（新課標Ⅱ）2019版高考生物一輪復(fù)習(xí) 專題26 基因工程課件.ppt

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1、第十一單元現(xiàn)代生物科技專題 專題26 基因工程,高考生物 (課標專用),考點1基因工程的工具與操作程序,五年高考,1.(2017北京理綜,5,6分)為了增加菊花花色類型,研究者從其他植物中克隆出花色基因C(圖1),擬將其與質(zhì)粒(圖2)重組,再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。 下列操作與實驗?zāi)康牟环氖?) A.用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒 B.用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織,將C基因?qū)爰毎?C.在培養(yǎng)基中添加卡那霉素,篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細胞 D.用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上,答案C本題主要考查基因工程的相關(guān)知識。由于C基因兩端及質(zhì)粒上均存在限制酶EcoR的酶切位

2、點,因此,可采用限制酶EcoR和DNA連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒;用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織(即農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法),可以將C基因?qū)爰毎?由于質(zhì)粒上存在潮霉素抗性基因(標記基因),因此,可以在培養(yǎng)基中添加潮霉素,篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細胞,C符合題意;可用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上。,2.(2018課標,38,15分)回答下列問題: (1)博耶(H. Boyer)和科恩(S. Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細胞中進行了表達。該研究除證明了質(zhì)?？梢宰鳛檩d體外,還證明了(答出兩點即可)。 (2)體外重組的質(zhì)?？赏ㄟ^Ca2+參與的方法導(dǎo)入大腸桿菌細胞;而體外重組

3、的噬菌體DNA通常需與組裝成完整噬菌體后,才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導(dǎo)入宿主細胞。在細菌、心肌細胞、葉肉細胞中,可作為重組噬菌體宿主細胞的是。 (3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細胞內(nèi)表達時,表達出的蛋白質(zhì)可能會被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解,在實驗中應(yīng)選用的大腸桿菌作為受體細胞,在蛋白質(zhì)純化的過程中應(yīng)添加的抑制劑。,答案(1)體外重組的質(zhì)粒可以進入受體細胞;真核生物基因可在原核細胞中表達(2)轉(zhuǎn)化外殼蛋白(或答噬菌體蛋白)細菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶,解析本題主要考查基因工程的相關(guān)知識。(1)體外重組的質(zhì)?？梢赃M入受體細胞,且重組質(zhì)粒在不同細胞中能正常表達,說明目的基因在不同細

4、胞中的表達機制相同,生物界共用一套遺傳密碼。(2)基因工程中,受體細胞為大腸桿菌細胞時,常用Ca2+處理大腸桿菌,使之處于感受態(tài),即Ca2+參與的轉(zhuǎn)化法。噬菌體DNA與外殼蛋白組裝成完整噬菌體。因噬菌體的宿主是細菌,故只有細菌可作為重組噬菌體的宿主細胞。(3)為防止目的基因表達的蛋白質(zhì)被破壞,可選用不能合成蛋白酶的大腸桿菌作為受體細胞,在蛋白質(zhì)純化過程中加入蛋白酶的抑制劑可以保護蛋白質(zhì)不被水解。,,知識歸納目的基因?qū)胧荏w細胞的方法 (1)若受體細胞為植物細胞:基因槍法、花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。 (2)若受體細胞為動物細胞:顯微注射法。 (3)若受體細胞為大腸桿菌:感受態(tài)細胞法。,,3.(

5、2018天津理綜,10,14分)甲型流感病毒為RNA病毒,易引起流感大規(guī)模流行。我國科學(xué)家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法,主要環(huán)節(jié)如下。 (1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主細胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄成對應(yīng)DNA后,利用技術(shù)擴增,并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比,改造后的基因表達時不能合成完整長度的,因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原等其他基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒,并保存。 (2)構(gòu)建適合改造病毒增殖的轉(zhuǎn)基因宿主細胞。設(shè)計合成一種特殊tRNA的基因,其產(chǎn)物的反密碼子能與(1

6、)中的終止密碼子配對結(jié)合,并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與連接后導(dǎo)入宿主細胞。提取宿主細胞的進行分子雜交鑒定,篩選獲得成功表達上述tRNA的轉(zhuǎn)基因宿主細胞。 (3)利用轉(zhuǎn)基因宿主細胞制備疫苗。將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細胞,并在補加的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),則該宿主細胞能利用上述特殊tRNA,翻譯出改造病毒基因的完整蛋白,產(chǎn)生大量子代病毒,用于制備疫苗。,特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄時,識別其啟動子的酶是(單選)。 A.病毒的DNA聚合酶 B.宿主的DNA聚合酶 C.病毒的RNA聚合酶 D.宿主的RNA聚合酶 (4)上述子代病毒不能在正常宿主細胞中增殖,沒有致病性,因此不經(jīng)滅

7、活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比,該病毒活疫苗的優(yōu)勢之一是可引起免疫,增強免疫保護效果。,答案(1)PCR多肽(或蛋白質(zhì)) (2)載體總RNA (3)非天然氨基酸(Uaa)D (4)細胞,,解析本題主要考查基因工程的相關(guān)知識。(1)利用PCR技術(shù)體外擴增DNA。若將基因中個別編碼氨基酸的序列替換為編碼終止密碼子的序列,則改造后的基因轉(zhuǎn)錄合成的mRNA中,終止密碼子提前出現(xiàn),將不能控制合成完整長度的多肽(或蛋白質(zhì))。(2)目的基因只有與載體連接后才能導(dǎo)入宿主細胞?？商崛∷拗骷毎目俁NA進行分子雜交鑒定,以篩選獲得成功表達題述tRNA的轉(zhuǎn)基因宿主細胞。(3)由(2)知,轉(zhuǎn)

8、基因宿主細胞含有的特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄的tR-NA,該tRNA的反密碼子可與終止密碼子配對,并可攜帶非天然氨基酸(Uaa),所以培養(yǎng)基中需補加非天然氨基酸(Uaa)。病毒中的基因進行轉(zhuǎn)錄時,識別其啟動子的酶是宿主的RNA聚合酶。(4)因該病毒疫苗具有侵染性,故可引起細胞免疫。,疑難突破1.由(1)中“個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列”可知,改造后的基因表達時不能合成完整長度的多肽。,2.由(2)中特殊tRNA能與終止密碼子配對結(jié)合,并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)可知,轉(zhuǎn)基因宿主細胞可利用非天然氨基酸Uaa,所以培養(yǎng)基中需加入非天然氨基酸Uaa。,3.滅活了的病毒已不具有侵染性

9、,因此,只能引起體液免疫;而具侵染性的病毒可引起細胞免疫。,,4.(2018江蘇單科,32,8分)為生產(chǎn)具有特定性能的-淀粉酶,研究人員從某種海洋細菌中克隆了-淀粉酶基因(1 656個堿基對),利用基因工程大量制備-淀粉酶,實驗流程見圖。請回答下列問題: (1)利用PCR技術(shù)擴增-淀粉酶基因前,需先獲得細菌的。 (2)為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接,需在引物的端加上限制性酶切位點,且常在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點,主要目的是。 (3)進行擴增時,反應(yīng)的溫度和時間需根據(jù)具體情況進行設(shè)定,下列選項中的設(shè)定與引物,有關(guān),的設(shè)定與擴增片段的長度有關(guān)。(填序號) 變性溫度退火溫度延伸

