蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用.ppt

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1、第六章 蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用,,,概述,蛋白質(zhì)是對生命至關(guān)重要的一類生物大分子物質(zhì)，各種生命功能、生命現(xiàn)象、生命活動都和蛋白質(zhì)有關(guān)。在生命有機體催化、運動、結(jié)構(gòu)、識別和調(diào)節(jié)等許多方面，起著關(guān)鍵的作用。,酶.幾乎全都是蛋白質(zhì)。 肌肉收縮、精子移動、細胞分裂過程中的染色體移動. 高等生物的有序生長和分化過程。 抗體蛋白能識別和結(jié)合特異性的外源物質(zhì)，使人體具備抵抗各種細菌、真菌和病毒的能力。 由神經(jīng)細胞膜蛋白構(gòu)成的離子通道，負責神經(jīng)沖動的形成和傳導(dǎo)。 血紅蛋白具有結(jié)合和釋放氧的能力，是血液中氧、二氧化碳和氫離子的攜帶者。 另外，人體的毛發(fā)和指甲屬于角蛋白，而血栓是由血纖蛋白單體聚合而成的

2、。,蛋白質(zhì)的生物學功能,1.催化功能：酶 2.調(diào)節(jié)功能：激素 3.結(jié)構(gòu)功能：皮、毛、骨、牙、細胞骨架 4.運輸功能：血紅蛋白 5.免疫功能：免疫球蛋白 6.運動功能：鞭毛、肌肉蛋白 7.儲藏功能：酪蛋白 8.生物膜功能：及神經(jīng)傳導(dǎo)等,蛋白質(zhì)是生命的體現(xiàn)者，離開了蛋白質(zhì)，生命將不復(fù)存在?？墒?，生物體內(nèi)存在的天然蛋白質(zhì)，有的往往不盡人意，需要進行改造。由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸按一定順序連接而成的，每一種蛋白質(zhì)有自己獨特的氨基酸順序，所以改變其中關(guān)鍵的氨基酸就能改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。而氨基酸是由三聯(lián)體密碼決定的，只要改變構(gòu)成遺傳密碼的一個或兩個堿基就能達到改造蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)工程的一個重要途徑就是根

3、據(jù)人們的需要，對負責編碼某種蛋白質(zhì)的基因重新進行設(shè)計，使合成的蛋白質(zhì)變得更符合人類的需要。,一、蛋白質(zhì)工程的崛起的緣由,1、基因工程產(chǎn)物 基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。,這些天然蛋白質(zhì)是生物在長期進化過程中形成的,它們的結(jié)構(gòu)和功能符合特定物種生存的需要,卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要。,實例1：玉米中賴氨酸的含量比較低,如果對賴氨酸合成過程中的兩個關(guān)鍵酶進行改造,可以使玉米葉片和種子中的游離賴氨酸分別提高5倍和2倍。,原因：賴氨酸合成過程中兩個關(guān)鍵酶天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合成酶的活性，受細胞內(nèi)賴氨酸濃度的影響。當賴氨酸濃度達到一定量時，就會抑制這兩種酶的活性。,實例

4、2:工業(yè)用酶,在已研究過的幾千種酶中，只有極少數(shù)可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，絕大多數(shù)酶都不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，這些酶雖然在自然狀態(tài)下有活性，但在工業(yè)生產(chǎn)中沒有活性或活性很低。這是因為工業(yè)生產(chǎn)中每一步的反應(yīng)體系中常常會有酸、堿或有機溶劑存在，反應(yīng)溫度較高，在這種條件下，大多數(shù)酶會很快變性失活。提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是工業(yè)生產(chǎn)中一個非常重要的課題。一般來說，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性包括：延長酶的半衰期，提高酶的熱穩(wěn)定性，延長藥用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失等。,3、蛋白質(zhì)工程產(chǎn)物,是自然界原本不存在的新的蛋白質(zhì)。,你知道人類蛋白質(zhì)組計劃嗎？它與蛋白質(zhì)工程有什么關(guān)系？我國科學家承擔了什么任務(wù)？,人

