體2022年年2月月11日日21時時59分分772022年年2月月11日日21時時59分分78A typical bacterial transformation experiment.用用Pst I酶切酶切DNA連接酶連接酶重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒目的基因目的基因AmprTetrPst I 目的基因與目的基因與 pBR322經(jīng)經(jīng)PstI酶切后進行重組如何酶切后進行重組如何篩選得到陽性克??？篩選得到陽性克??？課堂討論課堂討論2022年年2月月11日日21時時59分分80ApmrMCSLacZ2022年

45、年2月月11日日21時時59分分812022年年2月月11日日21時時59分分82組氨酸缺陷型組氨酸缺陷型大腸桿菌大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基無組氨酸的培養(yǎng)基咪唑甘油磷咪唑甘油磷酸脫水酶酸脫水酶促進組氨酸合成促進組氨酸合成 DNADNA重組體重組體標志補救標志補救2022年年2月月11日日21時時59分分83 用插入點的限制酶用插入點的限制酶酶酶切切重組重組DNADNA，行瓊脂糖凝膠，行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是不有目的基因和載體的泳帶來判斷電泳，根據(jù)是不有目的基因和載體的泳帶來判斷重重組成功與組成功與否。否。 是從基因文庫中挑選含有目的基因的陽性克隆是從基因文庫中挑選含有目的基因的陽性克隆的常用方法

46、。的常用方法。 根據(jù)根據(jù)MCSMCS兩側(cè)的保守序列設計引物，對提取的重兩側(cè)的保守序列設計引物，對提取的重組載體進行組載體進行PCRPCR擴增鑒定，并可直接進行測序。擴增鑒定，并可直接進行測序。2022年年2月月11日日21時時59分分84 利用特異性抗體與目的基因表達的蛋白質(zhì)相互利用特異性抗體與目的基因表達的蛋白質(zhì)相互結(jié)合結(jié)合通過放射免疫、化學發(fā)光通過放射免疫、化學發(fā)光來篩選轉(zhuǎn)化菌。來篩選轉(zhuǎn)化菌。思考題思考題 3 3質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）gDNA文庫文庫 cDNA化學合成化學合成RT-PCR限制酶消化限制酶消化連接酶連接酶轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染體

47、外包裝，轉(zhuǎn)染篩選篩選2022年年2月月11日日21時時59分分85 包括包括表達載體表達載體的構(gòu)建、的構(gòu)建、受體細受體細胞胞的建立和的建立和表達產(chǎn)物的分離、純化等技術(shù)表達產(chǎn)物的分離、純化等技術(shù)和策略。和策略。 涉及目的基因的克隆、復制、轉(zhuǎn)涉及目的基因的克隆、復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的加工及分離純化等過程，錄、翻譯、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的加工及分離純化等過程，需要在適合的需要在適合的表達系統(tǒng)表達系統(tǒng)中完成。中完成。 表達系統(tǒng)可根據(jù)受體細胞的不同分為表達系統(tǒng)可根據(jù)受體細胞的不同分為和和。2022年年2月月11日日21時時59分分86產(chǎn)產(chǎn) 品品功功 能能組織胞漿素原激活劑組織胞漿素原激活劑抗凝抗凝血液因子

48、血液因子VIII促進凝血促進凝血顆粒細胞顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成剌激白細胞生成促紅細胞生成素促紅細胞生成素剌激白細胞生成剌激白細胞生成生長因子生長因子(bFGF, EGF)刺激細胞生長與分化刺激細胞生長與分化生長素生長素治療侏儒癥治療侏儒癥胰島素胰島素治療糖尿病治療糖尿病干擾素干擾素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些腫瘤抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素白細胞介素激活、剌激各類白細胞激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗組織損傷抗組織損傷單克隆抗體單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進行診斷試驗、利用其結(jié)合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療腫瘤導

49、向治療乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)預防乙肝預防乙肝口服重組口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂預防霍亂 重組重組DNADNA醫(yī)藥產(chǎn)品醫(yī)藥產(chǎn)品優(yōu)點優(yōu)點: :2022年年2月月11日日21時時59分分88 培養(yǎng)方法簡單、培養(yǎng)方法簡單、迅速、經(jīng)濟而又適迅速、經(jīng)濟而又適合大規(guī)模生產(chǎn)。合大規(guī)模生產(chǎn)。 2022年年2月月11日日21時時59分分89缺點缺點: : 外源真核基因不能帶有外源真核基因不能帶有5 5 端非編碼區(qū)和內(nèi)含子結(jié)端非編碼區(qū)和內(nèi)含子結(jié) 構(gòu)構(gòu)，必須用，必須用cDNAcDNA或化學合成基因或化學合成基因； 外源基因必須置于原核細胞的外源基因必須置于原核細胞的強啟動子