10、溫度變性時間 退火時間延伸時間 (4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼-淀粉酶的mRNA 的部分堿基序列: 5-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU-3 圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含個密碼子,如虛線框后的序列未知,預(yù)測虛線框后的第一個密碼子最多有種。 (5)獲得工程菌表達的-淀粉酶后,為探究影響酶活性的因素,以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測定酶活性,結(jié)果如下:,根據(jù)上述實驗結(jié)果,初步判斷該-淀粉酶活性最高的條件為。,答案(1)基因組DNA(2)5使DNA片段能定向插入表達載體,減少自連(3)(4)813(5)pH為8.5,緩沖液為50 mmol/L Tirs-HCl,,解析(1)由

11、題干信息可知某種海洋細菌含有-淀粉酶基因,因此在擴增-淀粉酶基因前需先從細菌中提取細菌的基因組DNA。(2)由于引物的作用是引導(dǎo)子鏈的延伸,將脫氧核苷酸連接到引物上時,是與引物的3端相連的,由此確定需在引物的5端加上限制性酶切位點。常在兩條引物上加入不同的限制酶切位點的主要目的是使DNA片段能定向插入表達載體,防止自身相連。(3)進行PCR擴增時,退火的溫度與引物長短和堿基種類有關(guān)。延伸時間長短的設(shè)定與擴增片段的長度有關(guān)。(4)密碼子是指mRNA上決定一個氨基酸的三個相鄰的堿基,該mRNA上5端為AUG(起始密碼子),因此可依據(jù)三個堿基是一個密碼子來分析圖中虛線框中的堿基,可得出共有8個密碼子

12、。由于虛線框后的第一個密碼子已經(jīng)固定為U,因此還有2個堿基未知,共可能有的種數(shù)為44=16,又因為UAG、UGA、UAA為終止密碼子,因此決定氨基酸的密碼子最多有13種。(5)據(jù)表格數(shù)據(jù)可知:-淀粉酶在pH為8.5、緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl的條件下相對活性為99.5%,初步判斷此條件下酶活性最高。,5.(2017課標,38,15分)幾丁質(zhì)是許多真菌細胞壁的重要成分,幾丁質(zhì)酶可催化幾丁質(zhì)水解。通過基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi),可增強其抗真菌病的能力。回答下列問題: (1)在進行基因工程操作時,若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA,常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料,原因

13、是。提取RNA時,提取液中需添加RNA酶抑制劑,其目的是。 (2)以mRNA為材料可以獲得cDNA,其原理是。 (3)若要使目的基因在受體細胞中表達,需要通過質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細胞,原因是(答出兩點即可)。 (4)當(dāng)幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體連接時,DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是。 (5)若獲得的轉(zhuǎn)基因植株(幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒有提高,根據(jù)中心法則分析,其可能的原因是。,答案(1)嫩葉組織細胞易破碎防止RNA降解(2)在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA(3)目的基因無復(fù)制原點;目的基因無表達所需啟動子(4)

14、磷酸二酯鍵(5)目的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異常,解析本題主要考查基因工程的相關(guān)知識,考查學(xué)生獲取知識,分析與歸納知識等能力。(1)從植物體中提取mRNA需要破碎組織細胞,嫩葉比老葉的組織細胞易破碎,mRNA提取效率高。由于植物組織中存在的RNA酶能將RNA分解,所以實驗過程中要添加RNA酶抑制劑以降低RNA酶的活性,保護提取的RNA不被分解。(2)cDNA是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以mRNA為模板,按照堿基互補配對的原則合成的。(3)由于目的基因無復(fù)制原點,也無基因表達所需的啟動子和終止子,所以需與質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒后再導(dǎo)入受體細胞。(4)DNA連接酶可以催化兩個DNA片段的黏性末端或平末端連接形成磷酸二

15、酯鍵。(5)幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)整合到植物的基因組中,但是轉(zhuǎn)基因植株抗真菌病的能力沒有提高,說明轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)不存在抗菌活性蛋白,即幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程出現(xiàn)異常,從而導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶基因沒有正常表達合成抗菌活性蛋白。,,6.(2017課標,38,15分)編碼蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五個片段組成,編碼蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段組成,如圖1所示。 回答下列問題: (1)現(xiàn)要通過基因工程的方法獲得蛋白乙,若在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCTCAGGAAGGA),則所構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞后不能翻譯出蛋白乙,原因是。 (2)某同學(xué)在用P

16、CR技術(shù)獲取DNA片段B或D的過程中,在PCR反應(yīng)體系中加入了DNA聚合,酶、引物等,還加入了序列甲作為,加入了作為合成DNA的原料。 (3)現(xiàn)通過基因工程方法獲得了甲、乙、丙三種蛋白,要鑒定這三種蛋白是否具有刺激T淋巴細胞增殖的作用,某同學(xué)做了如下實驗:將一定量的含T淋巴細胞的培養(yǎng)液平均分成四組,其中三組分別加入等量的蛋白甲、乙、丙,另一組作為對照,培養(yǎng)并定期檢測T淋巴細胞濃度,結(jié)果如圖2。 由圖2可知:當(dāng)細胞濃度達到a時,添加蛋白乙的培養(yǎng)液中T淋巴細胞濃度不再增加,此時若要使T淋巴細胞繼續(xù)增殖,可采用的方法是。細胞培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度,CO2的作用是。 僅根據(jù)圖1

17、、圖2可知,上述甲、乙、丙三種蛋白中,若缺少(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所編碼的肽段,則會降低其刺激T淋巴細胞增殖的效果。,答案(1)編碼乙的DNA序列起始端無ATG,轉(zhuǎn)錄出的mRNA無起始密碼子(2)模板dNTP(3)進行細胞傳代培養(yǎng)維持培養(yǎng)液的pHC,解析本題主要考查基因工程技術(shù)和動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的相關(guān)知識。(1)由題干中編碼蛋白乙的DNA序列可知,編碼乙的DNA序列起始端無ATG,轉(zhuǎn)錄出的mRNA上沒有起始密碼子AUG。(2)PCR需要的條件包括引物、耐高溫的DNA聚合酶、DNA模板、四種游離的脫氧核苷酸等。(3)動物細胞培養(yǎng)中,細胞具有貼壁生長以及接觸抑制的特點,當(dāng)細胞濃

18、度達到a時,若要使T淋巴細胞繼續(xù)增殖,需要在培養(yǎng)基中加入胰蛋白酶(或膠原蛋白酶)處理貼壁生長的細胞并分瓶進行傳代培養(yǎng);動物細胞培養(yǎng)過程中,需要在培養(yǎng)箱中通入一定濃度的CO2,CO2的作用是維持培養(yǎng)液的pH。由圖2可知,加入蛋白丙刺激T淋巴細胞增殖的效果明顯比加入蛋白甲、乙時低;結(jié)合圖1中蛋白丙與蛋白甲、乙的DNA序列可知,缺少C片段所編碼的肽段,會明顯降低蛋白刺激T淋巴細胞增殖的效果。,,知識拓展認識dNTP dNTP是脫氧核糖核苷三磷酸的縮寫,是dCTP、dATP、dGTP、dTTP的統(tǒng)稱?！癲”代表脫氧,“N”代表變量A、T、C、G中的一種。dNTP可作為生物DNA合成以及PCR過程的原料

