熒光定量PCR 法原理匯總

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1、我們前面比較詳細(xì)地介紹了熒光染料法做定量PCR的有關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品,顯然， 作為定量PCR的初期階段的熒光染料法還是有局限性的，比如，由于染料不能區(qū) 分特異性PCR產(chǎn)物和引物二聚體等非特異產(chǎn)物，也不能區(qū)分不同探針，所以檢測 的特異性始終不如后來出現(xiàn)的探針法；需要在PCR后進(jìn)行熔鏈曲線分析；也不能 做多重PCR檢測(Multiplex)。 上個世紀(jì)90年代原美國Perkin Elmer( PE)公司開發(fā)出了 Taqman熒光探針 定量技術(shù)，將定量PCR帶入了更廣闊的應(yīng)用空間。Taqman探針法的出現(xiàn)是定量 PCR技術(shù)的重要里程碑，之后在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了雜交探針法，以及熒光引物法， 是對探針法的不斷

2、改進(jìn)和簡化。如果希望全面掌握定量PCR技術(shù)的研究人員就不 能錯過這些定量檢測技術(shù)。 要提到熒光探針或者熒光引物，有一個基礎(chǔ)概念需要首先明確，那就是熒光 共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 一對合適的 熒光物質(zhì)可以構(gòu)成一個能量供體 (donor) 和能量受體 (acceptor) 對, 其中供 體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊，當(dāng)它們在空間上相互接近到一定距離 (1—10 nm)時，激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光能量正好被附近的受體吸收，使得供體發(fā) 射的熒光強度衰減，受體熒光分子的熒光強度增強。能量傳遞的效率和供體的發(fā) 射光譜與受體的

3、吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對取向、供體 與受體之間的距離等有關(guān)。定量PCR所涉及的熒光探針和熒光引物的檢測都這個 FRET原理相關(guān)。 實時熒光PCR中另一個很重要的概念，即Ct值.C代表循環(huán)(Cycle)，T代表 閾值(Threshold).Ct值是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷 的循環(huán)數(shù)?。一般取PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光 閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。研究表明，每個模 板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值 越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線?因此，

4、只要獲得未知樣品 的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 一：水解探針法 TaqMan 技術(shù) 原理：除了一對特異性引物，TaqMan探針法增加一條和模版互補的基因 特異性探針（通常20—30bp）,探針上5'端和3'端分別標(biāo)記了一個報告熒 光基團(tuán)（供體）和一個淬滅熒光基團(tuán)（受體），在反應(yīng)初始（探針完整） 時系統(tǒng)激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光信號被臨近的淬滅基團(tuán)吸收，所以此時檢測 不到供體熒光信號；而當(dāng)PCR過程中Taq DNA聚合酶擴(kuò)增到探針結(jié)合模 版的位點時，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探針5' 端的報告基團(tuán)——游離的報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，打破能量的傳遞，激

5、發(fā) 報告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號就可以被熒光檢測系統(tǒng)檢測到。這樣每擴(kuò)增一條 DNA鏈，就對應(yīng)有一個游離的熒光分子（報告基團(tuán)）形成，保證了熒光信 號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步，因此對熒光信號進(jìn)行檢測就可以實 時監(jiān)控PCR的過程，準(zhǔn)確定量PCR的起始拷貝數(shù)。但是實際上探針較長 使得兩端基團(tuán)距離較遠(yuǎn)，會導(dǎo)致熒光淬滅不徹底，而且淬滅基團(tuán)也會產(chǎn)生 不同波長的熒光，都會使得本底偏高. MGB原理：針對Taqman探針熒光淬滅不徹底的問題，2000年美國ABI公司 技術(shù) 推出了一種新 TaqMa n探針 MGB探針（mi nor groove bin der oligodeoxynucleotide

6、conjugate, MGB-ODN）， 3'端采用了非熒光性 的淬滅基因——淬滅基團(tuán)吸收報告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本 底信號的干擾。此外， MGB 探針的3'端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉- 三肽（dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3）可以大大穩(wěn)定探針 與模板的雜交, 升高探針 Tm 值, 使較短的探針同樣能達(dá)到較高的 Tm 值——而短探針的熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離更近, 淬滅效果更好， 熒光背景更低，使得信噪比更高：一個15bp的MGB探針的信噪比大于 6,優(yōu)于理想狀態(tài)下的25bp的普通Taqman探針（信噪比約為1.5）。允許 采用

