BSL-2ABSL-2生物安全實驗室病毒實驗室 培訓知識點【教學類別】

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1、 BSL-2/ABSL-2生物安全實驗室/病毒實驗室 培訓知識點 基本要求BSL-2實驗室培訓 t申請人具備3個月以上的細胞室工作經(jīng)驗；能夠嚴格遵守本單位及實驗室生物安全規(guī)程；既往無不良安全行為記錄。 特別要求BSL-2+實驗室培訓 除滿足基本要求外，還應具備以下條件：申請人參加過BSL-2實驗室培訓，并具備3個月以上BSL-2實驗室工作經(jīng)驗。 特別要求ABSL-2實驗室培訓 除滿足BSL-2+實驗培訓要求外，還應具備以下條件：已取得上海市實驗動物上崗證；或參加過上海巴斯德研究所實驗動物上崗培訓并考試合格 生物安全 4狹義指現(xiàn)代生物技術(shù)的研究、開發(fā)、應用以及轉(zhuǎn)基因生物

2、的跨國越境轉(zhuǎn)移可能對生物多樣性、生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生潛在的不利影響。廣義指與生物有關(guān)的各種因素對社會、經(jīng)濟、人類健康及生態(tài)系統(tǒng)所產(chǎn)生的危害或潛在風險。 實驗室生物安全 1防止發(fā)生病原體或毒素無意中暴露或意外釋放的防護原則、技術(shù)和行為。 2實驗室的生物安全條件和狀態(tài)不低于容許水平，可避免實驗室人員、來訪人員、社區(qū)和環(huán)境受到不可接受的損害，符合相關(guān)法規(guī)、標準等對實驗室生物安全責任的要求。 生物安全 4防止發(fā)生病原體或毒素無意中暴露或意外釋放的防護原則、技術(shù)和行為。 生物安全保障 4單位和個人為防止病原體或毒素丟失、被竊、濫用、轉(zhuǎn)移或有意釋放而采取的安全措施。 實驗室相

3、關(guān)感染 實驗室感染主要途徑 t注射器針頭或其他污染銳器意外接種；液體溢灑和噴濺到皮膚和粘膜；通過口吸移液或用手指或污染的物體觸摸口或眼睛從而攝入或接觸；動物咬傷和抓傷；吸入傳染性氣溶膠； t20%可明確感染的原因；80%是由工作人員操作失誤引起；20%是由設備故障引起；80%是不明原因的感染，可能為氣溶膠傳播感染。 實施實驗室生物安全管理的目的 保護人員和環(huán)境免受感染性生物因子的潛在暴露 實驗室生物安全管理體系目標 t保證實驗室設施、設備、個體防護裝備及相關(guān)物品符合國家有關(guān)的安全要求，定期檢查、維護、更新，確保不降低其設計性能。保證實驗工作人員均可得到持續(xù)培訓及繼續(xù)教育。

4、提供必要的免疫計劃、定期健康檢查和醫(yī)療保障。 管理體系文件 管理手冊，程序文件，標準操作規(guī)程、安全手冊，記錄、標識 實驗室生物安全管理員職責 針對技術(shù)方法、程序和方案、生物因子、材料和設備進行定期的內(nèi)部安全檢查；糾正違反生物安全操作規(guī)程的行為；在發(fā)生感染性物質(zhì)泄露或其他事故時，協(xié)助事故處置和調(diào)查；檢查和監(jiān)督實驗室廢棄物的有效管理與安全處置；檢查和監(jiān)督實驗室各項消毒滅菌措施的落實情況。 實驗室工作人員 充分認識和理解所從事工作的風險；自覺遵守實驗室的管理規(guī)定和要求；在身體狀態(tài)許可的情況下，應接受實驗室的免疫計劃和其他的健康管理規(guī)定；按規(guī)定正確使用設施、設備和個體防護裝備；