5、類蛋白質(zhì)組計劃是繼人類基因組計劃之后，生命科學乃至自然科學領(lǐng)域一項重大的科學命題。2001年，國際人類蛋白質(zhì)組組織宣告成立。之后，該組織正式提出啟動了兩項重大國際合作行動：一項是由中國科學家牽頭執(zhí)行的“人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃”；另一項是以美國科學家牽頭執(zhí)行的“人類血漿蛋白質(zhì)組計劃”，由此拉開了人類蛋白質(zhì)組計劃的帷幕。,“人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃”是國際上第一個人類組織器官的蛋白質(zhì)組計劃，由我國賀福初院士牽頭，這是中國科學家第一次領(lǐng)銜的重大國際科研協(xié)作計劃，總部設(shè)在北京，目前有16個國家和地區(qū)的80多個實驗室報名參加。它的科學目標是揭示并確認肝臟的蛋白質(zhì)，為重大肝病預(yù)防、診斷、治療和新藥研發(fā)的突破提供

6、重要的科學基礎(chǔ)。 人類蛋白質(zhì)組計劃的深入研究將是對蛋白質(zhì)工程的有力推動和理論支持。,思考：對天然蛋白質(zhì)進行改造，你認為應(yīng)該直接對蛋白質(zhì)分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現(xiàn)？,應(yīng)該從對基因的操作來實現(xiàn)對天然蛋白質(zhì)改造，主要原因如下： （1）任何一種天然蛋白質(zhì)都是由基因編碼的，改造了基因即對蛋白質(zhì)進行了改造，而且改造過的蛋白質(zhì)可以遺傳下去。如果對蛋白質(zhì)直接改造，即使改造成功，被改造過的蛋白質(zhì)分子還是無法遺傳的。 （2）對基因進行改造比對蛋白質(zhì)直接改造要容易操作，難度要小得多。,二、蛋白質(zhì)工程的基本原理,1、蛋白質(zhì)工程的目標,根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行分子設(shè)計。,2、天然

7、蛋白質(zhì)的合成過程,基因表達（轉(zhuǎn)錄和翻譯）形成氨基酸序列的多肽鏈形成具有高級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)行使生物功能,中心法則 （central dogma）,生物的遺傳信息從 DNA傳遞給mRNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄。根據(jù)mRNA鏈上的遺傳信息合成蛋白質(zhì)的過程，被稱為翻譯和表達。1958年Crick將生物遺傳信息的這種傳遞方式稱為中心法則。,復(fù)制：是親代雙鏈DNA按堿基配對原則，準確形成兩個相同核苷酸序列的子代DNA分子的過程。兩條DNA鏈都可作為復(fù)制的模板。 轉(zhuǎn)錄：是以一條DNA鏈為模板，將DNA鏈上儲存的遺傳信息按堿基配對原則準確轉(zhuǎn)換成互補的mRNA的過程。 翻譯：是以mRNA為模板，將mRNA上的遺傳信息轉(zhuǎn)換

8、成蛋白質(zhì)的氨基酸序列的過程。 中心法則：遺傳信息由DNA mRNA 蛋白質(zhì)的流動途徑。,,,,,中心法則：遺傳信息由DNA mRNA 蛋白質(zhì)的流動途徑。,,,補充和完善之處： A：RNA作為遺傳物質(zhì)能自我復(fù)制，并作為mRNA指導(dǎo)PRO的合成。 B：RNA能以逆轉(zhuǎn)錄的方式將遺傳信息傳遞給DNA分子。,,,、蛋白質(zhì)工程的基本途徑,,預(yù)期的蛋白質(zhì)功能,設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),推測應(yīng)有的氨基酸序列,,,,找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）,討論：某多肽鏈的一段氨基酸序列是：丙氨酸色氨酸賴氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸,（1）怎樣得出決定這一段肽鏈的脫氧核苷酸序列？請把相應(yīng)的堿基序列寫出來。,首先應(yīng)

9、該根據(jù)三聯(lián)密碼子推出mRNA序列，每種氨基酸都有對應(yīng)的三聯(lián)密碼子，只要查一下遺傳密碼子表，就可以將上述氨基酸序列的編碼序列查出來。再根據(jù)堿基互補配對規(guī)律推出脫氧核苷酸序列。但是由于上述氨基酸序列中有幾個氨基酸是由多個三聯(lián)密碼子編碼，因此其堿基排列組合起來就比較復(fù)雜，至少可以排列出16種。,密碼子：,mRNA上決定一個氨基酸的三個相鄰堿基,密碼子總數(shù)：43=64種(其中61種密碼子是對應(yīng)氨基酸 和起始；另有3個不對應(yīng)氨基酸，只對應(yīng)終止),1種密碼子只對應(yīng)1種氨基酸；1種氨基酸可以對應(yīng)多種密碼子。,密碼子在生物界基本是是通用的。這也是生物彼此間存在親緣關(guān)系的證據(jù)之一 。,GCU（或C或A或G）U

