發(fā)酵工程 復(fù)習(xí)整理資料

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1、第一章 緒論 生物技術(shù)：有時(shí)也稱生物工程，是指以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的。 現(xiàn)代生物技術(shù)包括：基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)工程、生化工程。 “發(fā)酵”定義 1.無(wú)氧條件下，底物脫氫后產(chǎn)生的還原力[H]未經(jīng)呼吸鏈傳遞而直接交給某一內(nèi)源性中間代謝產(chǎn)物，以實(shí)現(xiàn)底物水平磷酸化的一類低效產(chǎn)能生物氧化反應(yīng)稱為發(fā)酵。 （如酒精發(fā)酵） （微生物生理學(xué)上的定義、狹義、無(wú)氧） 2.利用微生物的新陳代謝作用，把底物（有機(jī)物）轉(zhuǎn)化成中間產(chǎn)物，從而獲得某種工業(yè)產(chǎn)品。（工

2、業(yè)上定義、廣義、有氧無(wú)氧均可） 乙醇發(fā)酵（酵母菌） 原料：糯米等淀粉原料 菌種：酵母 該乙醇發(fā)酵過(guò)程在pH3.5~4.5以及厭氧的條件下發(fā)生。 發(fā)酵工程是研究利用微生物發(fā)酵作用為工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)的一門(mén)工程技術(shù)學(xué)科。 發(fā)酵工程： 上游工程1.菌種選育2.培養(yǎng)基設(shè)計(jì)3.滅菌4.接種 發(fā)酵過(guò)程控制 溫度、pH、溶解氧、泡沫等 下游工程1.產(chǎn)物提取、純化、分析2.廢棄物處理 發(fā)酵流程 課程學(xué)習(xí)任務(wù) 原料到產(chǎn)品整個(gè)過(guò)程。 發(fā)酵和提純，發(fā)酵為主。 (1)發(fā)酵部分:菌種、培養(yǎng)基、發(fā)酵機(jī)制、發(fā)酵工藝過(guò)程控制、發(fā)酵染菌的防治 (2)提純部分：下游技術(shù) 學(xué)會(huì)比

3、擬放大（或稱模型放大）的原理 普遍 小型實(shí)驗(yàn)－中間規(guī)模試驗(yàn)(中試)－大型規(guī)模生產(chǎn)(工業(yè)化生產(chǎn)) 發(fā)酵工程 斜面菌種－搖瓶試驗(yàn)(培養(yǎng)基、 溫度、 起始pH值、 需氧量、 發(fā)酵時(shí)間)－小型發(fā)酵罐－中試－大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn) l 懂得分析和解決微生物工業(yè)生產(chǎn)中的具體問(wèn)題，進(jìn)一步提高發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)率。 l 初步具備選育優(yōu)良菌種，合理控制發(fā)酵條件和調(diào)節(jié)代謝途徑的能力。 l 使生產(chǎn)過(guò)程連續(xù)化、自動(dòng)化，探求新工藝、新設(shè)備和從事微生物工程研究和設(shè)計(jì)的能力。 發(fā)酵工業(yè)發(fā)展史 1、自然發(fā)酵時(shí)期 2、純培養(yǎng)技術(shù)建立 (第一個(gè)轉(zhuǎn)折期) 列文.虎克 巴斯德 科赫 布赫納兄弟 3

4、、通氣攪拌的好氣性發(fā)酵工程技術(shù)建立(第二個(gè)轉(zhuǎn)折期) 弗萊明 4、人工誘變育種與代謝控制發(fā)酵工程技術(shù)建立 (第三個(gè)轉(zhuǎn)折期) 5、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、連續(xù)化、自動(dòng)化工程技術(shù)的建立(第四個(gè)轉(zhuǎn)折期) 6、生物合成和化學(xué)合成相結(jié)合工程技術(shù)建立(第五個(gè)轉(zhuǎn)折期) 化學(xué)工程與發(fā)酵工程 o 本質(zhì)區(qū)別 化學(xué)工程利用非生物催化劑;發(fā)酵工程利用生物催化劑—酶 o 利用微生物進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì) 體積小、面積大，吸收多、轉(zhuǎn)化快，生長(zhǎng)旺、 繁殖快，適應(yīng)強(qiáng)、易變異，分布廣、種類多 o 微生物工程的難題 (1)發(fā)酵部分:發(fā)酵醪(發(fā)酵醅、發(fā)酵液)不服從牛頓力學(xué)規(guī)律 (2)提純部分:需采取一些特殊的工藝措

5、施并選用合適的設(shè)備 發(fā)酵工業(yè)發(fā)展趨勢(shì) 1、幾個(gè)轉(zhuǎn)變 l 分解代謝→合成代謝 l 自然發(fā)酵→人工控制的突變型發(fā)酵→代謝控制發(fā)酵→通過(guò)遺傳因子的人工支配建立的發(fā)酵（如工程菌） 2、化學(xué)合成與生物合成相結(jié)合 3、大型、連續(xù)化、自動(dòng)化發(fā)酵 發(fā)酵罐的容量可達(dá)500t，常用的也達(dá)20-30t。 4、人工誘變育種和代謝控制發(fā)酵 微生物潛力進(jìn)一步挖掘，新菌株、新產(chǎn)品層出不窮。 5、原料范圍不斷擴(kuò)大 石油、植物淀粉、天然氣、空氣、纖維素、木質(zhì)素等 發(fā)酵工業(yè)范圍 2 釀酒工業(yè)（啤酒、葡萄酒、白酒） 食品工業(yè)（醬、醬油、食醋、腐乳、面包、酸乳） 2

6、 有機(jī)溶劑發(fā)酵工業(yè)（酒精、丙酮、丁醇） 抗生素發(fā)酵工業(yè)（青霉素、鏈霉素、土霉素等） 2 有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)（檸檬酸、葡萄糖酸等） 酶制劑發(fā)酵工業(yè)（淀粉酶、蛋白酶等） 2 氨基酸發(fā)酵工業(yè)（谷氨酸、賴氨酸等） 核苷酸類物質(zhì)發(fā)酵工業(yè)（肌苷酸、肌苷等） 2 維生素發(fā)酵工業(yè)（維生素B12、維生素B2等）生理活性物質(zhì)發(fā)酵工業(yè)（激素、赤霉素等） 2 名貴醫(yī)藥產(chǎn)品發(fā)酵工業(yè)（干擾素、白介素等）微生物菌體蛋白發(fā)酵工業(yè)（酵母、單細(xì)胞蛋白） 2 微生物環(huán)境凈化工業(yè)（利用微生物處理廢水等） 2 生物能源工業(yè)（沼氣、纖維素等天然原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精、乙烯等能源物質(zhì)） 2 微生物治金工業(yè)（微生物

7、探礦、治金、石油脫硫等） 第二章 發(fā)酵基礎(chǔ)知識(shí) 發(fā)酵產(chǎn)品類型 微生物菌體 1. 單細(xì)胞蛋白 （飼料添加劑、食品） 生產(chǎn)用原料：糖蜜、紙漿廢液、谷氨酸發(fā)酵廢液、稻草、稻殼、玉米芯、木屑等的水解液；天然氣、乙醇、乙烷等；乳制品和啤酒生產(chǎn)的廢棄物。 發(fā)酵方法：深層通氣發(fā)酵和固體通風(fēng)發(fā)酵。 主要用途：?jiǎn)渭?xì)胞食品；食品添加劑、飼料添加劑；提取核苷酸、輔酶A、乳糖酶等醫(yī)藥及生物試劑 主要菌種：產(chǎn)朊假絲酵母、解脂假絲酵母、嗜石油假絲酵母等 2.食（藥）用菌 （蘑菇、香菇、靈芝、猴頭等） 3.微生物農(nóng)藥（細(xì)菌、真菌、病毒：蘇云金桿菌、白僵菌） 4.疫苗（細(xì)菌、病毒） 第