50、強啟動子和和SDSD序列序列 等元件控制下；等元件控制下； 重組載體必須形成重組載體必須形成； 外源基因轉(zhuǎn)錄生成的外源基因轉(zhuǎn)錄生成的mRNAmRNA必須相對穩(wěn)定并能被有必須相對穩(wěn)定并能被有 效翻譯效翻譯，所表達的，所表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物穩(wěn)定不能對宿主菌蛋白質(zhì)產(chǎn)物穩(wěn)定不能對宿主菌 有毒害作用有毒害作用。2022年年2月月11日日21時時59分分902022年年2月月11日日21時時59分分91外源目的基因不與其他基因融合，外源目的基因不與其他基因融合， 直接從起始密碼直接從起始密碼AUG開始在原核調(diào)控元件控制下開始在原核調(diào)控元件控制下 表達蛋白質(zhì)。表達蛋白質(zhì)。2022年年2月月11日日21時時59分

51、分922022年年2月月11日日21時時59分分93 可表達克隆的可表達克隆的cDNAcDNA或真核基因組或真核基因組DNADNA； 可進行糖基化、磷酸化、乙酰化等修飾，可進行糖基化、磷酸化、乙?；刃揎?， 使表達蛋白形成正確的天然構(gòu)象；使表達蛋白形成正確的天然構(gòu)象； 某些真核細胞可將外源基因表達產(chǎn)物直接某些真核細胞可將外源基因表達產(chǎn)物直接 分泌至細胞培養(yǎng)基中。分泌至細胞培養(yǎng)基中。 操作技術(shù)難、費時、費錢。操作技術(shù)難、費時、費錢。2022年年2月月11日日21時時59分分94 大多是穿梭載體大多是穿梭載體2022年年2月月11日日21時時59分分95思考題思考題 4 4 病毒感染（天然方法病毒

52、感染（天然方法 ） 載體轉(zhuǎn)染載體轉(zhuǎn)染 （化學或物理方法（化學或物理方法 ） 新霉素抗性選擇系統(tǒng)新霉素抗性選擇系統(tǒng) 胸苷激酶基因胸苷激酶基因HATHAT選擇系統(tǒng)選擇系統(tǒng) 二氫葉酸還原酶基因選擇系統(tǒng)二氫葉酸還原酶基因選擇系統(tǒng) 2022年年2月月11日日21時時59分分96 常用的瞬時表達宿主是來源于非洲綠猴腎常用的瞬時表達宿主是來源于非洲綠猴腎CV-1CV-1細胞的細胞的COSCOS細胞。細胞。 常用的穩(wěn)定表達宿主細胞是來源于中國倉鼠卵常用的穩(wěn)定表達宿主細胞是來源于中國倉鼠卵巢的巢的CHOCHO細胞。細胞。2022年年2月月11日日21時時59分分972022年年2月月11日日21時時59分分98

53、采用克隆技術(shù)把來自不采用克隆技術(shù)把來自不同生物的外源同生物的外源 DNADNA插入載體所形成的雜合插入載體所形成的雜合DNADNA分子。分子。指從指從來自同一始祖的一群相同分子、來自同一始祖的一群相同分子、細菌、細胞或動物（常被稱為副本或拷貝）。細菌、細胞或動物（常被稱為副本或拷貝）。指將噬菌體、病毒或以它們?yōu)橹笇⑹删w、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的重組載體構(gòu)建的重組DNA DNA 分子導入真核細胞的過程。分子導入真核細胞的過程。2022年年2月月11日日21時時59分分99 1. 1.簡述簡述DNADNA重組技術(shù)的基本步驟。重組技術(shù)的基本步驟。(ppt8)(ppt8)思考題：思考題： 2. 2.簡述獲取目的基因的簡述獲取目的基因的3 3種主要途徑。種主要途徑。(ppt57)(ppt57) 3. 3.簡述采用限制性內(nèi)切酶酶切后電泳以鑒定重簡述采用限制性內(nèi)切酶酶切后電泳以鑒定重組組DNADNA的方法。的方法。(ppt83)(ppt83) 4. 4.真核表達載體除了含有原核克隆載體的復制真核表達載體除了含有原核克隆載體的復制子、抗性篩選基因和子、抗性篩選基因和MCSMCS等序列外，還含有真核細等序列外，還含有真核細胞的哪些組件？胞的哪些組件？ (ppt94)(ppt94)