19、。,,7.(2017天津理綜,9)玉米自交系(遺傳穩(wěn)定的育種材料)B具有高產(chǎn)、抗病等優(yōu)良性狀,但難以直接培育成轉(zhuǎn)基因植株,為使其獲得抗除草劑性狀,需依次進行步驟、試驗。 .獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米自交系A(chǔ),技術(shù)路線如下圖。 (1)為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化,構(gòu)建表達載體需用2種限制酶,選擇的原則是(單選)。 Ti質(zhì)粒內(nèi),每種限制酶只有一個切割位點 G基因編碼蛋白質(zhì)的序列中,每種限制酶只有一個切割位點 酶切后,G基因形成的兩個黏性末端序列不相同 酶切后,Ti質(zhì)粒形成的兩個黏性末端序列相同 A.B.C.D.,(2)下表是4種玉米自交系幼胚組織培養(yǎng)不同階段的結(jié)果。據(jù)表可知,細胞脫分化時使用的激素是,自交系

20、的幼胚最適合培養(yǎng)成愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體。,(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化愈傷組織時,T-DNA攜帶插入其內(nèi)的片段轉(zhuǎn)移到受體細胞。篩選轉(zhuǎn)化的愈傷組織,需使用含的選擇培養(yǎng)基。 (4)轉(zhuǎn)化過程中,愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌,導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化愈傷組織也可能在選擇培養(yǎng)基上生長。含有內(nèi)含子的報告基因只能在真核生物中正確表達,其產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍色。用K分別處理以下愈傷組織,出現(xiàn)藍色的是(多選)。 A.無農(nóng)桿菌附著的未轉(zhuǎn)化愈傷組織,B.無農(nóng)桿菌附著的轉(zhuǎn)化愈傷組織 C.農(nóng)桿菌附著的未轉(zhuǎn)化愈傷組織 D.農(nóng)桿菌附著的轉(zhuǎn)化愈傷組織 (5)組織培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)基因植株(核DNA中僅插入一個G基因)進行自交,在子代含G基因的植株中,純合

21、子占。繼續(xù)篩選,最終選育出抗除草劑純合自交系A(chǔ)。,答案(1)A(2)2,4-D乙(3)除草劑(4)BD(5),,解析(1)利用雙酶切可有效防止出現(xiàn)限制酶切割后的產(chǎn)物(目的基因、載體)發(fā)生自身環(huán)化及目的基因與載體的任意連接現(xiàn)象。這要求每種限制酶在Ti質(zhì)粒內(nèi)只有一個切割位點,含目的基因的DNA片段被兩種限制酶切割形成的黏性末端堿基序列不同。(2)細胞脫分化形成愈傷組織。表格信息顯示,使用了2,4-D促使細胞脫分化。作為轉(zhuǎn)化受體的幼胚,不僅要易脫分化,而且還要易再分化生芽、生根,故乙的幼胚最適合培養(yǎng)成愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體。(3)構(gòu)建的基因表達載體中有抗生素抗性基因和除草劑抗性基因(除草劑抗性基因位于

22、T-DNA片段上),因利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)基因時,只有T-DNA整合到植物細胞染色體DNA上,故需使用含除草劑的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化的愈傷組織。(4)因“含有內(nèi)含子的報告基因只能在真核生物中正確表達”,只有細胞內(nèi)含有報告基因(成功轉(zhuǎn)化)的愈傷組織,用K處理后出現(xiàn)藍色,故選BD。(5)轉(zhuǎn)基因植株相當(dāng)于攜帶G基因的雜合子,轉(zhuǎn)基因植株自交,后代有3/4植株攜帶G 基因,其中純合子占1/3。,易錯警示轉(zhuǎn)基因植物培育過程中,篩選成功轉(zhuǎn)化的植物受體細胞的標準 利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法完成植物細胞轉(zhuǎn)基因時,因只有Ti質(zhì)粒的T-DNA整合到受體細胞染色體DNA上,故篩選轉(zhuǎn)化的植物受體細胞只能借助T-DNA片段上的特殊基因作為

23、篩選標準,而Ti質(zhì)粒上的非T-DNA片段未導(dǎo)入植物受體細胞,在對轉(zhuǎn)化后的受體細胞篩選時不以此作為選擇標準。,,8.(2017江蘇單科,33,8分)金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白,某研究小組計劃通過多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增獲得目的基因,構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌,用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴增過程示意圖如下,請回答下列問題: (1)從高表達MT蛋白的生物組織中提取mRNA,通過獲得用于PCR擴增。 (2)設(shè)計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2),為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒,在引物,中需要增加適當(dāng)?shù)奈稽c。設(shè)計引物時需要避免引物之間形成,而造成引物自連。 (3)圖中步驟1代

24、表,步驟2代表退火,步驟3代表延伸,這三個步驟組成一輪循環(huán)。 (4)PCR擴增時,退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過高會破壞的堿基配對。退火溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān),長度相同但的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。 (5)如果PCR反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物,則可以采取的改進措施有(填序號:升高退火溫度降低退火溫度重新設(shè)計引物)。,答案(1)逆轉(zhuǎn)錄cDNA(2)限制性核酸內(nèi)切酶堿基互補配對(3)變性(4)引物與模板GC含量高(5),,解析本題主要考查目的基因的獲取及PCR技術(shù)的有關(guān)知識。(1)依據(jù)題中表述現(xiàn)象分析,mRNA合成目的基因的過程應(yīng)為逆轉(zhuǎn)錄過程,由mRNA直接逆轉(zhuǎn)錄形成的DNA為c

25、DNA。 (2)構(gòu)建重組質(zhì)粒時需要限制酶和DNA連接酶,因此推測在引物中需要增加適當(dāng)?shù)南拗泼缸R別的位點。設(shè)計引物時需要注意避免引物1和引物2之間形成堿基互補配對。(3)圖中步驟1代表變性。(4)退火溫度過高會破壞引物與模板鏈之間的堿基互補配對。由于含G/C堿基對多的DNA穩(wěn)定性強,因此在PCR過程中設(shè)置的溫度應(yīng)視G/C的含量而定。(5)溫度過高不利于引物與模板結(jié)合;引物設(shè)計不合理也會影響PCR擴增反應(yīng)。,知識歸納關(guān)于引物的幾個問題:引物是一小段DNA或RNA,它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對,其長度通常為2030個核苷酸。由于PCR利用了DNA的熱變性原理,因此溫度的高低直接影響DNA變

26、性、復(fù)性和延伸的過程,特別是復(fù)性的過程即題中的退火過程,它關(guān)乎引物是否能與模板鏈結(jié)合,只有結(jié)合后才有可能進行“延伸”。結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)特點,A與T之間有2個氫鍵、C與G之間有3個氫鍵的知識分析,引物中含有的堿基不同耐溫程度不同,其中含C/G較多的引物,PCR擴增時溫度可適當(dāng)提高。,,9.(2016課標,40,15分,0.587)某一質(zhì)粒載體如圖所示,外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因,Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamH酶切后,與用BamH酶切獲得的目的基因混合,加入DNA連接酶進行連接反應(yīng),用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌

27、。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化,有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種,分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}: (1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具,應(yīng)具備的基本條件有(答出兩點即可),而,作為基因表達載體,除滿足上述基本條件外,還需具有啟動子和終止子。 (2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選,在上述四種大腸桿菌細胞中,未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的,其原因是;并且和的細胞也是不能區(qū)分的,其原因是。在上述篩選的基礎(chǔ)上,若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落,還需使用含有的固體培養(yǎng)基。 (3)基因工程中,某些噬菌體經(jīng)改造

28、后可以作為載體,其DNA復(fù)制所需的原料來自。,答案(1)能自我復(fù)制、具有標記基因 (2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因,在該培養(yǎng)基上均不生長含有質(zhì)粒載體含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或答含有重組質(zhì)粒)二者均含有氨芐青霉素抗性基因,在該培養(yǎng)基上均能生長四環(huán)素 (3)受體細胞,,解析(1)質(zhì)粒作為載體應(yīng)具備的基本條件有:能自我復(fù)制、具有標記基因、含有一至多個限制酶切割位點等。(2)由題意可知,未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞中均不含有氨芐青霉素抗性基因,所以在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上均不能生長。質(zhì)粒載體上含有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因,插入了目的基因的重組質(zhì)粒中僅含有氨芐青霉素抗性基因,

29、所以含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的細胞均能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長,但前者可以在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長而后者不能,所以可用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基,篩選出含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落。(3)噬菌體屬于病毒,病毒增殖過程中所需的原料、酶等均來自受體細胞。,評分細則(1)能自我復(fù)制(具有復(fù)制原點,具有復(fù)制起始位點),具有標記基因(具有抗性基因),具有限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(限制酶酶切位點),以上每個得分點2分,任選2個即可得4分,答出一點給2分。 (2)二者均不含氨芐青霉素抗性基因Ampr,在該培養(yǎng)基上均不生長(2分),不含抗性基因為關(guān)鍵詞。含有質(zhì)粒載體(2分),

30、含插入了目的基因的重組質(zhì)粒(含重組質(zhì)粒)(2分),此兩問不分先后順序。二者均含氨芐青霉素抗性基因Ampr,在該培養(yǎng)基上均能生長(2分),含有抗性基因為關(guān)鍵詞。四環(huán)素/Tetr(1分),中英文均可得分。 (3)受體細胞/宿主細胞(2分)。,,10.(2016課標,40,15分,0.442)圖(a)中的三個DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三種限制性內(nèi)切酶的識別序列與切割位點,圖(b)為某種表達載體的示意圖(載體上的EcoR、Sau3A的切點是唯一的)。 圖(a) 圖(b),根據(jù)基因工程的有關(guān)知識,回答下列問題: (1)經(jīng)BamH酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被酶切后的

31、產(chǎn)物連接,理由是。 (2)若某人利用圖(b)所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子,如圖(c)所示。這三種重組子中,不能在宿主細胞中表達目的基因產(chǎn)物的有,不能表達的原因是。 圖(c),(3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶,常見的有和,其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是。,答案(1)Sau3A兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙甲中目的基因插在啟動子的上游,丙中目的基因插在終止子的下游,二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄(其他合理答案可酌情給分) (3)EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶(其他合理答案可酌情給分),,解析(1)分析圖(

32、a)可知,限制酶Sau3A與BamH切割DNA后形成的黏性末端相同,故經(jīng)這兩種酶切割得到的產(chǎn)物可以用DNA連接酶進行連接。(2)構(gòu)建基因表達載體時,為保證目的基因能在宿主細胞中成功表達,目的基因應(yīng)插在啟動子和終止子之間,據(jù)此可判斷甲、丙均不符合要求,目的基因均不能表達。(3)常見的DNA連接酶有EcoliDNA連接酶和T4DNA連接酶,其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。,評分細則(1)第一空答其他兩種酶不給分。第二空答“兩種酶切割后形成的黏性末端可互補”給全分。 (2)第二空原因答作“目的基因應(yīng)插至啟動子與終止子之間”也給分。 (3)第一空、第二空順序可顛倒,第三空答案唯一。

33、,,11.(2016天津理綜,7,12分)人血清白蛋白(HSA)具有重要的醫(yī)用價值,只能從人血漿中制備。如圖是以基因工程技術(shù)獲取重組HSA(rHSA)的兩條途徑。 (1)為獲取HSA基因,首先需采集人的血液,提取合成總cDNA,然后以cDNA為模板,使用PCR技術(shù)擴增HSA基因。下圖中箭頭表示一條引物結(jié)合模板的位置及擴增方向,請用箭頭在方框內(nèi)標出另一條引物的位置及擴增方向。 (2)啟動子通常具有物種及組織特異性,構(gòu)建在水稻胚乳細胞內(nèi)特異表達rHSA的載體,需要選擇的啟動子是(填寫字母,單選)。 A.人血細胞啟動子B.水稻胚乳細胞啟動子 C.大腸桿菌啟動子D.農(nóng)桿菌啟動子,(3)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水

34、稻受體細胞的過程中,需添加酚類物質(zhì),其目的是。 (4)人體合成的初始HSA多肽,需要經(jīng)過膜系統(tǒng)加工形成正確空間結(jié)構(gòu)才有活性。與途徑相比,選擇途徑獲取rHSA的優(yōu)勢是。 (5)為證明rHSA具有醫(yī)用價值,須確認rHSA與的生物學(xué)功能一致。,答案(1)總RNA(或mRNA) (2)B (3)吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體細胞,有利于目的基因成功轉(zhuǎn)化 (4)水稻是真核生物,具有膜系統(tǒng),能對初始rHSA多肽進行高效加工 (5)HSA,,解析本題主要考查基因工程的相關(guān)知識。(1)總cDNA是以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成的,所以需要提取人的總RNA或mRNA;PCR擴增的原理是DNA復(fù)制,DNA復(fù)制時,兩條子鏈的延

35、伸方向相反,所以引物的位置及方向如答案所示。(2)要使rHSA基因在水稻胚乳細胞內(nèi)特異性表達,需要選擇水稻胚乳細胞的啟動子。(3)酚類物質(zhì)可吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體細胞,使農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移到受體細胞并整合到受體細胞染色體的DNA上,有利于目的基因成功轉(zhuǎn)化。(4)大腸桿菌為原核生物,無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,不能對多肽進行高效加工,而水稻是真核生物,具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,可對多肽鏈進行高效加工。(5)要證明rHSA具有醫(yī)用價值,須確認rHSA與HSA的生物學(xué)功能一致。,易錯警示注意PCR技術(shù)的原理是DNA復(fù)制,DNA復(fù)制時,兩條母鏈分別作為模板,新合成的兩條子鏈延伸的方向相反,由此確定引