10、GGAAA（或G）AUGUUU（或C）,mRNA序列,,脫氧核苷酸序列,（2）確定目的基因的堿基序列后，怎樣才能合成或改造目的基因（DNA）？,確定目的基因的堿基序列后，就可以根據(jù)人類的需要改造它，通過人工合成的方法或從基因庫中獲取。,蛋白質(zhì)工程就是以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。,蛋白質(zhì)工程的概念,1983年，美國生物學家額爾默首先提出了“蛋白質(zhì)工程”的概念。蛋白質(zhì)工程的實踐依據(jù)DNA指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)，因此，人們可以根據(jù)需要對負責編碼某種蛋白質(zhì)的基因進行重新設(shè)計，使合成出來的蛋

11、白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得符合人們的要求。,蛋白質(zhì)工程是指通過生物技術(shù)手段對蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或者對編碼蛋白質(zhì)的基因進行改造，以便獲的更適合人類需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的技術(shù)。 蛋白質(zhì)工程是指通過蛋白質(zhì)化學、蛋白質(zhì)晶體學和動力學的研究，獲取有關(guān)蛋白質(zhì)物理和化學等各方面的信息，在此基礎(chǔ)上利用生物技術(shù)手段對蛋白質(zhì)的DNA編碼序列進行有目的的改造并分離、純化蛋白質(zhì)，從而獲取自然界沒有的、具有優(yōu)良性質(zhì)或適用于工業(yè)生產(chǎn)條件的全新蛋白質(zhì)的過程。,5、蛋白質(zhì)工程與基因工程的關(guān)系,蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程，是包含多學科的綜合科技工程領(lǐng)域。,基因工程是通過基因操作把外源基因轉(zhuǎn)入適當?shù)纳矬w內(nèi)，并在其中

12、進行表達，它的產(chǎn)品是該基因編碼的天然存在的蛋白質(zhì)。,蛋白質(zhì)工程就是根據(jù)蛋白質(zhì)的精細結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。 蛋白質(zhì)工程自誕生之日起，就與基因工程密不可分。蛋白質(zhì)工程根據(jù)對分子預(yù)先設(shè)計的方案，通過對天然蛋白質(zhì)的基因進行改造，來實現(xiàn)對它所編碼的蛋白質(zhì)進行改造。因此，它的產(chǎn)品已不再是天然的蛋白質(zhì)，而是經(jīng)過改造的、具有了人類所需要的優(yōu)點的蛋白質(zhì)。,6、蛋白質(zhì)工程與酶工程的關(guān)系,絕大多數(shù)酶都是蛋白質(zhì)，酶工程與蛋白質(zhì)工程有什么區(qū)別？ 酶工程就是指將酶所具有的生物催化作用，借助工程學的手段

13、，應(yīng)用于生產(chǎn)、生活、醫(yī)療診斷和環(huán)境保護等方面的一門科學技術(shù)。概括地說，酶工程是由酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用兩方面組成的。酶工程的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)中。,通常所說的酶工程是用工程菌生產(chǎn)酶制劑，而沒有經(jīng)過由酶的功能來設(shè)計酶的分子結(jié)構(gòu)，然后由酶的分子結(jié)構(gòu)來確定相應(yīng)基因的堿基序列等步驟。因此，酶工程的重點在于對已存酶的合理充分利用，而蛋白質(zhì)工程的重點則在于對已存在的蛋白質(zhì)分子的改造。當然，隨著蛋白質(zhì)工程的發(fā)展，其成果也會應(yīng)用到酶工程中，使酶工程成為蛋白質(zhì)工程的一部分。,一、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)分子的生物功能，與蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)密不可分。決定蛋白質(zhì)這種特殊生物功能的關(guān)鍵因素是它的分子構(gòu)象