8、一代：病原微生物及其產(chǎn)物 第二代：基因工程疫苗 第三代：人工合成疫苗 5.微生態(tài)制劑（細(xì)菌：乳酸菌、雙歧桿菌） 代謝產(chǎn)物 （分為初級(jí)代謝產(chǎn)物、次級(jí)代謝產(chǎn)物，這是一類當(dāng)前最主要的微生物發(fā)酵產(chǎn)品，也是開(kāi)發(fā)潛力最大的一類）；酒精、醬油、食醋、酸奶、谷氨酸、檸檬酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素、抗生素、毒素、激素、色素等 酶 酶制劑工業(yè)是利用微生物發(fā)酵，獲得與生物體內(nèi)的酶具有相同功能的酶制劑。 近幾年，酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用研究已普遍引起各國(guó)的重視，已在食品、發(fā)酵、紡織、醫(yī)藥、造紙、皮革、化工、石油、畜牧飼料等部門(mén)得到應(yīng)用。我國(guó)主要應(yīng)用在食品方面，其中產(chǎn)量較大的是α-淀粉酶、糖化酶、葡萄

9、糖異構(gòu)酶、蛋白酶和脂肪酶。 發(fā)酵菌種 微生物菌體 1.單細(xì)胞蛋白：酵母、霉菌、細(xì)菌、藻類 2.食（藥）用菌：大型真菌 3.微生物農(nóng)藥：細(xì)菌、真菌、病毒 4.疫苗：細(xì)菌、病毒 5.微生態(tài)制劑：細(xì)菌 代謝產(chǎn)物 1、酒精飲料 啤酒：啤酒酵母 葡萄酒：酵母菌 黃酒：霉菌（根霉、曲霉）、酵母菌、細(xì)菌 白酒：同黃酒 2、調(diào)味品 豆腐乳：霉菌（根霉、毛霉、曲霉） 醬油：米曲霉、酵母菌屬、片球菌屬 食醋：霉菌、酵母菌、醋酸菌 味精（谷氨酸鈉）：谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌 檸檬酸：黑曲霉 火

10、腿：曲霉、青霉 酸泡菜：腸膜狀明串球菌、植物乳桿菌 3、發(fā)酵乳制品 酸奶：乳酸菌（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸鏈球菌） 干酪：乳酸菌、青霉、丙酸菌等 4、抗生素：放線菌、霉菌、細(xì)菌 5、面包：啤酒酵母 酶 主要是霉菌，其次是酵母菌和細(xì)菌 發(fā)酵三要素 原料 傳統(tǒng)工藝：原料選擇菌種（為什么？） 發(fā)酵原料是一種選擇培養(yǎng)基。 傳統(tǒng)工藝就是利用這種選擇作用，把自然界帶入的各種野生菌，在發(fā)酵基質(zhì)上進(jìn)行選擇富集培養(yǎng)，這些微生物生長(zhǎng)和代謝的結(jié)果可生產(chǎn)出有特殊風(fēng)味的食品。 菌種 現(xiàn)代工藝：菌種選擇原料（為什么？） 在使用純種發(fā)酵劑前，我們必須對(duì)原料進(jìn)行滅

11、菌，以防止其他雜菌對(duì)發(fā)酵的干擾。 工藝條件 以適合菌種生長(zhǎng)、繁殖與合成所需產(chǎn)物為依據(jù)，選擇合適的溫度、pH值、溶解氧、泡沫、氧化還原電位等。 根據(jù)涉及到的微生物種類 1、單菌發(fā)酵 現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中最常見(jiàn)，傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中很難實(shí)現(xiàn)。 2、混合菌發(fā)酵 自然發(fā)酵 人工接種發(fā)酵 根據(jù)基質(zhì)物理狀態(tài) 1、液態(tài)發(fā)酵 發(fā)酵基質(zhì)呈流動(dòng)狀態(tài)，如啤酒發(fā)酵、檸檬酸發(fā)酵等。 2、半固態(tài)發(fā)酵 發(fā)酵基質(zhì)呈半流動(dòng)狀態(tài)，如黃酒發(fā)酵、傳統(tǒng)稀醪醬油發(fā)酵等。 3、固態(tài)發(fā)酵 發(fā)酵基質(zhì)呈不流動(dòng)狀態(tài)。如固態(tài)醬油發(fā)酵、米醋發(fā)酵、大曲酒（白

12、酒）發(fā)酵等。 發(fā)酵工藝流程 菌種篩選 菌種純化 搖瓶試驗(yàn) 小型發(fā)酵罐試驗(yàn) 種子罐擴(kuò)大培養(yǎng) 發(fā)酵罐工廠化生產(chǎn) 發(fā)酵產(chǎn)物形成過(guò)程 （第一階段） （第二階段） （第三階段） （原料預(yù)處理）（主發(fā)酵） （主、后發(fā)酵） （后發(fā)酵） 發(fā)酵產(chǎn)品的附加值 一、發(fā)酵有利于食品保藏 食品發(fā)酵后，改變了食品的滲透壓、酸度、水的活性等，從而抑制了腐敗微生物的生長(zhǎng)，有利于食品保藏。 二、發(fā)酵產(chǎn)品的保健作用 有些食品經(jīng)過(guò)微生物

13、發(fā)酵后，不僅能產(chǎn)生酸類和醇類等，還能產(chǎn)生某些抗菌素可抑制致病菌和腸內(nèi)腐敗菌。有些發(fā)酵食品還具有預(yù)防心腦血管疾病、整腸、改善便秘、降低膽固醇、增加免疫功能和抗癌等功能。 三、發(fā)酵增加了食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值 發(fā)酵食品一般比未經(jīng)發(fā)酵的原食品更富營(yíng)養(yǎng)。一方面，發(fā)酵通過(guò)微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解作用，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。另一方面，食品經(jīng)過(guò)發(fā)酵后可以提高某些營(yíng)養(yǎng)組分如蛋白質(zhì)的含量，并提高其吸收率，甚至通過(guò)微生物的發(fā)酵作用，還可以產(chǎn)生一些維生素。 第三章 微生物工業(yè)菌種的選育與擴(kuò)大培養(yǎng) 微生物工業(yè)發(fā)酵的基本過(guò)程 發(fā)酵原料（玉米、米、薯干、植物、木材、石油等） 菌種

14、 ↓ ↓ 預(yù)處理（初選、除雜、粉碎、水解等加工） 選育 ↓ ↓ 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制（添加水、無(wú)機(jī)鹽及其他營(yíng)養(yǎng)物，調(diào)節(jié)碳氮比、pH值等） 活化（斜面） ↓ ↓ 滅菌 擴(kuò)大培養(yǎng)（搖瓶或 ↓ ↓ 茄子瓶） 接種

15、 發(fā) ↓ ↓ 酵 進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng) →→→→→大型發(fā)酵（測(cè)量和控制發(fā)酵溫度、pH值、 （種子罐） ↓ 溶解氧等） 產(chǎn)物與細(xì)胞的分離（過(guò)濾、離心、沉淀等） ↓ 產(chǎn)物的精制（離子交換、層析、結(jié)晶、干燥等） 提

16、 ↓ 純 產(chǎn)品 菌種發(fā)展總趨勢(shì)，如何理解 發(fā)酵菌 氧化菌 野生菌 變異菌 自然選育 代謝控制育種 誘變育種 基因重組定向育種 選擇原則 生長(zhǎng)能力強(qiáng)、對(duì)原料要求低、原料轉(zhuǎn)化率高； 選擇抗噬菌體能力強(qiáng)的菌株； 菌種純，不易變異退化； 菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害物質(zhì)； 發(fā)酵副產(chǎn)物少，產(chǎn)

17、物容易分離； 選擇單產(chǎn)高的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株、調(diào)節(jié)突變株或野生菌株 生產(chǎn)蘇氨酸菌株轉(zhuǎn)變成生產(chǎn)賴氨酸：高絲氨酸缺陷型 高絲氨酸缺陷型菌株由于缺乏高絲氨酸脫氫酶，不能合成蘇氨酸，從而走另一代謝途徑，使賴氨酸大量積累。 四大類微生物:細(xì)菌、酵母菌、霉菌和放線菌都可以用來(lái)生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品。(見(jiàn)P7-8表1-1) 工業(yè)菌種選育 l 菌種來(lái)源 根據(jù)資料直接向有關(guān)科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門(mén)索取或購(gòu)買(mǎi)；通過(guò)菌種選育獲得新的微生物菌種。 l 菌種選育定義 按照生產(chǎn)要求，根據(jù)微生物遺傳變異理論，利用自然菌種篩選、人工誘變育種、代謝控制育種或基因重組定向育種等方