36、物的位置及擴增方向。,,12.(2015重慶理綜,6,6分)下列有關(guān)人胰島素基因表達載體的敘述,正確的是() A.表達載體中的胰島素基因可通過人肝細胞mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得 B.表達載體的復(fù)制和胰島素基因的表達均啟動于復(fù)制原(起)點 C.借助抗生素抗性基因可將含胰島素基因的受體細胞篩選出來 D.啟動子和終止密碼子均在胰島素基因的轉(zhuǎn)錄中起作用,以下為教師用書專用,答案C由于人肝細胞中胰島素基因不能表達,所以無法利用肝細胞mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得胰島素基因,A項錯誤;表達載體的復(fù)制啟動于復(fù)制原點,胰島素基因的轉(zhuǎn)錄啟動于啟動子,B項錯誤;抗生素抗性基因是標記基因,作用是檢測受體細胞中是否含有目的基因,從而將含

37、有胰島素基因的受體細胞篩選出來,C項正確;啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,是轉(zhuǎn)錄的起點,而終止密碼子位于mRNA上 ,在翻譯中起作用,D項錯誤。,,13.(2014天津理綜,4,6分)為達到相應(yīng)目的,必須通過分子檢測的是() A.攜帶鏈霉素抗性基因受體菌的篩選 B.產(chǎn)生抗人白細胞介素-8抗體的雜交瘤細胞的篩選 C.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定 D.21三體綜合征的診斷,答案B根據(jù)受體菌是否對鏈霉素產(chǎn)生抗性進行攜帶鏈霉素抗性基因受體菌的篩選,不需要分子檢測,A錯誤;用特定選擇培養(yǎng)基篩選出的雜交瘤細胞,還需要進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測,才能獲得足夠多的能分泌抗人白細胞介素-8抗體的雜交瘤細胞

38、,B正確;轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是否具有抗蟲特性,需要做抗蟲的接種實驗,C錯誤;21三體綜合征可通過用顯微鏡直接觀察體細胞中的21號染色體數(shù)目的方法進行檢測,D錯誤。,,14.(2014重慶理綜,4,6分)如圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關(guān)敘述,正確的是(),A.的構(gòu)建需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA聚合酶參與 B.侵染植物細胞后,重組Ti質(zhì)粒整合到的染色體上 C.的染色體上若含抗蟲基因,則就表現(xiàn)出抗蟲性狀 D.只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異,答案D的構(gòu)建需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶參與,A錯誤;侵染植物細胞后,通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用,使目的基因進入植物細胞并整合到的染色體上

39、,B錯誤;的染色體上含有目的基因(抗蟲基因)但不一定表達,C錯誤;基因工程依據(jù)的原理是基因重組,基因重組屬于可遺傳變異,D正確。,,15.(2014廣東理綜,25,6分)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)羧酸酯酶(CarE)制劑的流程如圖所示,下列敘述正確的是(雙選)() A.過程需使用逆轉(zhuǎn)錄酶 B.過程需使用解旋酶和PCR獲取目的基因 C.過程使用的感受態(tài)細胞可用NaCl溶液制備 D.過程可利用DNA分子雜交鑒定目的基因是否已導(dǎo)入受體細胞,答案AD由mRNA形成cDNA需要逆轉(zhuǎn)錄酶,A正確;過程需要使用限制酶和PCR技術(shù)獲得并擴增目的基因,B錯誤;過程使用的感受態(tài)細胞可用CaCl2溶液制備,C錯誤;工程菌

40、是指用基因工程方法,使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系,所以過程可利用DNA分子雜交鑒定目的基因是否已導(dǎo)入受體細胞,D正確。,,16.(2013江蘇單科,22,3分)小鼠雜交瘤細胞表達的單克隆抗體用于人體試驗時易引起過敏反應(yīng),為了克服這個缺陷,可選擇性擴增抗體的可變區(qū)基因(目的基因)后再重組表達。下列相關(guān)敘述正確的是(多選)() A.設(shè)計擴增目的基因的引物時不必考慮表達載體的序列 B.用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列 C.PCR體系中一定要添加從受體細胞中提取的DNA聚合酶 D.一定要根據(jù)目的基因編碼產(chǎn)物的特性選擇合適的受體細胞,答案BD本題主要考查PCR技術(shù)的有關(guān)知識。利用

41、PCR技術(shù)擴增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根據(jù)這一序列設(shè)計引物,但不需知道目的基因的全部序列,需要考慮載體的序列;因PCR反應(yīng)在高溫條件下進行,故反應(yīng)體系中需加入耐高溫的DNA聚合酶;因某些目的基因編碼的產(chǎn)物需經(jīng)特殊的加工修飾過程,故一定要根據(jù)目的基因編碼產(chǎn)物的特性選擇合適的受體細胞。,,17.(2012浙江理綜,6,6分)天然的玫瑰沒有藍色花,這是由于缺少控制藍色色素合成的基因B,而開藍色花的矮牽牛中存在序列已知的基因B?，F(xiàn)用基因工程技術(shù)培育藍玫瑰,下列操作正確的是() A.提取矮牽牛藍色花的mRNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得互補的DNA,再擴增基因B B.利用限制性核酸內(nèi)切酶

42、從開藍色花矮牽牛的基因文庫中獲取基因B C.利用DNA聚合酶將基因B與質(zhì)粒連接后導(dǎo)入玫瑰細胞 D.將基因B直接導(dǎo)入大腸桿菌,然后感染并轉(zhuǎn)入玫瑰細胞,答案A此題考查基因工程及其應(yīng)用的相關(guān)知識。獲取目的基因B,可先提取矮牽牛藍色花的mRNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得互補的DNA,再經(jīng)PCR技術(shù)擴增,A正確;基因文庫構(gòu)建時是將目的基因與載體連接起來,形成重組載體,再導(dǎo)入受體菌中儲存和擴增,提取目的基因時不需使用限制酶,B錯誤;連接目的基因與質(zhì)粒的酶是DNA連接酶,C錯誤;將目的基因?qū)胫参锛毎?常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,不使用大腸桿菌,D錯誤。,,18.(2015海南單科,31,15分)在體內(nèi),人胰島素基因表達可合成出

43、一條稱為前胰島素原的肽鏈,此肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)酶甲切割掉氨基端一段短肽后成為胰島素原,進入高爾基體的胰島素原經(jīng)酶乙切割去除中間片段C后,產(chǎn)生A、B兩條肽鏈,再經(jīng)酶丙作用生成由51個氨基酸殘基組成的胰島素。目前,利用基因工程技術(shù)可大量生產(chǎn)胰島素。回答下列問題: (1)人體內(nèi)合成前胰島素原的細胞是,合成胰高血糖素的細胞是。 (2)可根據(jù)胰島素原的氨基酸序列,設(shè)計并合成編碼胰島素原的序列,用該序列與質(zhì)粒表達載體構(gòu)建胰島素原基因重組表達載體,再經(jīng)過細菌轉(zhuǎn)化、篩選及鑒定,即可建立能穩(wěn)定合成的基因工程菌。 (3)用胰島素原抗體檢測該工程菌的培養(yǎng)物時,培養(yǎng)液無抗原抗體反應(yīng),菌體有抗原抗體反應(yīng),則用該工程菌進行