14、 。,基本組成單位--氨基酸,組成生物體蛋白質(zhì)的20種氨基酸,2.組成生物體蛋白質(zhì)的20種氨基酸2,肽（肽鍵與肽2),肽鍵就是由氨基酸的-羧基與相鄰的氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學鍵,肽（肽鍵與肽3),肽:氨基酸通過肽鍵連結(jié)起來的化合物 二肽:兩個氨基酸形成的肽 三肽:三個氨基酸形成的肽 多肽:許多氨基酸形成的肽 蛋白質(zhì):大多為100個以上氨基酸組成的多肽,氨基酸殘基:多肽鏈中不完全的氨基酸。 氨基酸由于形成肽鍵而失去了一分子水，因此表現(xiàn)出其分子的不完整。 氨基末端：多肽鏈中含有自由-氨基的一端。簡稱N-端 羧基末端：多肽鏈中含有自由-羧基的一端。 簡稱C-端,蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的一

15、級結(jié)構(gòu)是指氨基酸按一定的順序通過肽鍵相連而成的多肽鏈，也是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)。 每一種蛋白質(zhì)分子都有自己特有的氨基酸的組成和排列順序即一級結(jié)構(gòu)，由這種氨基酸排列順序決定它的特定的空間結(jié)構(gòu)，也就是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的二級、三級等高級結(jié)構(gòu) 。,蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu),牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)1,,（1）氫鍵：氫原子與負電性強的原子（如氧、氮等）間形成。對蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象的維護很重要。 （2）靜電引力：正負帶電基團之間的吸引力。對蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象的穩(wěn)定貢獻不是很大，也稱為離子鍵或鹽鍵 （3）范德華力：原子團相互接近時誘導(dǎo)所致。它變化多樣，對維持蛋白質(zhì)活性中心的構(gòu)象影響很大,維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的

16、化學鍵,,（4）疏水相互作用：是非極性基團為了避開水相而群集在一起的作用力。疏水作用是維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的重要因素 （5）二硫鍵：作用很強，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象起重要作用 氫鍵、離子鍵、疏水作用和范德華力等次級鍵是非共價鍵 肽鍵、二硫鍵、酯鍵等被稱之為共價鍵,,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu) 二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，是多肽鏈局部的空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象） 主要形式： -螺旋、-折疊、 -轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等,-轉(zhuǎn)角,蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu),,螺旋,折疊片,,轉(zhuǎn)角,自由回轉(zhuǎn),,,,,三級結(jié)構(gòu) 三級結(jié)構(gòu)是指整條多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步盤曲而成特定格式的三級結(jié)構(gòu)。 四級結(jié)構(gòu) 很多蛋白質(zhì)

17、分子是由兩個或兩個以上獨立的、具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈組成的。 這些多肽鏈之間只是通過疏水作用等次級鍵結(jié)合成為有序排列的特定的空間結(jié)構(gòu)，形成了四級結(jié)構(gòu)。 在四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子中，每個具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈單位稱為亞基，亞基多無生物學活性，具有完整四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子才有生物活性。,,,血紅蛋白中四亞基兩兩相同，分別稱為1 、2、1、2,蛋白質(zhì)工程主要包括4大類研究： 第一，利用已知的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息開發(fā)應(yīng)用研究。第二，定量確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。這是目前蛋白質(zhì)工程研究的主體，它包括蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型的建立，酶催化的性質(zhì)、蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性研究等. 第三，從混雜變異體庫中篩選具有特定結(jié)構(gòu)-功能

18、關(guān)系的蛋白質(zhì)。 第四，根據(jù)已知結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的蛋白質(zhì)，用人工方法合成它及其變異體.,第二節(jié) 蛋白質(zhì)工程的基本步驟 與改造策略,一、蛋白質(zhì)工程的基本步驟 （1）分離純化目的蛋白，使之結(jié)晶,進行分析,得到其空間結(jié)構(gòu)的盡可能多的信息。 （2）對目的蛋白的功能作詳盡的研究，確定它的功能域。 （3）通過對蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)和功能之間的相互關(guān)系分析，找出關(guān)鍵的基團和結(jié)構(gòu)。,(4)圍繞這些關(guān)鍵的基團和結(jié)構(gòu)提出對蛋白質(zhì)進行改造的方案，并用基因工程的方法去實施。 (5)對經(jīng)過改造的蛋白質(zhì)進行功能性測定.,二、蛋白質(zhì)工程的改造策略,1、疏水氨基酸常常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的活動中心區(qū)域；螺旋和折疊區(qū)通常不會是