18、法得到優(yōu)良菌種的工作。 l 目的 理論上:人為地使某種產(chǎn)物過(guò)量積累，把生物合成的代謝途徑朝著人們所希望的方向引導(dǎo)，或者促使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生基因重組優(yōu)化遺傳性狀，實(shí)現(xiàn)人為控制微生物。 工業(yè)上:提高產(chǎn)量、改進(jìn)質(zhì)量、降低成本、改革工藝、方便管理及綜合利用而改善菌種的特性。 4、方法 (1)自然選育 定義從自然界土壤、水、空氣、動(dòng)物、植物、礦物等樣品中分離篩選得到菌種的方法。 圖 紙片培養(yǎng)顯色法 飽浸含某種指示劑的濾紙片變色圈（如淀粉降解菌篩選） 變色圈法 指示劑直接摻入或噴灑固體培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液（如淀粉降解菌篩選）

19、透明圈法 固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營(yíng)養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)基背景。菌落利用此物質(zhì)形成透明圈(如磷細(xì)菌篩選） 生長(zhǎng)圈法 利用一些有特別營(yíng)養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，如待篩選菌具有該營(yíng)養(yǎng)物的前體轉(zhuǎn)化成營(yíng)養(yǎng)物能力，工具菌就能圍繞該菌生長(zhǎng)（如營(yíng)養(yǎng)缺陷型微生物為工具菌） 抑制圈法 待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生長(zhǎng)的物質(zhì)（如抗生素產(chǎn)生菌篩選） (2)生產(chǎn)育種 長(zhǎng)期生產(chǎn)過(guò)程中自然突變獲得優(yōu)良菌株。 (3)抗噬菌體菌株的選育（如去除吸附位點(diǎn)） (4)誘變育種 采用物理、化學(xué)誘變因素處理微生物細(xì)胞，提高基因的

20、隨機(jī)突變幾率，然后通過(guò)定向篩選獲得所需優(yōu)良菌株。 圖 (5) 代謝控制育種 通過(guò)改變微生物菌種的代謝途徑或代謝自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)（如增加特定基因拷貝數(shù)來(lái)提高限速酶含量）而使微生物發(fā)生異常代謝，使所需中間代謝產(chǎn)物過(guò)量積累。 6) 基因重組定向育種 通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、雜交和原生質(zhì)體融合等遺傳學(xué)方法和技術(shù)定向地重組微生物DNA，使微生物的功能發(fā)生定向的改變。 基因重組定向育種先進(jìn)技術(shù)能取代傳統(tǒng)育種方法嗎？ 先進(jìn)育種技術(shù)需在優(yōu)良原始菌種基礎(chǔ)上應(yīng)用才有效。 基因重組

21、產(chǎn)品主要還是一些較短的多肽和小分子蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)類以外的很多發(fā)酵產(chǎn)物（如糖類、有機(jī)酸及次級(jí)代謝產(chǎn)物等）產(chǎn)生往往受到多個(gè)基因的控制，尤其是還有許多發(fā)酵產(chǎn)物的代謝途徑還沒(méi)有被確證。 菌種衰退的概念 指菌種整體在多次接種傳代過(guò)程中逐漸造成生產(chǎn)能力降低，表現(xiàn)為發(fā)酵力（如對(duì)培養(yǎng)基的利用）或繁殖力（如孢子的產(chǎn)生）下降或發(fā)酵產(chǎn)物得率降低的現(xiàn)象。 菌種衰退的常見(jiàn)現(xiàn)象 1.菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變 2.生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少 3.抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等 4.代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降 菌種衰退產(chǎn)生的原因 1.保藏不恰當(dāng) 2.傳代次數(shù)過(guò)多 3.發(fā)生回復(fù)

22、突變 4.培養(yǎng)條件不適合 防止菌種衰退的方法 1.作好菌種保藏工作 2.盡可能使每次培養(yǎng)條件適合而一致 3.盡量減少傳代次數(shù) 4.應(yīng)使用幼齡菌培養(yǎng) 菌種的復(fù)壯概念 狹義：在菌種已衰退情況下，通過(guò)純種分離和生產(chǎn)性能測(cè)定等方法，從衰退群體中找出少數(shù)未衰退的個(gè)體，以恢復(fù)原有典型性狀的措施。 廣義：在菌種未衰退前經(jīng)常有意識(shí)地進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性狀測(cè)定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正變個(gè)體。 衰退菌種復(fù)壯的方法 l 單細(xì)胞菌株分離法 l 沸水篩選法 菌液用沸水處理后進(jìn)行單細(xì)胞菌株分離，從而挑選出優(yōu)良菌體。 l 改變培養(yǎng)條件法 采用有利于高產(chǎn)菌株而

23、不利于低產(chǎn)菌株的條件來(lái)選出高產(chǎn)菌株。 l 通過(guò)宿主體復(fù)壯 如Bacillus thuringiensis的復(fù)壯 l 誘變處理法 對(duì)發(fā)生回復(fù)突變進(jìn)行重新誘變育種。 工業(yè)菌種的保藏 1.原理 根據(jù)菌種的生理、生化特點(diǎn)，人為地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動(dòng)處于不活潑狀態(tài)(最好是休眠狀態(tài))。 2.原則 挑選優(yōu)良純種，最好是休眠體（如孢子、芽孢等），創(chuàng)造一個(gè)最有利于休眠的環(huán)境條件（如低溫、干燥、缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等），就可以達(dá)到菌種保藏的目的。同時(shí)，作為可行的方法，還要考慮方法的經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)便。 3.方法 u 斜面低溫保藏法 菌種在斜面

24、培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生長(zhǎng)旺盛后存放在4-8℃的冰箱中，一般半年要移植一次。適合保藏實(shí)驗(yàn)室常用菌種。 u 低溫冰箱保藏法 菌種經(jīng)液體培養(yǎng)后，加入無(wú)菌甘油，使甘油含量為30-40%，置于-80℃低溫冰箱中保存，保存期為1-10年。適用于保存各類微生物菌體。 u 石蠟油封保藏法 醫(yī)用石蠟油滅菌冷卻后加在斜面菌種上,超過(guò)斜面頂部1cm，在室溫下或冰箱里可保存1-10年。幾乎所有微生物都適用。 u 砂土保藏法 將干的孢子、芽孢與徹底滅菌的砂土混合后裝入砂土管，放入裝有吸濕劑的干燥器或大試管中，加橡皮塞用蠟封嚴(yán)，置陰涼干燥處或冰箱中可保藏1-10年。適合于孢子、芽孢等的保存。 u

25、 硅膠保藏法 以純凈硅膠代替砂土,其他與砂土保藏法一樣。 u 冷凍干燥保藏法 瓶中加入菌體或孢子懸液，-40℃低溫冰箱冷凍1h，室溫真空干燥固封，可保存10-數(shù)10年。適用于保存各類微生物菌體。保存運(yùn)輸方便。 u 液氮超低溫保藏法 菌種密封于安踣瓶中, 慢速凍結(jié)器中以每分鐘下降1℃的速度下降到-35℃，再迅速降溫至-196℃，并在該溫度下的液氮超低溫罐中保存，保存期為3-9年。適用于保存各類微生物菌體。 微生物工業(yè)種子擴(kuò)大培養(yǎng) 目的與任務(wù) 獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠、純而壯的培養(yǎng)物。 種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)

26、的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。 工藝 斜面 搖瓶 種子罐 發(fā)酵罐 級(jí)數(shù)的確定 斜面菌種→一級(jí)種子搖瓶培養(yǎng)→二級(jí)種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐 （二級(jí)） 斜面菌種→一級(jí)種子搖瓶培養(yǎng)→二級(jí)種子罐培養(yǎng)→三級(jí)種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐 （三級(jí)）盡量采用二級(jí)發(fā)酵 培養(yǎng)類型 1、靜置培養(yǎng)法（嫌氣性發(fā)酵）在發(fā)酵槽等裝置中不通空氣進(jìn)行發(fā)酵。如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等的發(fā)酵。 2、通氣培養(yǎng)法 （1）液體培養(yǎng)法 （2）固體培養(yǎng)法 谷氨酸生產(chǎn)的種子制備 斜面菌種 一級(jí)種子（搖瓶）