7、更短的探針也簡化了探針的設(shè)計和成本。有實驗證明 MGB 探針對于 等位基因的區(qū)分比較理想，甚至可以檢測單堿基突變（因為堿基錯配對較短 探針的雜交穩(wěn)定性影響更大） 水解探針之所以稱之為水解，主要是因為它利用的是Taq酶的水解作用，使得 探針上的熒光報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)而發(fā)光信號，游離的報告基團(tuán)數(shù)目對應(yīng) PCR 新擴(kuò)增產(chǎn)物，此方法檢測的是積累熒光。 優(yōu)點： 靈敏，特異性高：具有模版序列特異的Taqman探針在引物特異的基礎(chǔ)上進(jìn)一步 提高的定量PCR的專一性；每擴(kuò)增一個特異產(chǎn)物只釋放一個分子的熒光染料，儀 器檢測的是特異擴(kuò)增的結(jié)果，非特異產(chǎn)物對檢測信號沒有影響，有效提高檢測的 專一性。 有多

8、種不同波長的熒光基團(tuán)對可供選擇，使得Taqman探針法可以實現(xiàn)在同一管 內(nèi)檢測多重PCR，降低成本也提高效率和準(zhǔn)確性 避免了熒光染料對PCR反應(yīng)的影響 缺點：探針設(shè)計有一定難度，需要驗證效果，探針的合成和雙熒光標(biāo)記成本高 此外，也有人認(rèn)為，Taqman法利用了 Taq酶的外切活性，而由于各家公司 出產(chǎn)的Taq酶對于其外切酶活性并沒有做出嚴(yán)格的活性標(biāo)定，定量PCR的效率有 可能受酶外切活性的影響，酶活性差異也給定量帶來了不確定性。至少，生物通 定量PCR技術(shù)系列前面介紹的Stratagene 2100萬美元專利之爭的Fullvelocity DNA聚合酶由于去掉外切酶活性，就不能用于Taqma

9、n探針法了！ 應(yīng)用：Taqman技術(shù)廣泛應(yīng)用在人類傳染病診斷和病原定量上，在動物疾病病原 體基因的檢測、畜禽產(chǎn)品的檢驗檢疫、生物制品的鑒定以及在疫苗效力測定上等 方面都有成功的許多例子。 注意：1）探針長度應(yīng)在15-45bp （最佳20-30bp）左右，以保證結(jié)合的特異性。2） GC堿基含量在40%-60%，避免單核苷酸序列的重復(fù)。3）避免與引物發(fā)生雜交或 重疊。4）探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度,因此探 針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5°C。另外，探針的濃度，探針與模板序列 的同源性，探針與引物的距離都對實驗結(jié)果有影響。另外，在儀器的選擇上也要 注意，盡量選擇

10、具有4色或以上的熒光檢測通道的儀器，已保證你的機器的適用 性和試劑選擇的靈活性。畢竟技術(shù)是在快速發(fā)展的。 二：雜交探針法 FRE原理：羅氏專利的FRET探針又稱為雙雜交探針，或者LightCycle探針。 FRET技術(shù) 探針由兩條和模版互補、且相鄰的特異探針組成（距離1—5bp）,上游探 針的3'端標(biāo)記供體熒光基團(tuán)，相鄰下游探針的5'端標(biāo)記Red 640受體熒 光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時，兩探針同時結(jié)合在模板上，供體基團(tuán)和Red640受體 基團(tuán)緊密相鄰（距離1—5bp）,激發(fā)供體產(chǎn)生的熒光能量被Red640基團(tuán) 吸收，使得檢測探頭可以檢測到Red640發(fā)出波長為640的熒光。當(dāng)變性 時，兩探針游