19、酶的活性中心以及底物結(jié)合的中心，而是作為結(jié)構(gòu)的支架；環(huán)區(qū)、轉(zhuǎn)角區(qū)域和帶電荷區(qū)域通常位于蛋白質(zhì)的表面。 2、進行定點突變時，應(yīng)注意保守氨基酸殘基。如果要改變酶活性、底物結(jié)合活性等高度特異性的性質(zhì)，則應(yīng)盡量保留保守殘基。,3、應(yīng)注意保留潛在的N糖基化位點(Asn-X-SerThr-X-Pro)中的Asn(天門冬酰胺)、Set(絲氨酸)或Thr(蘇氨酸)。 4、對于含有內(nèi)含子的序列，可以刪除某一外顯子或外顯子組合，因為單個外顯子通常編碼獨立折疊的結(jié)構(gòu)域，刪去該結(jié)構(gòu)域后可能不會影響蛋白其余部分的正確折疊。 5、構(gòu)建兩個同源蛋白的嵌合體時，應(yīng)盡量使其接合部位處在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而當兩個

20、非同源蛋白組成嵌合體時，則應(yīng)使接合部分盡量位于所預(yù)測結(jié)構(gòu)的邊緣。,6、如果對目的蛋白的三維結(jié)構(gòu)一無所知，那么可以在目的序列中隨機插入六聚體接頭以鑒定功能性結(jié)構(gòu)域。插入六聚體接頭后，在原蛋白質(zhì)序列中添加兩個氨基酸，比插入更多的氨基酸對蛋白質(zhì)整體功能的破壞要輕。 7、進行缺失突變時，應(yīng)避免直接利用天然存在的限制性酶切位點進行刪除。,第三節(jié) 、蛋白質(zhì)改造方法,在基因水平上對蛋白質(zhì)進行改造，按改造的規(guī)模和程度可以分為： 初級改造：個別氨基酸的改變和一整段氨基酸序列的刪除、置換或插入 高級改造：蛋白質(zhì)分子的剪裁，如結(jié)構(gòu)域的拼接 從頭設(shè)計合成新型蛋白質(zhì),一、初級改造 通過基因突變方法，以達到改變氨基酸進而

21、改造蛋白質(zhì)的目的。 目前，主要采用的基因突變方法： 基因定位突變 盒式突變。,基因定位突變 根據(jù)三聯(lián)體密碼，編碼DNA（目的基因）的確定位點，改變其組成核苷酸的順序或種類，使基因發(fā)生定向變異，使其控制合成的氨基酸種類、順序發(fā)生改變，合成出具有預(yù)期氨基酸序列的修飾蛋白質(zhì)。 這種通過造成一個或幾個堿基定點突變，以達到修飾蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)目的的技術(shù)，稱為基因定點突變技術(shù)。,基因定位突變的基本過程： 首先使目的基因由環(huán)狀載體折成單鏈，再對指定的位點用寡聚核苷酸誘導(dǎo)或置入合成的寡聚核苷酸產(chǎn)生定位突變基因，最后將突變基因?qū)脒m宜的表達系統(tǒng)(如大腸桿菌等)即可產(chǎn)生突變體蛋白質(zhì)。這是目前定向改造蛋白質(zhì)的基本手段

22、。,（一）M13-DNA寡聚核苷酸介導(dǎo)誘變技術(shù),特點：能夠準確按照人們的意圖進行DNA突變，即想改變哪一個堿基就只改變哪一個，其他的不變 基本過程：將待研究的基因插入載體M13，制得單鏈模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一個或幾個非配對堿基）作為引物，合成相應(yīng)的互補鏈，用T4連接酶連接成閉環(huán)雙鏈分子。經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，雙鏈分子在胞內(nèi)分別復(fù)制，因此就得到兩種類型的噬菌斑，含錯配堿基的就為突變型。再轉(zhuǎn)入合適的表達系統(tǒng)合成突變型蛋白質(zhì)。,（二）寡核苷酸介導(dǎo)的PCR誘變技術(shù),特點：利用PCR技術(shù)定點誘變，可使突變體大量擴增，提高誘變率 以研究基因為模板，用人工合成的寡核苷酸（含有一個或幾個非互補的堿基