27、 二級(jí)種子(種子罐) 發(fā)酵 1、斜面菌種 培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化鈉 0.5，瓊脂 2%， pH 7.0-7.2 培養(yǎng)條件：32℃，18-24h 培養(yǎng)基特點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)豐富，原料比較精細(xì)。 菌種要求： 生長(zhǎng)良好，連續(xù)傳代不超過(guò)3次。 ？ 2. 一級(jí)種子（搖瓶） 培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿 2.5%，K2HPO4 0.1% 培養(yǎng)條件：1000ml三角瓶裝液200ml,32℃培養(yǎng)12h。 培養(yǎng)基特點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)較豐富，原料比斜面培養(yǎng)基粗放。 ？ 3.二級(jí)種子(種子罐) 培養(yǎng)基：和一級(jí)種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5% 培養(yǎng)條件：種子罐（容

28、積為發(fā)酵罐的1%），32℃，7-10h 培養(yǎng)基的特點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)較豐富，原料更粗放，接近發(fā)酵培養(yǎng)基 種子的質(zhì)量要求： 1.無(wú)雜菌 2.108-109個(gè)/ml 3.大小均勻，呈單個(gè)或八字排列 4.PH 7.0-7.2時(shí)結(jié)束 5.活力旺盛 第四章 發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì) 培養(yǎng)基種類 按成分不同劃分 (一) 天然培養(yǎng)基 由天然物質(zhì)配制、成分不清楚、不穩(wěn)定 麥芽汁培養(yǎng)基 (二) 半組合培養(yǎng)基 主要由天然物質(zhì)組成，加有某些化學(xué)試劑，最常用 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA） (三) 組合培養(yǎng)基 由化學(xué)試劑配制、成

29、分精確、穩(wěn)定 高氏1號(hào)、查氏培養(yǎng)基 按物理狀態(tài)不同劃分 a) 固體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基加入1.5-2.0%瓊脂，成為固體狀態(tài)(或大米、麩皮等組成） 常用來(lái)進(jìn)行菌種分離、鑒定、保藏和活菌計(jì)數(shù)等 b) 半固體培養(yǎng)基 瓊脂含量一般為0.5% 觀察微生物運(yùn)動(dòng)、菌種保藏，厭氧菌培養(yǎng)、分離、計(jì)數(shù) c) 液體培養(yǎng)基 不加任何凝固劑 大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)、實(shí)驗(yàn)室微生物基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究 d) 脫水培養(yǎng)基 含有除水外一切成分的干燥培養(yǎng)基 按功能不同劃分 A) 選擇培養(yǎng)基 加入特殊營(yíng)養(yǎng)物，有利于所需微生物

30、生長(zhǎng)或抑制不需要微生物的培養(yǎng)基 加富性、抑制性選擇培養(yǎng)基 用來(lái)將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái) 1.在缺乏氮源的培養(yǎng)基上大部分微生物無(wú)法生長(zhǎng)；2.在培養(yǎng)基中加入青霉素可以抑制細(xì)菌和放線菌 3.在培養(yǎng)基中加入10％酚可以抑制細(xì)菌和霉菌。 B) 鑒別培養(yǎng)基 加有能與目的菌無(wú)色代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，只需用肉眼辨別顏色就能從近似菌落中找出目的菌 伊紅美蘭乳糖培養(yǎng)基（EMB） 按培養(yǎng)目的不同劃分 1. 種子培養(yǎng)基 為種子擴(kuò)大培養(yǎng)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)較豐富，氮源比例較高。與發(fā)酵培養(yǎng)基接近。 2. 孢子培養(yǎng)基 用于孢子萌發(fā)，營(yíng)養(yǎng)充足，容易吸收利用，抑制

31、因子在許可范圍內(nèi)（如辛酸） 3. 發(fā)酵培養(yǎng)基 用于發(fā)酵工業(yè)，碳源含量較高。價(jià)廉易得，有利于下游的分離提取。 發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)目標(biāo) 營(yíng)養(yǎng)豐富而完備 PH適當(dāng)而穩(wěn)定 發(fā)酵單位高 成本、單耗低 周期短 產(chǎn)品質(zhì)量高 設(shè)計(jì)原則 明確目的 是實(shí)驗(yàn)室用還是工業(yè)大生產(chǎn)用，是種子擴(kuò)大培養(yǎng)還是生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物？要求獲得菌體還是積累代謝產(chǎn)物，是正常代謝產(chǎn)物還是異常代謝產(chǎn)物，是為異養(yǎng)菌設(shè)計(jì)的還是為自養(yǎng)菌設(shè)計(jì)的？ “投其所好” 用于培養(yǎng)菌體種子的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)應(yīng)豐富，氮源含量較高；用于生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)

32、基氮源一般應(yīng)比種子培養(yǎng)基低，若代謝產(chǎn)物是次級(jí)代謝產(chǎn)物，要考慮是否加入特殊物質(zhì)；工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，應(yīng)選擇來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉的原料。 設(shè)計(jì)基本步驟 調(diào)查研究 菌種來(lái)源、生理特性、生物合成途徑,產(chǎn)物化學(xué)性質(zhì)、提煉方法、質(zhì)量要求等，以便“投其所好”。 培養(yǎng)基成分的確定 C/N比、重要金屬非金屬等、復(fù)合培養(yǎng)試驗(yàn) 發(fā)酵條件的確定 溫度、起始pH值、溶解氧、氧化還原電位、滲透壓等 查閱文獻(xiàn)，借鑒經(jīng)驗(yàn)，借助單因子試驗(yàn)與復(fù)合因子試驗(yàn)（如正交試驗(yàn)法）等對(duì)培養(yǎng)基成分與發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。 補(bǔ)料 對(duì)碳及氮的代謝予以適當(dāng)控制，或添加各種養(yǎng)料和前體物質(zhì)

33、。 不斷完善 在生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中不斷調(diào)整改進(jìn)。 發(fā)酵原料轉(zhuǎn)換及意義 節(jié)約用糧或以其它原材料代替糧食是當(dāng)前微生物發(fā)酵工業(yè)值得研究的主要課題。 一方面可以從抓發(fā)酵的穩(wěn)定和高產(chǎn)來(lái)節(jié)糧。另一個(gè)不可忽視的方面是原料的轉(zhuǎn)換，開(kāi)拓新的原料資源和微生物資源：野生植物淀粉、野生植物纖維、木屑水解物、石油原料與產(chǎn)品（如石蠟、醋酸、乙醇等）、空氣原料（碳酸氣） 前體物質(zhì)是指在有些氨基酸、核苷酸、抗生素等發(fā)酵中添加一些特殊物質(zhì)能獲得較高的產(chǎn)率，它們?cè)诎l(fā)酵中主要起避免反饋抑制、作為產(chǎn)物的前身等作用的特殊物質(zhì)。 使用原則 加入應(yīng)適量；可采用間歇分批添加或連續(xù)滴加的方法加入

34、 P34 表2-15 促進(jìn)劑是指在氨基酸、抗生素和酶制劑發(fā)酵過(guò)程中，可以在發(fā)酵培養(yǎng)基中加進(jìn)某些對(duì)發(fā)酵起一定促進(jìn)作用的物質(zhì)。 酶制劑生產(chǎn) 加入某些誘導(dǎo)物、表面活性劑及其它一些產(chǎn)酶促進(jìn)劑，可以大大增加菌體的產(chǎn)酶量。 原理 啟動(dòng)微生物體內(nèi)的產(chǎn)酶機(jī)構(gòu)。 改進(jìn)了細(xì)胞的滲透性，同時(shí)增強(qiáng)了氧的傳遞速度，改善了菌體對(duì)氧的有效利用。 抗生素生產(chǎn)中加入促進(jìn)劑促進(jìn)抗生素生物合成 原理 Z 起生長(zhǎng)因素作用 ； 推遲菌體自溶 Z 抑制了某些合成其它產(chǎn)物途徑而使之向所需產(chǎn)物途徑轉(zhuǎn)化；降低了產(chǎn)生菌的呼吸 Z