5、主動報告可能不適于從事特定任務的個人狀態(tài)；不應因人事、經(jīng)濟等任何壓力而違反管理規(guī)定；有責任和義務避免因個人原因造成生物安全事件或事故；如果懷疑個人受到感染，應立即報告；主動識別任何危險和不符合規(guī)定的工作，并立即報告。 風險評估與控制 危險 可能導致死亡、傷害或疾病、財產(chǎn)損失、工作環(huán)境破壞或這些情況組合的根源或狀態(tài)。 風險 危險發(fā)生的概率及其后果嚴重性的綜合。 風險評估 評估風險大小及確定是否可接受的全過程。 風險控制 為降低風險而采取的綜合措施。 危險度分級Risk Group Risk Group Individual Risk Community Risk I

6、No or Low No or Low II Moderate Low III High Low IV High High 病原微生物分類與防護水平 第一類 能夠引起人類或者動物非常嚴重疾病的微生物，以及我國尚未發(fā)現(xiàn)或者已經(jīng)宣布消滅的微生物。Smallpox 第二類 能夠引起人類或者動物嚴重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動物與人、動物與動物間傳播的微生物。HIV 第三類 能夠引起人類或動物疾病，一般情況下對人、動物或環(huán)境不構(gòu)成嚴重危害，傳播風險有限，實驗室感染后很少引起嚴重疾病，并具備有效治療和預防措施的微生物。HBV 第

7、四類 在通常情況下不會引起人類或者動物疾病的微生物。Mouse Leukemia Virus 病毒培養(yǎng)：指病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組試驗等操作。利用活病毒或其感染細胞（或細胞提取物），不經(jīng)滅活進行的生化分析、血清學檢測、免疫學檢測等操作視同病毒培養(yǎng)。（如大量活菌操作） 動物感染實驗：指以活病毒感染動物的實驗。 動物感染實驗未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作：指未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進行的病毒抗原檢測、血清學檢測、核酸檢測、生化分析等操作。未經(jīng)可靠滅活或固定的人和動物組織標本因含病毒量較高，其操作的防護級別應比照病毒培

8、養(yǎng)。（樣本檢測） 滅活材料的操作：指感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進行的病毒抗原檢測、血清學檢測、核酸檢測、生化分析、分子生物學實驗等不含致病性活病毒的操作。 無感染性材料的操作：指針對確認無感染性的材料的各種操作，包括但不限于無感染性的病毒DNA或cDNA操作。（非感染性材料的實驗） 生物安全屏障 一級屏障 即生物安全設備，包括：個體防護裝備、生物安全柜、動物隔離箱、安全離心杯 二級屏障 即實驗室設施設計和結(jié)構(gòu)，包括：圍護結(jié)構(gòu)、通風空調(diào)系統(tǒng)、供水供氣系統(tǒng)、電力供應系統(tǒng)、照明系統(tǒng)、監(jiān)控報警系統(tǒng)、消毒滅菌系統(tǒng) 生物安全防護（三要素實驗室操作技術(shù)、安全設備（一級屏

9、障）、設施設計和結(jié)構(gòu)（二級屏障）） 一級防護 通過良好的實驗室操作技術(shù)，合適的生物安全設備來防止工作人員或者實驗室環(huán)境對生物因子暴露 二級防護 防止實驗室外部環(huán)境對生物因子暴露 Bio-safety level(BSL) 表示僅從事體外操作的實驗室的相應生物安全防護水平。 Animal bio-safety level (ABSL) 表示包括從事動物活體操作的實驗室的相應生物安全防護水平。 BSL-1實驗室基本防護要求 t在靠近實驗室出口處設置洗手裝置；在實驗室出口處應設存衣或掛衣裝置，個人服裝與工作服分開放置；人員工作時應穿工作服，戴手套； BSL-2實驗室基本防護要求