23、）為引物，直接進行基因擴增反應(yīng)，就會產(chǎn)生突變型基因。分離出突變型基因后，在合適的表達系統(tǒng)中合成突變型蛋白質(zhì)。這種方法直接、快速和高效。,過程： 將目的基因克隆到質(zhì)粒載體上，質(zhì)粒分置于兩管中，每管各加入兩個特定的PCR引物，一個引物與基因內(nèi)部或其附近的一段序列完全互補，另一引物和另一段序列互補，但有一個核苷酸發(fā)生了突變； 兩管中，不完全配對的引物與兩條相反的鏈結(jié)合，即兩個突變引物是互補的。由于兩個反應(yīng)中引物的位置不同，所以PCR擴增后，產(chǎn)物有不同的末端。 將兩管PCR產(chǎn)物混合、變性、復(fù)性，則每條鏈會與另一管中的互補鏈退火，形成有兩個切口的環(huán)狀DNA，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，這兩個切口均可被修復(fù)。若同一管

24、子中的兩條DNA鏈結(jié)合，會形成線性DNA分子，它不能在大腸桿菌中穩(wěn)定存在，只有環(huán)狀DNA才能在大腸桿菌中穩(wěn)定存在，而絕大多數(shù)的環(huán)狀分子都含有突變基因。,（三）隨機誘變技術(shù),（四）盒式突變技術(shù),常用方法：將基因克隆到質(zhì)粒上，旁邊有兩個緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點，雙酶解后產(chǎn)生一個3凹陷的末端和一個5凹陷的末端，與克隆基因想鄰的末端是3凹陷和5凹陷。,1985年Wells提出的一種基因修飾技術(shù)，可經(jīng)過一次修飾，在一個位點上產(chǎn)生20種不同氨基酸的突變體，從而可以對蛋白質(zhì)分子中某些氨基酸進行“飽和性”分析。,利用定位突變在擬改造的氨基酸密碼兩側(cè)造成兩個原載體和基因上沒有的內(nèi)切酶切點，用該內(nèi)切酶消化基因，

25、再用合成的發(fā)生不同變化的雙鏈DNA片段替代被消化的部分。這樣一次處理就可以得到多種突變型基因。,二、蛋白質(zhì)分子的高級改造（結(jié)構(gòu)域的拼接）,研究證明，在二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間還有一個結(jié)構(gòu)層次，即結(jié)構(gòu)域 結(jié)構(gòu)域由螺旋、折疊等二級結(jié)構(gòu)單位按一定的拓撲學規(guī)則構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)實體。 結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)分子中一種基本的結(jié)構(gòu)單位，結(jié)構(gòu)域拼接是通過基因操作把位于兩種不同蛋白質(zhì)上的幾個結(jié)構(gòu)域連接在一起，形成融合蛋白，它兼有原來兩種蛋白的性質(zhì)。,三、全新蛋白質(zhì)的設(shè)計與構(gòu)建,上述兩種蛋白質(zhì)改造方法，通常是從一個已知順序、結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)出發(fā)，根據(jù)一定的目標和設(shè)計方案，使用多肽合成或者基因工程的方法，改變它的結(jié)構(gòu)，以期達

26、到改變其性質(zhì)的目的。 如果要從頭設(shè)計和構(gòu)建一個自然界不存在的蛋白質(zhì)，則需要借助多功能模板和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)元件組裝成某種具有特定功能的人工蛋白質(zhì)分子。,蛋白質(zhì)工程在食品中的應(yīng)用,蛋白質(zhì)工程自問世以來，短短十幾年的時間，已取得了引人矚目的進展，在醫(yī)學和工業(yè)用酶方面也獲得了良好的應(yīng)用前景。,提高蛋白的穩(wěn)定性包括以下幾個方面： 延長酶的半衰期； 提高酶的熱穩(wěn)定性； 延長藥用蛋白的保存期； 抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失。,一、消除酶的被抑制特性,1985年，美國的埃斯特爾借助寡核苷酸介導(dǎo)的定位突變技術(shù)，用19種其他氨基酸分別替代枯草芽孢桿菌蛋白酶分子第222位殘基上易氧化的Met，獲得了一系列活