35、改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，改善通氣效果 ； 與產(chǎn)物結(jié)合，防止反饋抑制 抗生素是一類由放線菌、細(xì)菌、霉菌等微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，其微量就可以抑制其他微生物（包括病原菌、病毒）的生長(zhǎng)、發(fā)育與代謝，有些能抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育。 抗生素的用途 E 治療人類各種病癥(如肺結(jié)核) ；用于飼料工業(yè)的添加劑(注意用量) E 食品工業(yè)的冷藏、冷凍的保存劑 ；防治農(nóng)作物病蟲(chóng)草 （農(nóng)用抗生素） 菌種 放線菌、細(xì)菌、霉菌 (以放線菌為主) 抗生素提純 菌絲趨于衰老，有自溶現(xiàn)象出現(xiàn)時(shí),需及時(shí)放罐提取。大多數(shù)抗生素是從濾液中提取的。 提取方法: 1. 吸附法

36、 利用活性炭、氧化鋁等吸附劑吸附發(fā)酵液中的抗生素，再以適宜的pH值和洗脫劑洗脫，以達(dá)到濃縮和提純目的。此法選擇性不高，獲得產(chǎn)品純度較低。 2. 溶媒萃取法 利用抗生素在不同的pH值下在水或有機(jī)溶劑中的溶解度不同，反復(fù)提取以達(dá)到濃縮和提純的目的。 3. 離子交換法 利用某些抗生素鹽類可解離為陽(yáng)離子和陰離子，經(jīng)離子交換樹(shù)脂達(dá)到提純和濃縮的目的。 此法的優(yōu)點(diǎn)是成本較低，產(chǎn)品純度較高，在生產(chǎn)上較為經(jīng)濟(jì)和安全。 4. 沉淀法 利用某些抗生素和酸堿或金屬鹽類，形成不溶性或溶解度極小的復(fù)鹽，使抗生素從發(fā)酵液中沉淀析出，然后進(jìn)一步精制 。 新抗生素生產(chǎn)工業(yè)化的途徑 1.抗

37、生素生產(chǎn)菌株的分離及篩選 大部分抗生素生產(chǎn)菌是從土壤中分離的，特別是富含有機(jī)氮的土壤，所以常用肥沃的菜園或森林等處的土壤作為分離抗生素生產(chǎn)菌的來(lái)源,進(jìn)行分離和篩選。 2.抗生性藥理試驗(yàn) 分離的某一菌株可 使 用檢定菌(如:病理性葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、真菌等)確證是否能生產(chǎn)抗生素物質(zhì)。常用方法有： （1）交叉劃線試驗(yàn)法 將被檢菌以帶狀涂抹在瓊脂平板(1條）上，置于27～30℃環(huán)境下培養(yǎng)3d后，以直角交叉狀劃線接種數(shù)種檢定菌測(cè)定阻止帶的長(zhǎng)度，可知道被檢菌對(duì)各種檢定菌的抗菌能力。 比較適用于不產(chǎn)生菌絲的被檢菌，如細(xì)菌。（為什么

38、？） （2）打點(diǎn)法 先將檢定菌涂布培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)钠桨迮囵B(yǎng)基上，使其長(zhǎng)滿這個(gè)平板，將被檢菌以打點(diǎn)的方式接種于檢定菌的平板上培養(yǎng)，以比較阻止圓的直徑大小可得知被檢菌對(duì)檢定菌的抗菌能力。 適用于被檢菌是任何菌種。 3.生成新抗生素的確證 生成的抗生素到底是新產(chǎn)品還是已知的，就需對(duì)其進(jìn)行一系列的試驗(yàn)，連續(xù)測(cè)定并記載此抗生素對(duì)各種檢定菌的生長(zhǎng)阻止情況，然后對(duì)照抗菌性帶表，即可確定該抗生素的種類或?yàn)樾缕贩N。 4.工業(yè)化階段 如果發(fā)現(xiàn)了新的抗生素，還應(yīng)該檢測(cè)它對(duì)動(dòng)物的毒性。如果得到了良好的臨床應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果，就可開(kāi)始探討工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵條件，順序?yàn)檎袷幣囵B(yǎng)

39、、小型發(fā)酵槽、試驗(yàn)工廠等。包括確立培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)條件的選擇和精制設(shè)計(jì)等等。同時(shí)在生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)不斷注意菌株的改良問(wèn)題。 第五章 發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 淀粉水解糖是指在工業(yè)生產(chǎn)上將淀粉水解為以葡萄糖為主的水解液的過(guò)程稱為淀粉水解糖的制備，制得的水解液。（淀粉 糊精 麥芽糖 葡萄糖） 在工業(yè)生產(chǎn)上將淀粉水解為葡萄糖的過(guò)程稱為淀粉的糖化。（廣義） 淀粉水解糖的制備方法與優(yōu)缺點(diǎn) 1、酸解法 又稱酸糖化法，它是以酸（無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解為葡萄糖的方法。 工藝流程：20%淀粉乳 →加酸 →水解 →中和→過(guò)濾→活性碳脫色→過(guò)濾→淀粉水解糖 優(yōu)點(diǎn)：

40、 缺點(diǎn) （1）水解時(shí)間短 （1）副反應(yīng)多，產(chǎn)物純度低 （2）所需設(shè)備少 （2）需耐腐蝕、高溫、高壓設(shè)備 增加了危險(xiǎn)性與污染 （3）生產(chǎn)能力大 （3）對(duì)淀粉原料要求高：顆粒小而均勻，淀粉乳濃度較低 原料較精細(xì) 2、酶解法（雙酶水解法） 酶解法是指用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖，可分兩步， 液化：利用a-淀粉酶將淀粉液化轉(zhuǎn)化為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加的過(guò)程； 糖化：利用糖化酶將糊精或低聚糖進(jìn)一步水解，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^(guò)程 （狹義） 優(yōu)點(diǎn)：

41、 缺點(diǎn) （1）副反應(yīng)少，產(chǎn)物純度高，質(zhì)量好且出糖率高 （1）水解時(shí)間長(zhǎng) （2）條件溫和，生產(chǎn)安全，污染少 （2）易造成過(guò)濾困難、泡沫多等問(wèn)題 （3）對(duì)淀粉原料要求較低；可用粗原料；淀粉乳濃度較高 3、酸酶結(jié)合法 集中酸法與酶法優(yōu)點(diǎn)、克服兩者缺點(diǎn)的方法，可分為： 酸酶法 酶酸法 適用于：顆粒堅(jiān)硬原料 顆粒不均勻、雜質(zhì)較多原料 不適用于： 正好相反 缺點(diǎn)：設(shè)備較多、工藝較復(fù)雜 制備方法選擇： l 從水解糖液的質(zhì)量和降

42、低糖耗、提高原料利用率來(lái)說(shuō)，選擇酶法； l 從水解速度來(lái)說(shuō)，選擇酸法 ； l 綜合考慮各方面因素，選擇酸酶結(jié)合法，尤其是酶酸法 。 糖蜜是甘蔗或甜菜制糖的副產(chǎn)物。發(fā)酵前對(duì)糖蜜進(jìn)行稀釋、酸化、滅菌及澄清等過(guò)程稱為糖蜜前處理。 種類：甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。主要區(qū)別： ①甜菜中蔗糖較多，而轉(zhuǎn)化糖含量極少，但總糖量接近。 ②甘蔗糖蜜呈微酸性，而甜菜糖蜜則呈微堿性。③甜菜糖蜜中總氮量較豐富。 糖蜜作為發(fā)酵原料的適用性： 含糖量很高；主要含非結(jié)晶糖，回收困難；含大量的可發(fā)酵性糖，無(wú)需糖化。 糖蜜前處理的方法 1、加酸通風(fēng)沉淀法 稀釋→酸化→ 通風(fēng)→澄