10、 t符合BSL-1實驗室的要求；實驗室進入控制措施；在實驗室或其所在建筑內(nèi)配備高壓滅菌設備；病原微生物應在生物安全柜內(nèi)操作；工作區(qū)應配備緊急洗眼裝置；人員工作時應穿工作服，戴手套、口罩和帽子，以防氣溶膠污染； 1進入控制 實驗室門口應張貼國際通用的生物危害標識 t僅授權(quán)人員可以進入實驗室 t禁止兒童進入實驗室 t實驗室門應保持鎖閉 t應標明實驗室操作的微生物 人員培訓與考核 t人員健康管理 t t出入記錄 2操作規(guī)范 l 洗手 接觸感染性物質(zhì)后和離開實驗室工作區(qū)域前 l 禁止在實驗室工作區(qū)域內(nèi)從事下列行為（進食、飲水、吸煙、處理隱形眼鏡、使用化妝品、儲存食品）

11、 l 移液（禁止口吸移液，必須使用機械移液裝置） l 銳器處置y禁止將銳器隨意棄置于塑料，必須使用專用銳器收集容器 l 廢物包裝袋t l 控制濺出和氣溶膠產(chǎn)生 l 去除工作臺面污染或感染性物質(zhì)濺出后 使用適當消毒劑 3工作完成之后 廢棄物處置t分類收集，固體液體分開；收集于防漏包裝袋和容器；使用有生物危害的紅色或黃色可高壓蒸汽滅菌包裝袋；廢棄物應高壓滅菌； 4工作過程中 必須穿著實驗室防護服以防污染個人衣物；工作時必須戴手套以保護雙手暴露于危險性材料；當手套被污染、破損或必要時應更換手套；每當操作危險性材料的工作結(jié)束時離開實驗間前，除去手套并洗手；不要清洗或重復使用一次性

12、手套；如果有可能發(fā)生微生物或其他有害物質(zhì)濺出，要佩戴防護眼鏡；涉及感染性物質(zhì)的所有操作均應在生物安全柜或其它防護裝置內(nèi)進行。 離心 1使用密封轉(zhuǎn)頭或安全離心杯t2一定要在生物安全柜內(nèi)打開 BSL-2實驗設施及操作規(guī)程 實驗室分區(qū) 1實驗室防護（工作）區(qū) 實驗室的物理分區(qū)，該區(qū)域內(nèi)生物風險相對較大，需對實驗室的平面設計、圍護結(jié)構(gòu)的密閉性、氣流，以及人員進入、個體防護等進行控制的區(qū)域。 2核心工作間（主實驗室） 防護區(qū)中直接從事高風險操作的工作間。 3輔助工作區(qū) 生物風險相對較小的區(qū)域，也指實驗室中防護區(qū)以外的區(qū) 消毒滅菌設備（滅菌鍋、紫外燈、過氧化氫發(fā)生

13、裝置） 常用消毒劑 2%戊二醛、75%乙醇、二氧化氯、含氯消毒劑（三氯異氰尿酸等） 個體防護裝備 t防護服、手套（雙層）、口罩、防護帽、防護鏡、鞋套、防水圍裙套袖。 l 在輔助工作區(qū)無需使用PPE。 l 進入防護區(qū)時應使用第一層PPE，包括：一次性鞋套、工作服、第一層乳膠手套、帽子、口罩。在半污染區(qū)中操作超速離心機和-80℃冰箱必須戴第二層乳膠手套。 l 在核心工作間開展病原微生物實驗活動時應增加第二層PPE。包括：第二層乳膠手套、一次性圍裙套袖或反穿衣、防護鏡。 PPE脫除程序 t第二層PPE應在離開核心工作間時脫下。第二層手套應先消毒再脫下。第一層PPE應在離開

14、防護區(qū)時脫下。離開實驗室時應使用流水和洗手液洗手。 運輸包裝要求 l 在實驗室內(nèi)和本單位內(nèi)運輸感染性物質(zhì)標本時必須遵守雙層防護原則，使用兩層包裝系統(tǒng)。裝載感染性物質(zhì)標本的內(nèi)層容器必須放到一個外層容器中，并保持內(nèi)層容器固定直立。外層容器應防破裂、防泄漏，并可耐受高壓滅菌和化學消毒劑作用。 l 對外運輸包裝要求 對外運輸感染性物質(zhì)過程中應使用三層包裝系統(tǒng)，包括內(nèi)層容器，第二層包裝容器及外層包裝材料。裝載標本的內(nèi)層容器必須防水、防漏并貼上指示內(nèi)容物的適當標簽。內(nèi)層容器外面要包裹足量的吸收性材料，以便內(nèi)層容器打破或泄漏時能吸收溢出的所有液體。 保存與使用 t感染性物質(zhì)應貯存于指定的冰箱