44、工業(yè)發(fā)酵時,應(yīng)從中分離、純化胰島素原。胰島素原經(jīng)酶處理便可轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素。,答案(1)胰島B細胞胰島A細胞 (2)DNA胰島素原 (3)菌體,解析(1)人體合成前胰島素原的細胞是胰島B細胞,合成胰高血糖素的細胞是胰島A細胞。(2)蛋白質(zhì)工程生產(chǎn)胰島素時,需根據(jù)胰島素原的氨基酸序列,設(shè)計并合成編碼胰島素原的脫氧核苷酸序列(目的基因),然后再構(gòu)建胰島素原基因重組表達載體,導(dǎo)入細菌細胞內(nèi),再經(jīng)過細菌轉(zhuǎn)化、篩選及鑒定,即可建立能穩(wěn)定合成胰島素原的工程菌。(3)運用抗原抗體檢測法檢測胰島素原時,培養(yǎng)液無抗原抗體反應(yīng),菌體有抗原抗體反應(yīng),故應(yīng)從菌體中分離、純化胰島素原。,,19.(2014課標,40,15分

45、,0.5599)植物甲具有極強的耐旱性,其耐旱性與某個基因有關(guān)。若從該植物中獲得該耐旱基因,并將其轉(zhuǎn)移到耐旱性低的植物乙中,有可能提高后者的耐旱性。 回答下列問題: (1)理論上,基因組文庫含有生物的基因;而cDNA文庫中含有生物的基因。 (2)若要從植物甲中獲得耐旱基因,可首先建立該植物的基因組文庫,再從中出所需的耐旱基因。 (3)將耐旱基因?qū)朕r(nóng)桿菌,并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入植物的體細胞中,經(jīng)過一系列的過程得到再生植株。要確認該耐旱基因是否在再生植株中正確表達,應(yīng)檢測此再生植株中該基因的,如果檢測結(jié)果呈陽性,再在田間試驗中檢測植株的是否得到提高。 (4)假如用得到的二倍體轉(zhuǎn)基因耐旱植株自

46、交,子代中耐旱與不耐旱植株的數(shù)量比為31時,則可推測該耐旱基因整合到了(填“同源染色體的一條上”或“同源染色體的兩條上”)。,答案(1)全部部分(其他合理答案也給分) (2)篩選(其他合理答案也給分) (3)乙表達產(chǎn)物(其他合理答案也給分)耐旱性 (4)同源染色體的一條上,解析(1)基因組文庫包含某種生物的全部基因,cDNA文庫又稱為部分基因文庫,含有生物的部分基因。(2)植物甲基因組文庫中有該種植物的全部基因,從中可篩選出耐旱基因。(3)植物乙的耐旱性低,所以植物乙體細胞作為受體細胞;要確定耐旱基因是否正確表達,應(yīng)檢測該基因的表達產(chǎn)物,對于個體水平的檢測,應(yīng)在干旱的田間進行試驗,檢測植物乙耐

47、旱性是否得到了提高。(4)將耐旱基因看作A,不耐旱基因看作a,AaAa耐旱與不耐旱數(shù)量比為31,則耐旱基因整合到了同源染色體的一條上。,,評分細則(1)全部(2 分),答“所有、全套、整套”也得分。 部分(2 分)。 (2)篩選(2 分)(篩選中“篩”有別字扣一分),答“選擇”也得分。 (3)乙(2 分);表達產(chǎn)物(2 分),答“轉(zhuǎn)錄和翻譯的產(chǎn)物”得分,只答出“轉(zhuǎn)錄”或“翻譯”不得分。 (4)同源染色體的一條上(3 分)。,,20.(2016江蘇單科,33,9分)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點,圖1、圖2中標注了相關(guān)限制酶的酶切位點,其中切割位點相同的酶不重復(fù)標注。請回答下列問題:,圖1

48、,圖2 (1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒,應(yīng)選用兩種限制酶切割,酶切后的載體和目的基因片段,通過酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴增重組質(zhì)粒,需將其轉(zhuǎn)入處于態(tài)的大腸桿菌。 (2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌,應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加,平板上長出的菌落,常用PCR鑒定,所用的引物組成為圖2中。 (3)若BamH酶切的DNA末端與Bcl酶切的DNA末端連接,連接部位的6個堿基對序列為,,對于該部位,這兩種酶(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。 (4)若用Sau3A切圖1質(zhì)粒最多可能獲得種大小不同的DNA片段。,答案(1)Bcl和Hind連接感受 (2)四環(huán)素引物甲和引物丙 (3)T

49、 GATC C A CTAG G都不能 (4)7,,解析本題主要考查基因工程的相關(guān)知識。(1)分析4種限制酶識別的序列可知:BamH和Bcl識別序列中含有Sau3A的識別序列,這三種酶切割DNA后可以產(chǎn)生相同的黏性末端。為保證質(zhì)粒上含有標記基因,切割質(zhì)粒時不能選用BamH和Sau3A,應(yīng)選用Bcl和Hind兩種限制酶切割;酶切后的載體和目的基因片段,需用DNA連接酶連接形成重組質(zhì)粒,為了擴增重組質(zhì)粒,需將其轉(zhuǎn)入處于感受態(tài)的大腸桿菌中。(2)重組質(zhì)粒中四環(huán)素抗性基因結(jié)構(gòu)完整,氨芐青霉素抗性基因結(jié)構(gòu)被破壞,在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素可以篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌。PCR擴增目的基因時,需用引

50、物甲和引物丙兩種引物。(3)BamH酶切產(chǎn)生的黏性末端為,Bcl酶切產(chǎn)生的黏性末端為,經(jīng)DNA連接酶連接后,連接 部位的6個堿基對序列為,此序列不能被BamH和Bcl識別,因此 不能被兩種酶切開。(4)圖1質(zhì)粒中含有Sau3A酶的3個識別序列,如圖:(A、B、C分別表示相鄰切點間的DNA片段),用Sau3A酶切,若在一個切點處切割可得到:B+C+A、C+A+B、A+B+C三種DNA片段(但其大小相同),若在兩個切點處切割可得到:A、B+C、A+C、B、A+B、C六種DNA片段(其大小均不同);若在三個切點處均切割,可得到A、B、C三種大小不同的DNA片段,綜上所述,用Sau3A酶切質(zhì)粒最多可能

51、獲得7種大小不同的DNA片段。,疑難突破判斷出BamH和Bcl的識別序列中含有Sau3A的識別序列,是準確解答本題的關(guān)鍵。注意第(4)小題,Sau3A可能打開1個切點、2個切點和3個切點三種情況。,,21.(2015四川理綜,9,11分)將蘇云金桿菌Bt蛋白的基因?qū)朊藁毎?可獲得抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)基因棉,其過程如下圖所示(注:農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上只有T-DNA片段能轉(zhuǎn)移到植物細胞中)。 質(zhì)粒中“Bt”代表“Bt基因”,“KmR”代表“卡那霉素抗性基因” (1)過程需用同種酶對含Bt基因的DNA和Ti質(zhì)粒進行酶切。為將過程獲得的含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌篩選出來,應(yīng)使用培養(yǎng)基。 (2)過程中將棉花細胞與農(nóng)