11、離，兩基團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能檢測至640波長的熒光。FRET探針 檢測的信號是退火時的實時信號，每次檢測信號始終嚴(yán)格對應(yīng)模版的數(shù)量， 非累積信號，可以用于做Tm曲線和SNP檢測。常用的受體熒光基團(tuán)除了 LC-Red640還有LC-Red705。兩個單標(biāo)記探針的長短不影響信號的傳 遞，而探針間的距離通常為1-5bp （雖然越短越好，還是要留點空間避免 相互之間的反應(yīng)）。 我們前面提到，Taqman水解探針法中，一但報告基團(tuán)水解離開淬滅基團(tuán)，就 一直游離于反應(yīng)體系中可被檢測，所以檢測的是累積熒光，是不可逆的。雜 交探針不同，是復(fù)性時兩條特異探針雜交到模板上，相互靠近而產(chǎn)生檢測信 號，到升溫變性探針遠(yuǎn)離

12、模版就沒有信號，所以檢測的是實時信號，是可逆 的，所以可以進(jìn)行熔解曲線的分析，還可以用于進(jìn)行突變分析，SNP基因分 型以及產(chǎn)物鑒別。比如一旦探針位置上出現(xiàn)有點突變，通過熔解曲線就可以 很快分析出來，這也是Taqman法無法做到的。另外，由于采用2條模版特異 的探針，雜交探針法的專一性無疑更高于其他方法，不受非特異產(chǎn)物的影響。 Fret探針法由于需要合成2條探針，探針的末端要封閉以避免反應(yīng)，所以合 成的成本會比較高，也比較麻煩。但實 際 上，F(xiàn)ret探針的設(shè)計其實比Taqman 探針容易，因為Taqman探針要求一定的長度以保證探針的特異性和結(jié)合模版的 能力，但是長度會導(dǎo)致兩末端的熒光基團(tuán)距離

13、遠(yuǎn)而使得熒光共振能量傳遞的效率 降低，淬滅不徹底。Fret探針就不受這個限制。不管怎么說，多數(shù)人還是習(xí)慣 認(rèn)為單探針比合成2條探針要簡單。 在水解和雜交探針技術(shù)之間產(chǎn)生另外一種技術(shù)：分子信標(biāo)（分子信標(biāo)產(chǎn)生時 間是1996年） 分子信標(biāo)技術(shù) 原理：分子信標(biāo)（Molecular beacon，MB）是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo) 記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo) 記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬 滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。 分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30bp （有人認(rèn)為18-20個bp

14、較好）長, 并與目標(biāo)序列互補，莖一般5-7bp長（GC含量較高），相互配對形成莖的結(jié) 構(gòu)。熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端，而淬滅劑則標(biāo)記在另一端。在復(fù)性溫度下， 因為模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加熱變性會互補配對的莖環(huán)雙鏈解開，如 果有模板存在環(huán)序列將與模板配對。與模板配對后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā) 夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時，淬滅作用被解除， 發(fā)出激發(fā)光子。 應(yīng)用：應(yīng)用于基因定量分析和突變體識別、疾病基因檢測與診斷、單核苷酸多 態(tài)性（ single nucleotide polymorphism , SNP） 分析等生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和臨 床研究中。 優(yōu)點：本底低，特異靈敏

15、 缺點：①雜交時探針不能完全與模板結(jié)合，因此穩(wěn)定性較差。 ② 探針合成時標(biāo)記較復(fù)雜 延伸技術(shù)：建立在分子信標(biāo)技術(shù)基礎(chǔ)上的探針技術(shù)有Amplifluor、Sunrise、 Amplisensor、 Scorpion 等，其中 Sun rise技術(shù)，這一方法的特點是所有的擴(kuò)增產(chǎn)物均能標(biāo)記上熒光分子，因此 熒光信號響應(yīng)快，但無法區(qū)分特異和非特異擴(kuò)增是其致命的不足。 Amplisensor 技術(shù)是一種復(fù)合探針技術(shù)，一個探針上連接一種熒光物，另一 探針連接一淬滅物。兩探針長度不同，其中淬滅物標(biāo)記探針5'端多出7個堿 基（GCGTCCC）。PCR擴(kuò)增前需將熒光物標(biāo)記探針與一個半套式PCR引物 連接