15、，冰箱門應張貼生物危險標識。 t感染性物質(zhì)的監(jiān)管實行雙人負責制，由實驗室負責人和其指定的責任人共同管理。保藏冰柜實行雙鎖管理。每次存取感染性物質(zhì)必須登記。 t感染性物質(zhì)的所有操作必須在Ⅱ級生物安全柜中進行。開放式的工作臺上不允許操作這類物質(zhì)。 t所有涉及感染性物質(zhì)的使用過程都應如實記錄，包括領(lǐng)取和使用的時間，感染性物質(zhì)名稱及數(shù)量。不經(jīng)實驗室負責人批準，不得將感染性物質(zhì)帶出實驗室。 t實驗工作結(jié)束后，未用盡的感染性物質(zhì)和使用后得到的產(chǎn)物應按要求進行處理、銷毀或保存，并如實填寫實驗記錄。 實驗室內(nèi)空氣的消毒和滅菌 t實驗室房間、生物安全柜、傳遞窗內(nèi)的懸吊式紫外消毒燈等對上述空間內(nèi)的

16、空氣進行消毒，安裝數(shù)量為平均1.5W/m3，照射時間30-60分鐘。 t甲醛熏蒸可對實驗室空氣、設備以及物體表面的微生物實現(xiàn)有效滅菌。 t二氧化氯噴霧可對實驗室空氣、設備以及物體表面的微物實現(xiàn)有效消毒滅菌。 物體表面消毒滅菌 t實驗室地面應濕式拖掃，禁止干拖干掃和使用吸塵器。可使用含氯消毒液（有效氯含量1000-2000mg/L）噴灑后拖掃。拖把應專用，污染區(qū)和清潔區(qū)不得混用。應使用可裝配吸水布或紙巾的拖把，使用后用應將吸水布或紙巾作為感染性廢物處理。 t實驗臺面、桌子、椅子、凳子、門把手、實驗記錄夾等可用75%乙醇噴灑擦拭，消毒作用不少于20min。 t實驗材料的表面可用75%乙

17、醇擦拭或噴灑消毒。 儀器設備的消毒滅菌 顯微鏡、離心機、冰箱、培養(yǎng)箱、移液器等局部輕度污染時，可用先后用2%戊二醛和75%乙醇擦拭。污染嚴重或傳染性強的，半小時后重復擦拭一次。如需整體滅菌，應使用甲醛熏蒸或二氧化氯噴霧。 手的清潔消毒 t離開BSL-2實驗室污染區(qū)，脫防護服前應75%乙醇洗手消毒。 t實驗室工作完畢后應立即進行手部清洗和消毒。采用非自動洗手設備，水龍頭開關(guān)盡量應用長柄式、腳踏式或感應式。使用瓶裝式液體皂，洗手后用一次性紙巾或烘干機烘干。在無流動水情況下，可使用含乙醇免洗消毒洗手液。 廢棄物處置程序 分類收集 t實驗室廢物應根據(jù)其特性分別按照感染性廢物、病理性廢物

18、、 損傷性廢物(銳器)、化學性廢物進行分類收集。危險廢物應使用專用容器收集。在設有分區(qū)的實驗室中，不同區(qū)域的廢物應分開收集。實驗廢物應收集于所在區(qū)域的廢棄收集容器內(nèi)。感染性實驗廢物應使用專用黃色包裝袋收集，包裝袋應置于專用硬質(zhì)收集箱桶里。 tBSL-2實驗室防護區(qū)中產(chǎn)生的實驗廢物均應視為感染性廢物。 核心工作間中可使用紅色高壓滅菌袋收集。生物安全柜中產(chǎn)生的廢物應在生物安全柜內(nèi)消毒、收集、包裝后移出。損傷性廢物（銳器）應使用有蓋、耐刺破的黃色利器盒收集，并按感染性材料處置。感染性液態(tài)廢物應收集于實驗室內(nèi)的可密閉收集桶中，禁止直接向下水管道中排放。收集容器內(nèi)實驗廢物超過容量3/4時必須進行清