52、桿菌混合后共同培養(yǎng),旨在讓進入棉花細胞;除盡農(nóng)桿菌后,還須轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),目的是。 (3)若過程僅獲得大量的根,則應(yīng)在培養(yǎng)基中增加以獲得芽;部分接種在無激素培養(yǎng)基上的芽也能長根,原因是。,(4)檢驗轉(zhuǎn)基因棉的抗蟲性狀,常用方法是。種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉能減少的使用,以減輕環(huán)境污染。,答案(1)限制性核酸內(nèi)切選擇 (2)T-DNA篩選獲得T-DNA片段的植物細胞(3)細胞分裂素濃度芽頂端合成的生長素向基部運輸,促進根的分化(4)投放棉鈴蟲農(nóng)藥,,解析本題考查基因工程與植物細胞工程的相關(guān)知識。(1)同種限制酶切割質(zhì)粒和含目的基因的DNA,可獲得相同的黏性末端,以構(gòu)建基因表達載體。重組

53、質(zhì)粒含完整的卡那霉素抗性基因,故應(yīng)使用含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基篩選含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。(2)實驗過程中將棉花細胞與農(nóng)桿菌混合后共同培養(yǎng),其目的是利用含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌將T-DNA導(dǎo)入棉花細胞中。除去農(nóng)桿菌后在含卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng),其目的是篩選出含有目的基因的棉花細胞。(3)培養(yǎng)基中生長素用量與細胞分裂素用量比值高時,利于根的分化,抑制芽的形成,反之,有利于芽的分化,抑制根的形成。因芽頂端可合成生長素,故接種在無激素的培養(yǎng)基上的芽也能長根。(4)可用投放棉鈴蟲的方法檢測抗蟲棉的抗蟲效果。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的種植可減少農(nóng)藥使用量,從而減輕環(huán)境污染。,22.(2015福建理綜,33,10分)GDNF是一

54、種神經(jīng)營養(yǎng)因子,對損傷的神經(jīng)細胞具有營養(yǎng)和保護作用。研究人員構(gòu)建了含GDNF基因的表達載體(如圖1所示),并導(dǎo)入到大鼠神經(jīng)干細胞中,用于干細胞基因治療的研究。請回答: 圖1,圖2 (1)在分離和培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細胞的過程中,使用胰蛋白酶的目的是。 (2)構(gòu)建含GDNF基因的表達載體時,需選擇圖1中的 限制酶進行酶切。 (3)經(jīng)酶切后的載體和GDNF基因進行連接,連接產(chǎn)物經(jīng)篩選得到的載體主要有3種:單個載體自連、GDNF基因與載體正向連接、GDNF基因與載體反向連接(如圖1所示)。為鑒定這3種連接方式,選擇Hpa酶和BamH酶對篩選得到的載體進行雙酶切,并對酶切后的DNA片段進行電泳分析,結(jié)果如圖

55、2所示。圖中第泳道顯示所鑒定的載體是正向連接的。 (4)將正向連接的表達載體導(dǎo)入神經(jīng)干細胞后,為了檢測GDNF基因是否成功表達,可用相應(yīng)的,與提取的蛋白質(zhì)雜交。當(dāng)培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞達到一定密度時,需進行培養(yǎng)以得到更多數(shù)量的細胞,用于神經(jīng)干細胞移植治療實驗。,答案(1)使細胞分散開(2)Xho(3)(4)抗體傳代,解析(1)因動物細胞體外培養(yǎng)時有接觸抑制現(xiàn)象,故需用胰蛋白酶處理動物組織,使細胞分散開。(2)目的基因兩端及載體DNA分子中均有Xho酶識別的核苷酸序列,故構(gòu)建基因表達載體時,應(yīng)用Xho酶切割DNA分子。(3)圖示可知載體中酶Hpa與Xho切割點距離為100 bp,GDNF基因切割成60

56、0 bp和100 bp兩種DNA片段,由正向連接的重組載體中GDNF基因方向與Hpa、Xho酶切割結(jié)果可知,正向連接的重組載體被酶Hpa和酶Xho切割后,將得到 6 000 bp和700 bp兩種DNA片段,即為。(4)可用抗原抗體雜交技術(shù),對目的基因是否表達進行檢測。當(dāng)培養(yǎng)液中的細胞達到一定密度后,可分瓶進行傳代培養(yǎng),以獲得更多數(shù)量的細胞。,,,23.(2015江蘇單科,32,9分)胰島素A、B鏈分別表達法是生產(chǎn)胰島素的方法之一。圖1是該方法所用的基因表達載體,圖2表示利用大腸桿菌作為工程菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程(融合蛋白A、B分別表示-半乳糖苷酶與胰島素A、B鏈融合的蛋白)。請回答下列問題

57、: 圖1,圖2,(1)圖1基因表達載體中沒有標注出來的基本結(jié)構(gòu)是。 (2)圖1中啟動子是酶識別和結(jié)合的部位,有了它才能啟動目的基因的表達;氨芐青霉素抗性基因的作用是。 (3)構(gòu)建基因表達載體時必需的工具酶有。 (4)-半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達,可將胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點隱藏在內(nèi)部,其意義在于。 (5)溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵,用溴化氰處理相應(yīng)的融合蛋白能獲得完整的A鏈或B鏈,且-半乳糖苷酶被切成多個肽段,這是因為。 (6)根據(jù)圖2中胰島素的結(jié)構(gòu),請推測每個胰島素分子中所含游離氨基的數(shù)量。你的推測結(jié)果是, 理由是。,答案(1)終止子 (2)RNA聚合作為標記基因,

58、將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來 (3)限制酶和DNA連接酶 (4)防止胰島素的A、B鏈被菌體內(nèi)蛋白酶降解 (5)-半乳糖苷酶中含多個甲硫氨酸,而胰島素A、B鏈中不含甲硫氨酸 (6)至少2個兩條肽鏈的一端各有一個游離的氨基,氨基酸R基團中可能還含有游離的氨基,解析(1)完整的基因表達載體應(yīng)包含目的基因、啟動子、終止子、標記基因等,圖1中沒有標注出終止子。(2)啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,可驅(qū)動轉(zhuǎn)錄出mRNA;氨芐青霉素抗性基因?qū)儆跇擞浕?可利用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌。(3)構(gòu)建基因表達載體需用限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒,再用DNA連接酶將兩者連接形成重組

59、質(zhì)粒。(4)利用-半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達的意義是將胰島素肽鏈上的蛋白酶切割位點隱藏在-半乳糖苷酶內(nèi)部,從而防止胰島素A鏈或B鏈被大腸桿菌體內(nèi)的蛋白酶降解。(5)根據(jù)溴化氰的作用特點可知,溴化氰可將-半乳糖苷酶切成多個肽段,但不會切割胰島素A、B鏈,這與肽鏈中含有的甲硫氨酸數(shù)量有關(guān)。(6)由于每條肽鏈的一端都含有一個游離的氨基,所以蛋白質(zhì)分子中游離氨基的數(shù)量=肽鏈數(shù)+R基上游離氨基數(shù),故可推測胰島素(由A、B鏈組成)至少含有2個游離的氨基。,,24.(2014山東理綜,36,12分)人組織纖溶酶原激活物(htPA)是一種重要的藥用蛋白,可在轉(zhuǎn)htPA基因母羊的羊乳中獲得。流程如下:

60、 (1)htPA基因與載體用切割后,通過DNA連接酶連接,以構(gòu)建重組表達載體。檢測目的基因是否已插入受體細胞DNA,可采用技術(shù)。 (2)為獲取更多的卵(母)細胞,要對供體母羊注射促性腺激素,使其。采集的精子需要經(jīng)過,才具備受精能力。 (3)將重組表達載體導(dǎo)入受精卵常用的方法是。為了獲得母羊,移植前需對已,成功轉(zhuǎn)入目的基因的胚胎進行。利用胚胎分割和胚胎移植技術(shù)可獲得多個轉(zhuǎn)基因個體,這體現(xiàn)了早期胚胎細胞的。 (4)若在轉(zhuǎn)htPA基因母羊的羊乳中檢測到,說明目的基因成功表達。,答案(1)同種限制性核酸內(nèi)切酶(或同種限制酶)DNA分子雜交(或核酸探針) (2)超數(shù)排卵獲能(處理) (3)顯微注射法性別

61、鑒定全能性 (4)htPA(或人組織纖溶酶原激活物),,解析(1)目的基因和載體先用同種限制酶切割后,再用DNA連接酶連接,以構(gòu)建基因表達載體;判斷受體細胞的DNA是否插入目的基因可采用DNA分子雜交技術(shù)。(2)利用促性腺激素處理供體母羊可使其產(chǎn)生更多的卵母細胞;精子必須獲能后才具備受精能力。(3)將重組表達載體導(dǎo)入動物受精卵常用的方法是顯微注射法。為了獲得母羊,移植前需對已成功轉(zhuǎn)入目的基因的胚胎進行性別鑒定。(4)若在轉(zhuǎn)htPA基因母羊的羊乳中檢測到人組織纖溶酶原激活物,說明目的基因成功表達。,25.(2012福建理綜,32,10分)肺細胞中的let-7基因表達減弱,癌基因RAS表達增強,會

62、引發(fā)肺癌。研究人員利用基因工程技術(shù)將let-7基因?qū)敕伟┘毎麑崿F(xiàn)表達,發(fā)現(xiàn)肺癌細胞的增殖受到抑制。該基因工程技術(shù)基本流程如圖1。,請回答: (1)進行過程時,需用酶切開載體以插入let-7基因。載體應(yīng)有RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,以驅(qū)動let-7基因轉(zhuǎn)錄,該部位稱為。 (2)進行過程時,需用酶處理貼附在培養(yǎng)皿壁上的細胞,以利于傳代培養(yǎng)。 (3)研究發(fā)現(xiàn),let-7基因能影響癌基因RAS的表達,其影響機理如圖2。據(jù)圖分析,可從細胞中提取進行分子雜交,以直接檢測let-7基因是否轉(zhuǎn)錄。肺癌細胞增殖受到抑制,可能是由于細胞中(RAS mRNA/RAS蛋白)含量減少引起的。,答案(1)限制性核酸內(nèi)

63、切(或限制)啟動子(2)胰蛋白(3)RNARAS蛋白,,解析此題考查基因工程應(yīng)用的相關(guān)知識。(1)構(gòu)建基因表達載體時,需要用同種限制酶切割目的基因和載體,使之產(chǎn)生相同的黏性末端。載體應(yīng)有啟動子、終止子和標記基因,其中啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合部位,驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄。(2)動物細胞培養(yǎng)時,常用胰蛋白酶處理貼壁的細胞,使之相互分離,以利于傳代培養(yǎng)。(3)檢驗?zāi)康幕蚴欠癖磉_,常用分子雜交法。從被導(dǎo)入目的基因的細胞內(nèi)提取RNA,與目的基因單鏈雜交,如果出現(xiàn)雜交帶,說明目的基因已轉(zhuǎn)錄。由圖2知,當(dāng)let-7基因轉(zhuǎn)錄出來的miRNA與癌基因RAS轉(zhuǎn)錄出的mRNA雜交時,就會抑制RAS蛋白的產(chǎn)生,故肺癌細

64、胞增殖受到抑制,可能是由于細胞中RAS蛋白含量減少引起的。,26.(2012江蘇單科,32,9分)圖1表示含有目的基因D的DNA片段長度(bp即堿基對)和部分堿基序列,圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列。現(xiàn)有Msp、BamH、Mbo、Sma4種限制性核酸內(nèi)切酶,它們識別的堿基序列和酶切位點分別為CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。 請回答下列問題:,圖1,圖2,(1)圖1的一條脫氧核苷酸鏈中相鄰兩個堿基之間依次由連接。 (2)若用限制酶Sma完全切割圖1中DNA片段,產(chǎn)生的末端是末端,其產(chǎn)物長度為。 (3)若圖1中虛線方框內(nèi)的堿基對被T-A堿基對替換,那么基因D就突變?yōu)榛騞。從

65、雜合子中分 離出圖1及其對應(yīng)的DNA片段,用限制酶Sma完全切割,產(chǎn)物中共有種不同長度的DNA片段。,(4)若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進行連接,形成重組質(zhì)粒,那么應(yīng)選用的限制酶是。在導(dǎo)入重組質(zhì)粒后,為了篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌,一般需要用添加的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。經(jīng)檢測,部分含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達,其最可能的原因是。,答案(1)脫氧核糖、磷酸、脫氧核糖(2)平537 bp、790 bp、661 bp(3)4(4)BamH抗生素B同種限制酶切割形成的末端相同,部分目的基因D與質(zhì)粒反向連接,,解析本題主要考查基因工程中限制酶的作用原理和重組質(zhì)粒構(gòu)建的相

66、關(guān)知識。(1)通過分析DNA分子結(jié)構(gòu)的特點可知,在DNA的一條鏈中,相鄰兩個堿基依次由脫氧核糖磷酸脫氧核糖連接。(2)限制酶Sma的識別序列和酶切位點為CCCGGG,酶切位點位于識別序列的中軸線上,所以酶切后形成的末端是平末端。在圖1DNA片段中,有兩個Sma的識別序列,完全切割后形成的產(chǎn)物長度分別為:534+3=537(bp);796-3-3=790(bp);658+3=661(bp)。(3)D基因突變?yōu)閐基因后,其堿基序列中只含有一個Sma的識別序列,此時用Sma完全切割該DNA片段后產(chǎn)物的長度有兩種,分別為:534+796-3=1 327(bp);658+3=661(bp)。所以,從雜合子(Dd)中分離出的D、d基因如圖1對應(yīng)的DNA片段被Sma完全切割,產(chǎn)物中有537 bp、790 bp、661 bp、 1 327 bp 4種不同長度的DNA片段。(4)分析圖1DNA片段上的限制酶酶切位點可知,為了防止目的基因被破壞,并將目的基因從DNA片段中切下來,可選擇用BamH或Mbo對目的基因進行處理。質(zhì)粒用Mbo處理后抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因都會被破壞,質(zhì)粒用BamH處理后