43、清 2、加熱加酸沉淀法 加熱稀釋→酸化→ 澄清→稀釋 3、添加絮凝劑澄清處理法 稀釋→酸化→加熱→加絮凝劑→澄清 谷氨酸發(fā)酵的糖蜜預(yù)處理 特殊性：生物素限量 原理： Z 產(chǎn)物谷氨酸積累到一定量會(huì)形成反饋抑制。需提高細(xì)胞膜的滲透性，使胞內(nèi)的產(chǎn)生的谷氨酸迅速滲漏出去。 Z 細(xì)胞膜由磷脂雙分子層和蛋白質(zhì)組成，磷脂雙分子層由脂肪酸、甘油、磷酸和側(cè)鏈組成。 Z 把生物素控制在亞適量，才能生產(chǎn)出大量的谷氨酸。因?yàn)樯锼厥侵舅嵘锖铣芍幸阴?CoA羧化酶的輔基。 谷氨酸發(fā)酵的糖蜜

44、預(yù)處理的方法和各自原理 1糖蜜預(yù)處理方法 除去過(guò)量生物素 ①活性炭處理法 稀釋，漂白粉，活性炭，過(guò)濾 原理：吸附 ②樹(shù)脂處理法 原理：吸附 ③亞硝酸處理法 原理：破壞生物素 2.添加化學(xué)藥劑處理法 原理：增加細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的滲透性 ①添加青霉素法 ②添加表面活性劑 ③添加抗氧劑法 3.追加糖蜜法 原理：當(dāng)谷氨酸酶系統(tǒng)成熟時(shí)過(guò)量生物素不影響發(fā)酵，可在此時(shí)添加未處理的糖蜜進(jìn)去繼續(xù)正常生產(chǎn)。 4.采

45、用營(yíng)養(yǎng)缺陷變異株 原理：誘變生物素缺陷型菌株為油酸缺陷型等，是生物素不再影響谷氨酸的積累 纖維素代糧發(fā)酵背景 隨著發(fā)酵工業(yè)的日益擴(kuò)大，原料短缺問(wèn)題越來(lái)越突出，迫切需要開(kāi)辟新的原料途徑。 纖維素是自然界最豐富的可再生資源，開(kāi)發(fā)纖維素代糧發(fā)酵具有非常廣闊的前景。 現(xiàn)狀： 纖維素的基本組成單位是葡萄糖，理論上來(lái)說(shuō)，它是代替糧食的理想發(fā)酵原料。 纖維素很難降解，特別是徹底降解成葡萄糖，所以降解成本較高。 纖維素降解目前主要方法： 蒸汽爆破，時(shí)間短，化學(xué)品用量少，能耗低 利用纖維素酶水解。 構(gòu)建基因工程菌，可直接利用纖維素進(jìn)行發(fā)酵。

46、 分解纖維素的微生物 好氧細(xì)菌——粘細(xì)菌、鐮狀纖維菌和纖維弧菌 厭氧細(xì)菌——產(chǎn)纖維二糖芽孢梭菌、無(wú)芽孢厭氧分解菌及嗜熱纖維芽孢梭菌。 放線菌——鏈霉菌屬。 真菌——青霉菌、曲霉、鐮刀霉、木霉及毛霉 第六章 糖嫌氣性發(fā)酵產(chǎn)物積累機(jī)制 發(fā)酵機(jī)制定義 指微生物通過(guò)其代謝活動(dòng)，利用基質(zhì)合成人們所需要的產(chǎn)物的內(nèi)在規(guī)律。 正常產(chǎn)物：合適環(huán)境條件，酒精、乳酸等 異常產(chǎn)物：代謝控制，檸檬酸、谷氨酸等 代謝控制發(fā)酵是指人為地改變微生物的代謝調(diào)控機(jī)制，使有用中間代謝產(chǎn)物過(guò)量積累的發(fā)酵。 1、生物合成途徑 2、代謝調(diào)節(jié)機(jī)制 環(huán)境因

47、素對(duì)代謝方向的影響 改變微生物代謝方向的措施 糖酵解途徑（EMP途徑）和巴斯德效應(yīng)的三個(gè)關(guān)鍵酶均是是己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶。 丙酮酸的去路 （P50 圖3-2） ① 乙醇發(fā)酵（酵母） ② 乳酸發(fā)酵（乳酸菌） ③丙酸發(fā)酵（丙酸菌） ④ 2,3—丁二醇發(fā)酵 （產(chǎn)氣桿菌） ⑤混合酸發(fā)酵（大腸桿菌） 糖酵解的調(diào)節(jié)機(jī)制 1.能荷調(diào)節(jié)（主要） ATP抑制磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性，使酵解減少，當(dāng)需能反應(yīng)加強(qiáng)，ATP分解為ADP和AMP，ADP、AMP增加、ATP的抑制作用被解除，同時(shí)ADP、AMP激活已糖激酶和磷酸果糖激酶，使6-磷酸葡萄糖、 1，

48、6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油醛等增加，激活丙酮酸激酶，加快酵解。 2.物質(zhì)調(diào)節(jié)（次要） 無(wú)機(jī)磷解除6-磷酸葡萄糖對(duì)己糖激酶的抑制作用。 檸檬酸抑制磷酸果糖激酶。 啤酒概述 酒精度 ：2%-5%，我國(guó)為0.5%-3.5%，目前趨勢(shì)是往淡爽型發(fā)展 優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特、含酒精低、容易吸收 啤酒種類 鮮啤酒：未經(jīng)巴氏滅菌或超濾即出售。新鮮、爽口，保質(zhì)期短。 生啤酒：未經(jīng)巴氏滅菌，但經(jīng)超濾等進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾后出售。新鮮、爽口，保質(zhì)期較短。 熟啤酒：經(jīng)巴氏滅菌后出售。苦味增加，有熟味，保質(zhì)期長(zhǎng)。 生產(chǎn)工藝 水， 酒之血：麥芽，酒之肉（骨）；酒花，酒之眼；菌

49、種，酒之魂。 1)原料 主要原料 水 大麥（麥芽）：以發(fā)芽力強(qiáng)，淀粉含量高，且蛋白質(zhì) 含量少為好。 大麥先發(fā)芽以合成各種酶（包括淀粉酶、麥芽糖酶、蛋白酶等），以供制備麥芽汁（糖化）的催化劑。 輔助原料 大米、玉米：以淀粉含量高的新鮮糯米為好。可提高出酒率，降低成本。 啤酒花：一種蔓藤性植物的未受精的雌花。啤酒花的作用： 1.酒花油與苦味酸賦予啤酒獨(dú)特的香味和爽口的苦味；2.酒花樹(shù)脂可提高啤酒泡沫持久性； 3.沉淀蛋白質(zhì)，有利于啤酒澄清；4.抑菌防腐。 α-淀粉酶：降低生產(chǎn)成本，提高出酒率，改善啤酒風(fēng)味和色澤。 2)菌種 啤酒酵母：將糖進(jìn)行酒精

50、發(fā)酵，生成二氧化碳和乙醇。 3)原理 大麥經(jīng)發(fā)芽得到麥芽。麥芽糖化所得糖在啤酒酵母作用下進(jìn)行酒精發(fā)酵生成二氧化碳和乙醇。 同時(shí)，麥芽在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了有機(jī)酸、高級(jí)醇和酯類，與啤酒花共同形成啤酒獨(dú)特的風(fēng)味。 工藝流程 圖 操作要點(diǎn)： （1）麥芽制備 浸漬：精選大麥浸水至水分達(dá)43-48%。 發(fā)芽：浸漬后的大麥移至發(fā)芽箱，先調(diào)節(jié)溫度為13-15℃，隨后每天約增加1℃，保持適量水分和氧氣。8d完成發(fā)芽，得到生麥芽稱綠麥芽，約含45%水分。 焙炒：為防止綠麥芽過(guò)分生長(zhǎng)，抑制麥粒中酶的作用以提高儲(chǔ)藏性，應(yīng)立即焙炒與干燥至含水量為3%。焙炒過(guò)程中，麥芽中