19、理。實驗廢物應每天至少清運一次。 消毒滅菌 t感染性廢物的消毒滅菌方式包括：化學消毒、高壓滅菌、高溫焚燒。 t感染性廢物收集前應先進行化學消毒。 tBSL-2實驗室感染性廢物送出實驗室前應高壓滅菌。如實驗室不具備高壓滅菌條件，可送至清潔室高壓滅菌。實驗廢物送出BSL-2實驗室前應消毒包裝袋外表面。 任何需重復使用的感染性材料必須在消毒滅菌后進行清洗、修復。 tBSL-2實驗室使用過的防護服、毛巾應高壓滅菌后再送出洗滌。 tBSL-2實驗室產(chǎn)生的含有感染性物質(zhì)的液態(tài)廢物應使用消毒劑處理后集中收集于密閉容器。移出實驗室前應使用含氯消毒劑處理。處理時間應不少于2小時，有效氯含量應大于2

20、000mg/L，處理過程中容器應保持密封。BSL-2實驗室廢液移出實驗室前應對容器外表面進行化學消毒 離心準備工作要求 t檢查轉(zhuǎn)頭或離心杯密封圈 t離心管內(nèi)液體不應過量 t密閉離心管 t離心管放入轉(zhuǎn)頭或離心杯前應去除表面污染 t密閉轉(zhuǎn)頭或離心杯 t去除轉(zhuǎn)頭或離心杯表面污染 t使用純水或酒精作為配平液體 t應在用于配平的離心管蓋上作標記 離心結(jié)束后的工作要求 t在生物安全柜內(nèi)打開轉(zhuǎn)頭或離心杯 t從生物安全柜內(nèi)取出轉(zhuǎn)頭或離心杯時應去除污染 生物安全柜 操作規(guī)程 個人防護要求（在使用生物安全柜時必須穿個人防護服，戴手 套；應戴口罩和帽子，根據(jù)需要帶防護眼罩或者

21、面罩。） 柜內(nèi)物品的擺放按照從潔凈區(qū)到污染區(qū)的方向擺放。所有物品盡可能放在工作臺后部。將廢物袋、移液管收集盤、吸濾瓶等大體積物品放在柜內(nèi)一側(cè)。 前后格柵不能被紙、儀器設備或者其他物品阻擋。 紫外消毒燈 每周清潔，除去可能影響殺菌效果的灰塵和污垢。房間中有人時一定要關(guān)閉紫外燈，以保護眼睛和皮膚，避免因不慎暴露而造成傷害。 避免明火 火焰可造成生物安全柜的氣流紊亂，干擾氣流模式?？蓳p壞HEPA過濾器。處理揮發(fā)性物品和易燃物品時易造成危險。 工作前準備 打開安全柜的日光燈和風機；安全柜運行15min，凈化工作區(qū)的空氣污染物；用適當消毒劑擦拭生物安全柜的工作臺面及內(nèi)壁以去除污染；將實驗

22、中需使用的物品集中用消毒劑擦拭后放在臺面相應位置上。 工作中操作 避免手臂在前開口處快速移動和頻繁進出。盡量避免污染的物品進入潔凈區(qū)。在生物安全柜內(nèi)操作時，不能進行文字工作。盡量減少操作者身后的人員活動。操作者的面部應始終在移動檔板后面。 溢出處理 始終保持生物安全柜運轉(zhuǎn)狀態(tài)，不要關(guān)閉風機。在溢出物上覆蓋浸有消毒劑的吸水材料，保持適當時間以 發(fā)揮消毒作用。在安全柜內(nèi)消毒污染的手套。如果防護服已被污染，也應消毒。更換新的手套和衣服后進行下一步的清潔工作。所有廢棄物以及防護服進行高壓滅菌。清洗手部和其它部位暴露皮膚。立即通知實驗室相關(guān)管理人員。如果溢出物流入安全柜內(nèi)，可能需要對安