16、， PCR 引物的5'末端應(yīng)有一段與長探針互補的序列，以便連接酶將該引 物與短探針連接。擴(kuò)增時該探針－引物復(fù)合物作為半套式引物摻入到模板，從 而釋放出淬滅探針部分，破壞了 FRET，而產(chǎn)生熒光。 Scorpion 技術(shù)（蝎形引物）則是通過在分子信標(biāo)的3'端設(shè)計連接臂連接一 段引物，使 PCR 延伸反應(yīng)時不能夠延伸至分子信標(biāo)，這樣非特異擴(kuò)增產(chǎn)物便 無熒光信號。包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的PCR產(chǎn)物在退火時形成分子內(nèi)雜交，發(fā)夾結(jié)構(gòu) 被破壞，兩個基團(tuán)之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從而發(fā)出熒光。這種方法可以 解決非特異的問題，同時靈敏度高，反應(yīng)快，已應(yīng)用于k-ras及BRAC2基因 的突變分析了，但這種方法不能保證雜

17、交時探針與模板完全匹配，而且合成復(fù) 雜。 這種技術(shù)雖然也是積累熒光（因為結(jié)合上模板以后不會掉下來），但是不同于 Taqman 水解探針，分子信標(biāo)可以進(jìn)行溶解曲線分析，這也就是說分子信標(biāo)可以 進(jìn)行包括突變檢測，SNP檢測等在內(nèi)的定量PCR延伸應(yīng)用。但是這種技術(shù)正如上 面提到的探針設(shè)計復(fù)雜，穩(wěn)定性差——而這一點對于溶解曲線的影響頗大，因此 在應(yīng)用上也需要審慎考慮。 第三代：熒光引物 Ampl原理：激發(fā)的熒光進(jìn)行分子能量轉(zhuǎn)移到受體成分導(dǎo)致熒光發(fā)射的淬滅。目 ifluor標(biāo)特異性Amplifluor引物包含一個5'內(nèi)部互補序列，標(biāo)記有熒光發(fā)色 技術(shù) 團(tuán)（fluorescerin）和一個能量受體：

18、4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3'端序列是目標(biāo)特異性引物區(qū)。未結(jié)合的Amplifluor引物 由于內(nèi)部熒光發(fā)色團(tuán)和淬滅分子的緊密接近，只有低的熒光信號。 在第一個循環(huán)中，Amplifluor引物1與特異CDNA的第一條鏈退火并被 Taq酶延伸。在第二個循環(huán)中Amplifluor引物1延伸產(chǎn)物作為引物2 （反 義鏈引物）的模板。一旦引物2被Taq酶延伸，Amplifluor發(fā)夾引物解 折疊并產(chǎn)生熒光信號。隨后的擴(kuò)增循環(huán)中產(chǎn)生的熒光信號的增強與擴(kuò)增產(chǎn) 物量的增加成比例。 LUX 原理：LUM（light upon extention）引物技術(shù)是 Invitrogen

19、公司的一 技術(shù) 項專利，是利用熒光標(biāo)記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術(shù)。使用類似分子信 標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)設(shè)計引物，使引物同時起到熒光探針的作用。引物對中的一 個引物3'端用熒光報告基團(tuán)標(biāo)記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自 身配對，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在模板存在的情況下，引物與模板 配對，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生熒光信號。使用LUX引物，不需要專門設(shè)計 探針，即省了成本又給實驗設(shè)計提供了寬松的條件。由于沒有探針控制特異性，因此他的特異性要弱于探針技術(shù)，但非特異性擴(kuò)增或引物二聚體沒 有影響，所以其特異性要強于 SYBR GREEN。 SYBR GREEN FRET 探 針 Taqma n

20、分子信標(biāo) LUX引物 性質(zhì) 可逆熒光 積累熒光 熔點 分析 能 不能 特異 性 引物（非 特異性 擴(kuò)增或 引物二 聚體有 影響） 引物+2 探針 引物+探 針 引物+探 針 引物（非特異 性擴(kuò)增或引物 二聚體無影 響） 探針 不需要 需要 需要 需要 不需要 通用 性 通用 專用 專用 專用 專用 看完這些方法，相信新近接觸定量 PCR 的人就已經(jīng)覺得眼花繚亂了，其實雖然以 上這些檢測技術(shù)有許多，但是實際上在商品成熟應(yīng)用上并不是有這么多豐富的選 擇，具體的優(yōu)良產(chǎn)品篩選請見： 定量PCR經(jīng)典之選——Taqman探針 定量檢測精靈——熒光引物 中國的PCR——達(dá)安