51、的糖及氨基酸反應(yīng)生成褐色色素，并除去生臭，使麥芽具有特有的香味和色澤，同時(shí)使根芽容易脫落。 干燥：僅進(jìn)行焙炒往往達(dá)不到含水量要求，所以還必須進(jìn)行干燥處理。為避免麥芽的萎縮硬化，初期低溫，隨后逐漸提高干燥溫度，最后80-85℃強(qiáng)熱3-5h，然后用除根機(jī)處理，除根是為了去除澀味。最后將成品麥芽?jī)?chǔ)藏與20℃以下。 （2）麥芽汁制備 糖化：將麥芽粉碎后與溫水混合，借助麥芽自身的各種水解酶，或適當(dāng)添加α-淀粉酶， 在65℃下將淀粉和蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)進(jìn)一步分解成可溶性低分子糖類、糊精、氨基酸、胨、肽等。 添加啤酒花、煮沸：糖化液經(jīng)過(guò)濾加入啤

52、酒花0.18-0.2%（淡色啤酒），煮沸1-2h。過(guò)濾除去酒花殘?jiān)?，冷卻后移入發(fā)酵罐。 加入酒花煮沸的作用：使麥汁濃縮到適合濃度； 溶出酒花有效成分，增加麥汁的香氣、苦味、防腐能力；使麥汁殘留的蛋白質(zhì)凝固除去，防止帶來(lái)渾濁，增進(jìn)啤酒的透明度和穩(wěn)定性；破壞全部酶，具殺菌作用。 （3）主發(fā)酵 低泡期：接種后15-20h，發(fā)酵罐四周出現(xiàn)白沫并向中間擴(kuò)展直至全液面。此期每天糖度下降1Bx，溫度上升0.9-1℃。 高泡期：發(fā)酵最旺盛期，泡沫特別豐盛，達(dá)20-30cm厚。降糖速度最快，可達(dá)每天1.5Bx。溫度上升很快，應(yīng)密切注意降溫。此階段可維持2-4d。 落泡期：溫度開(kāi)

53、始下降，降糖速度減慢，泡沫開(kāi)始收縮，形成褐色泡蓋。當(dāng)12度酒糖度降至3.8-4.8 Bx時(shí)，即可下酒進(jìn)入后酵。此階段維持約2-3d。 （4）后發(fā)酵 下酒：將經(jīng)主發(fā)酵的酒送入后酵罐（儲(chǔ)酒罐）稱為下酒。下酒前，先在儲(chǔ)酒罐里放滿無(wú)菌水，用二氧化碳將水壓出，充滿后，將酒液注入。要求盡可能一次灌成，流空隙10-15cm。 管理：下酒后先開(kāi)口發(fā)酵。以防二氧化碳過(guò)多，酒沫涌出，2-3d后封口。下酒初期室溫2.8-3.2℃，以后逐漸降到0-1℃。12 Bx酒儲(chǔ)酒時(shí)間為1-3個(gè)月。 （5）過(guò)濾 經(jīng)后發(fā)酵的啤酒，殘存酵母和蛋白質(zhì)等沉積于底部或懸浮于酒中，需經(jīng)過(guò)濾或分離。 常用分離方法有：濾棉法

54、，較古老，趨于淘汰；硅藻土法；離心分離法；板框過(guò)濾法；微孔薄膜過(guò)濾法。 ? 選擇方法的原則有產(chǎn)量大，質(zhì)量高，損失小，勞動(dòng)強(qiáng)度小，二氧化碳損失少，不易污染，不影響風(fēng)味，不吸氧等。 （6）包裝 將鮮啤酒經(jīng)超濾，則得生啤酒。 過(guò)濾后的啤酒，不經(jīng)滅菌處理而作為鮮酒出售，這就是通常所稱的鮮啤酒。 將鮮啤酒用巴氏滅菌法滅菌，即裝瓶后，在60℃下保持20min，可殺死酵母和其他非孢子細(xì)菌，即得熟啤酒，可作較長(zhǎng)時(shí)間的保存。 酒精發(fā)酵機(jī)制 乙醇生成途徑 見(jiàn)ZL1圖 巴斯德效應(yīng)概念 在好氣條件下，酵母發(fā)酵能力降低的規(guī)律稱

55、為巴斯德效應(yīng)。其現(xiàn)象是乙醇的積累減少，實(shí)質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)糖代謝降低。 巴斯德效應(yīng)機(jī)制 好氧，進(jìn)入TCA，產(chǎn)生的檸檬酸、ATP抑制磷酸果糖激酶。 6-磷酸果糖積累，進(jìn)而6-磷酸葡萄糖積累，抑制已糖激酶。 1，6-二磷酸果糖減少，對(duì)丙酮酸激酶激活作用減弱，磷酸烯醇式丙酮酸積累，抑制已糖激酶。 第七章 檸檬酸發(fā)酵機(jī)制 檸檬酸生產(chǎn)工藝 概述 檸檬酸是生物體主要代謝產(chǎn)物之一，在自然界分布很廣，主要存在檸檬、柑橘、鳳梨、無(wú)花果等果實(shí)中，尤其以未成熟者含酸量較多。檸檬酸具有令人愉快的爽口酸味，安全無(wú)毒，是發(fā)酵法生產(chǎn)的最重要有機(jī)酸。在水中的溶解度極高，能被生物體直接吸收代謝。 檸檬酸用途

56、 在食品工業(yè)上 用作清涼飲料、糖果業(yè)等的酸味料。 由于檸檬酸是水果的天然成分，不僅是良好的酸味劑，同時(shí)具有增溶、緩沖和抗氧化作用，使飲料中的其他成分交融協(xié)調(diào)，形成調(diào)和的口味和氣味。 也可用作油脂等的抗氧化劑。 在醫(yī)藥上 檸檬酸鈉用作輸血?jiǎng)瑱幟仕徼F銨用作補(bǔ)血?jiǎng)?。同時(shí)可用于血液和血漿的保存，以及制造人造血漿等。 因?yàn)闄幟仕峋哂锌鼓饔?，同時(shí)溶解度高，酸根能被直接吸收代謝而無(wú)積累。 在化學(xué)工業(yè)上 緩沖劑、催化劑、激活劑、增塑劑、鰲合劑、吸附劑、穩(wěn)定劑、消泡劑等 在日常生活中 保健飲品 原料與菌種： 1.糖質(zhì)原料（常用）：此類原料可以是淀粉質(zhì)

57、原料，如薯干，也可以是廢糖蜜。 菌種為黑曲霉。 2.石油原料：以石油中的十四碳到十八碳的直鏈烷烴混合物（即石蠟）為原料進(jìn)行發(fā)酵。菌種為解脂假絲酵母。 工藝流程注釋 調(diào)漿 加入適量水，使薯干粉濃度為10～16%，調(diào)成漿狀。 接種培養(yǎng) 將薯干粉漿移入發(fā)酵罐，接入適量經(jīng)培養(yǎng)的黑曲霉種子，在控制pH為2.0～2.5,溫度31℃左右下，培養(yǎng)發(fā)酵。 加熱,菌絲過(guò)濾 發(fā)酵液成熟后，將發(fā)酵液先加熱到100℃再用板框壓濾或真空抽濾進(jìn)行過(guò)濾。 發(fā)酵液加熱到100℃目的：加熱可促使蛋白質(zhì)凝固，加快過(guò)濾速度；可殺死微生物； 菌絲加熱后會(huì)膨脹破裂，可使檸檬酸釋放來(lái)，提

58、高收率 碳酸鈣中和 在發(fā)酵液中加入碳酸鈣，使檸檬酸轉(zhuǎn)化成難溶的檸檬酸鈣。 酸解 在得到的檸檬酸鈣中加入硫酸，用量一般為碳酸鈣的92～95%。酸解溫度為85℃，并過(guò)濾。 脫色 在85℃下，用活性炭或脫色樹(shù)脂柱除去色素。 樹(shù)脂法除金屬離子 采用離子交換樹(shù)脂，除去酸解液中混入的鈣、鐵等離子 濃縮與結(jié)晶 采用減壓濃縮，要求真空度600～740mmHg，溫度50～60℃下進(jìn)行濃縮與結(jié)晶。 干燥 采用沸騰干燥箱。干燥溫度控制在35℃以下，否則會(huì)失去一部分結(jié)晶水影響成品的色澤。 檸檬酸生物合成途徑 見(jiàn)ZL11圖 葡萄糖經(jīng)