23、全柜進行徹底消毒。 工作結(jié)束后處理 保持安全柜繼續(xù)運行至少5min完成凈化。將柜內(nèi)物品移出前，應使用適當消毒劑擦拭去除表面污染。工作結(jié)束后應使用適當消毒劑擦拭生物安全柜的內(nèi)壁和臺面，以去除污染。關(guān)閉前窗，關(guān)日光燈，關(guān)風機，開紫外消毒燈照射至少30分鐘。 實驗動物微生物和寄生蟲控制分級 一、分級： 1、普通級動物（CV） 概念：普通級動物是指飼養(yǎng)在開放系統(tǒng)中，在微生物控制上要求最低的動物，它要求不攜帶人畜共患病和動物烈性傳染病的病原。 特點：①來源于清潔動物或SPF動物，在開放系統(tǒng)中飼養(yǎng)。飼養(yǎng)成本低，價格便宜，可大量供應。②微生物控制程度低，但應排除人畜共患病和動物烈性傳染病。

24、③對實驗反應性差。 2、清潔動物(CL) 概念：除不帶有普通級動物應排除的病原外，還不應攜帶對動物危害大和對科學研究干擾大的病原。 特點：①來源于SPF動物或無菌動物，在屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)。②較普通級動物健康，又比SPF動物容易達到質(zhì)量標準。③對實驗干擾較少，實驗重復性和敏感性較好，是我國主要的科研用動物。 3、無特定病原體動物(SPF) 概念：無特定病原體動物是指動物體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲存在，但帶有非特定的微生物和寄生蟲的動物。 特點：①來源于無菌動物或悉生動物，飼養(yǎng)在屏障系統(tǒng)中。②屬健康無病動物。繁殖率高，自然死亡率低。③不干擾科研實驗，實驗結(jié)果可靠，是國際上公認的科研用動物

25、。 4、無菌動物(GF) 包括悉生動物(GN) 概念：無菌動物是指用現(xiàn)有的檢測技術(shù)在動物體內(nèi)外的任何部位均檢不出任何活的微生物和寄生蟲的動物。 特點：①來源于剖腹產(chǎn)或無菌卵的孵化，飼養(yǎng)在隔離系統(tǒng)中。②體內(nèi)外無菌，飼養(yǎng)較困難。③形態(tài)學和生理學在某些方面與常規(guī)動物不同。 5、悉生動物(GN) 概念：悉生動物是指在無菌動物體內(nèi)植入已知微生物的動物。植入一種細菌的動物叫單菌動物；植入兩種細菌的動物叫雙菌動物；植入三種細菌的動物叫三菌動物；植入多種細菌的動物叫多菌動物 特點：①來源于無菌動物，對動物所帶的微生物明確。飼養(yǎng)在隔離系統(tǒng)中。②與無菌動物相比，生活力、抵抗力較強，容易飼養(yǎng)。③在某些實

26、驗中，可代替無菌動物。 實驗動物常見疾病 鼠痘（脫腳病）、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎、小鼠肝炎、仙臺病毒、沙門氏菌感染、霉形體感染、螨病 動物實驗中的生物危害 生物危害是指在科學實驗中，由于實驗人員的錯誤操作，而使有害病原體散播到外界，污染外界環(huán)境，并造成周圍人及動物感染發(fā)病。 第一類：天花病毒 第二類：鼠疫耶爾森菌，霍亂弧菌，布魯氏菌屬，炭疽芽胞桿菌，乙型腦炎病毒 第三類：金黃色葡萄球菌，鏈球菌屬，仙臺病毒（鼠副流感病毒1 型） 第四類：小鼠白血病病毒，小鼠乳腺瘤病毒 1 4 7 2 5 8 3 6 9 小鼠標記 ( 1) 3- 5％苦味酸溶液，可染成黃色。——作為“個”位數(shù)。 ( 2) 0.5%中性紅或品紅溶液，可染成紅色。——作為“十”位數(shù)。 8 教資分享