27、性差異很大的突變酶。發(fā)現(xiàn)除了用Cys代替Met的突變體以外，其他突變體的酶活性都降低了。,二、引入二硫鍵，改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性,溶菌酶分子：由一條肽鏈構(gòu)成，并在空間上折疊形成二個相對獨立的結(jié)構(gòu)域，酶活性中心位于二個結(jié)構(gòu)域之間。該酶分子在第97位和54位殘基上是兩個未形成二硫鍵的半胱氨酸 由于二硫鍵是一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的重要共價化學鍵，有如建筑所用的鋼筋一樣，因而能將分子中的不同部位牢固地聯(lián)結(jié)在一起。因此，提高酶熱穩(wěn)定性最常用的辦法是在分子中增加一對或數(shù)對二硫鍵。,在高溫下Asn和Gln容易脫氨形成Asp和Glu，而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變，使蛋白質(zhì)失去活性。 對釀酒酵母的磷酸丙糖異構(gòu)酶

28、進行誘變改造。這種酶有兩個相同的亞基，每個亞基含有2個Asn，由于它們都位于亞基之間的界面上，可能對酶的熱穩(wěn)定性起決定性作用。 通過寡核苷酸介導(dǎo)的定向誘變技術(shù)，將第14位和第78位上的2個Asn分別轉(zhuǎn)變成Thr(蘇氨酸)和Ile(異亮氨酸)殘基，大幅度提高突變酶的熱穩(wěn)定性。,三、轉(zhuǎn)化氨基酸殘基，改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性,四、改變酶的最適pH值條件,葡萄糖異構(gòu)酶最適pH為堿性，在80穩(wěn)定，而在堿性條件下， 80時使高果糖漿焦化產(chǎn)生有害物質(zhì)，反應(yīng)只能在60進行。 采用盒式突變技術(shù)將葡萄糖異構(gòu)酶分子中酸性氨基酸(Glu或Asp)集中的區(qū)域置換為堿性氨基酸(Arg或Lys)，可使葡萄糖異構(gòu)酶的最適pH值變?yōu)?/p>

29、酸性，即可在高溫下進行反應(yīng),五、提高酶的催化活性,酶的催化活性由酶分子上的必需基團決定 如對酪氨酸-tRNA合成酶進行定點突變 在天然狀態(tài)下，酪氨酸-tRNA合成酶分子內(nèi)第51位蘇氨酸殘基的羥基能與底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖環(huán)上的氧原子形成氫鍵，這個氫鍵的存在影響酶分子與另一底物ATP的親和力。因此，利用定向誘變技術(shù)將酶分子第51位蘇氨酸殘基改變?yōu)楦彼釟埢?，?Pro-51)與ATP的親和力被增加了近100倍，而且最大反應(yīng)速度亦大幅度提高。,六、修飾酶的催化特異性 利用定點突變技術(shù)葡萄糖淀粉酶的催化特性。如將活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代時，突變體酶分解-1，4糖苷鍵和-1，4

30、糖苷鍵的活性比例發(fā)生明顯改變,七、修飾Nisin的生物防腐效應(yīng) Nisin是乳酸球菌分泌的有較強抗菌作用的小分子肽，可用于罐頭食品、乳制品、肉制品的保藏 Nisin由34個氨基酸殘基構(gòu)成,改變Nisin氨基酸的序列，可增強其穩(wěn)定性、溶解度和擴大抑菌譜等，擴大Nisin的應(yīng)用范圍。,Nisin分子結(jié)構(gòu)中包含5種稀有氨基酸，即ABA、DHA、DHB、ALA-S-ALA和ALA-S-ABA，它們通過硫醚鍵形成五個內(nèi)環(huán)。,蛋白質(zhì)在風味修飾蛋白方面的應(yīng)用,1、物理改性 2、化學改性 （1）堿處理 （2）酸處理 （3）琥珀?；饔?（4）乙酰化作用 （5）磷酸化作用 （6）酰胺化作用 （7）硫醇化作用 （8）酯化作用 （9）糖?；饔?（10）去酰胺基作用,3、酶法改性 4、化學-酶改性作用 5、化學改性及酶法改性限制因素 （如何消除苦味？）,思 考 題 1、什么是蛋白質(zhì)工程? 蛋白質(zhì)工程基本步驟有哪些? 2、蛋白質(zhì)的改性修飾技術(shù)有哪些? 3、如何消除酶水解蛋白質(zhì)的苦味？,