59、過(guò)EMP途徑生成丙酮酸，一方面丙酮酸氧化脫羧生成乙酰-COA；另一方面丙酮酸羧化作用生成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰-COA在檸檬酸合成酶作用下縮合生成檸檬酸。 檸檬酸代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的幾個(gè)問(wèn)題 檸檬酸抑制磷酸果糖激酶，檸檬酸過(guò)量積累與EMP途徑的暢通存在尖銳的矛盾，這個(gè)矛盾如何解決？ 檸檬酸過(guò)量積累與EMP途徑暢通的矛盾如何解決？——1.錳離子缺乏抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NH4+濃度升高，解除了檸檬酸對(duì)磷酸果糖激酶的抑制。2.有氧時(shí)黑曲霉走不產(chǎn)ATP的側(cè)系呼吸鏈，解除了ATP對(duì)磷酸果糖激酶的抑制。 檸檬酸要過(guò)量積累，三羧酸循環(huán)的大部分必然被阻斷，那么草酰乙酸從何而來(lái)？ PYR（丙酮

60、酸）+CO2→→→→→→→草酰乙酸+ADP+Pi（Keq=0.818丙酮酸羧化酶 其中以第一個(gè)反應(yīng)為主? PEP （磷酸烯醇丙酮酸）+CO2→→→→草酰乙酸+ADP+ATP（Keq=0.049） 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸，有那些特有的優(yōu)勢(shì)？ 見(jiàn)書(shū)P59-63 檸檬酸為什么能過(guò)量積累？ o 錳離子缺乏，抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致NH4+濃度升高，有氧時(shí)黑曲霉走不產(chǎn)ATP的側(cè)系呼吸鏈，解除了對(duì)磷酸果糖激酶的抑制，促進(jìn)EMP途徑暢通。 o 丙酮酸羧化酶不被調(diào)節(jié)控制，源源不斷提供草酰乙酸。 o 丙酮酸氧化脫羧生成乙酰-CoA和兩個(gè)CO2固定反應(yīng)的平衡，及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，

61、增強(qiáng)了合成檸檬酸的能力。 o 順烏頭酸水合酶催化建立檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90：3：7的平衡，造成檸檬酸最初的積累。 o 檸檬酸的積累使pH值下降，抑制了異檸檬酸脫氫酶和順烏頭酸水合酶的活力，促進(jìn)了自身進(jìn)一步積累。 調(diào)節(jié)措施（總結(jié)）1、菌種 選育優(yōu)良菌株2、發(fā)酵條件 錳離子缺乏 有氧 控制Fe2+含量 pH值2.0-2.5左右 第八章 谷氨酸發(fā)酵機(jī)制 味精生產(chǎn)工藝概述：L-谷氨酸一鈉鹽，俗稱味精，學(xué)名α-氨基戊二酸一鈉，分子式NaC5H8O4NH2O。它有強(qiáng)烈的肉類鮮味，用水稀釋至3000倍，仍能感覺(jué)到鮮味。故廣泛用于食品菜肴，一般用量為0.2-0.5%的濃度。

62、 生理功能： 被消化吸收構(gòu)成人體組織中的蛋白質(zhì)，并參與體內(nèi)許多其它代謝過(guò)程?？膳c血氨結(jié)合生成谷氨酰胺，能解除組織代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氨的毒害作用，從而可以預(yù)防和治療肝昏迷等病癥?？梢种茀捠嘲Y、偏食癥。長(zhǎng)期食用，可提高神經(jīng)有缺陷兒童的智力。 生產(chǎn)工藝 1、原料 淀粉 大米 廢糖蜜 淀粉糖化液 2、菌種 谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌 現(xiàn)普遍使用T613，優(yōu)點(diǎn)為耐高溫、生長(zhǎng)快、產(chǎn)酸高。 3、工藝過(guò)程及原理 淀粉水解糖的制備 原理 將淀粉先用α-淀粉酶液化，后在高溫下加酸糖化得到葡萄糖。（酶酸法） 工藝流程 發(fā)酵 原理 使微生物在特定條件下改

63、變?cè)瓉?lái)的代謝途徑，從而積累大量中間代謝產(chǎn)物—谷氨酸。 工藝流程 （斜面） （搖瓶） （種子罐） （發(fā)酵罐） 谷氨酸提取 原理 等電點(diǎn)鋅鹽法 1.谷氨酸在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低。將發(fā)酵液pH調(diào)至等電點(diǎn)3.22，在冷凍條件下谷氨酸析出。 2.谷氨酸母液仍為谷氨酸飽和溶液，利用谷氨酸鋅難溶的性質(zhì)。采用冷凍pH6.3（谷氨酸鋅等電點(diǎn)）條件下，將谷氨酸鋅沉淀。 3.在酸性條件下，溶解谷氨酸鋅，再調(diào)pH至3.22，谷氨酸結(jié)晶析出。 工藝流程 粗谷氨酸制味精 原理 谷氨酸與碳酸鈉進(jìn)行中和制成谷氨

64、酸鈉，才具有強(qiáng)力鮮味。同時(shí)經(jīng)過(guò)一系列的精制過(guò)程，才得到符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的味精。 工藝流程 谷氨酸生物合成途徑 見(jiàn)ZL11圖 糖經(jīng)酵解途徑（EMP）和磷酸己糖途徑（HMP）生成丙酮酸。丙酮酸經(jīng)氧化脫羧生成乙酰-CoA，經(jīng)CO2固定生成草酰乙酸，兩者合成檸檬酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，由三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化下，還原氨基化合成谷氨酸。 谷氨酸代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的幾個(gè)問(wèn)題 谷氨酸合成有那些關(guān)鍵酶，這些酶對(duì)于谷氨酸合成的調(diào)節(jié)機(jī)制？ 1.EMP途徑與TCA循環(huán)中的一些關(guān)鍵酶。3個(gè) 己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶 2.在谷氨酸之前的酶活性需保

65、證。4個(gè) 檸檬酸合成酶 順烏頭酸水合酶 異檸檬酸脫氫酶 谷氨酸脫氫酶 3.在谷氨酸之后的酶活性需抑制。 2個(gè) 異檸檬酸裂解酶 α-酮戊二酸脫氫酶 谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶的反饋抑制如何消除？ NH4＋ 谷氨酸脫氫酶 葡萄糖→中間產(chǎn)物→a－酮戊二酸 谷氨酸 低濃度的谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶有顯著的激活作用，只有較高濃度谷氨酸才抑制其自身的生成。 只要將培養(yǎng)基的生物素控制在一定的濃度，保證細(xì)胞膜的通透性，使得生成的谷氨酸能夠及時(shí)地滲透出來(lái)，則谷氨酸就不會(huì)對(duì)谷氨酸脫氫酶形成反饋抑制。 讀表5-3，解釋之。 現(xiàn)象： （1）

66、生物素貧乏培養(yǎng)基中積累大量谷氨酸，生物素豐富培養(yǎng)基中幾乎不積累谷氨酸。 （2）生物素貧乏培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)谷氨酸含量較生物素豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的少，且較容易洗出。 機(jī)理： 生物素是脂肪酸生物合成中的輔酶，生物素缺乏時(shí)，不飽和脂肪酸合成受阻，造成磷脂含量不足，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整，提高了通透性，有利于谷氨酸分泌到培養(yǎng)基中，消除了谷氨酸對(duì)其自身合成的抑制，同時(shí)谷氨酸也較容易洗脫。 菌種選育模型與控制方法原理？ 1）生物素缺陷型2）油酸缺陷型3）甘油缺陷型4）溫度敏感突變株 谷氨酸分泌受細(xì)胞膜控制，影響細(xì)胞膜通透性的主要是膜中磷脂的含量。磷脂由不飽和脂肪酸、甘油、磷酸和側(cè)鏈組成，因此控制油酸、甘油等的合成可增加細(xì)胞膜通透性，從而有利于谷氨酸的滲透，消除反饋抑制。 調(diào)節(jié)措施（總結(jié)）1、菌種 選育，如對(duì)氟乙酸抗性菌株2、發(fā)酵條件 生物素限制 氟乙酸控制 錳離子缺乏？ 第九章 發(fā)酵工藝過(guò)程的控制 溫度的控制 溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)與發(fā)酵的影響 1、對(duì)菌體所有結(jié)構(gòu)物質(zhì)都有作用 2、直接