干細(xì)胞內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程SOP-ZK-003.doc

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1、GMP質(zhì)量管理 文件編號：SOP/ZK/003 干細(xì)胞內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）北京賽托森生物科技發(fā)展有限公司質(zhì)量管理干細(xì)胞內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件名：干細(xì)胞內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號：制定人：日期： 年 月 日文件類型：工作標(biāo)準(zhǔn)審核人：日期： 年 月 日版 次：第一版批準(zhǔn)人：日期： 年 月 日印 數(shù)：共5份生效日期： 年 月 日頒發(fā)部門：質(zhì)量管理分發(fā)至： 質(zhì)量副總經(jīng)理、質(zhì)量管理部、QC檢驗室、綜合辦公室變更記載修訂號修訂人批準(zhǔn)日期生效日期原 因 及 目 的1.簡述本操作程序主要參照BP 2003 Appendix XIV C. Test for bacterial endotox

2、ins中MethodA.Gel-clot method: limit test和Method B. Gel-clot method: semi-quantitative test以及中國藥典2010版附錄E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中凝膠法，結(jié)合實驗室自身條件編寫而成。2.安全注意事項 由于細(xì)菌內(nèi)毒素對人體有毒害作用，且鱟試劑對人的危害作用尚不明確。因此實驗過程中一定要做好防護(hù)措施。3.檢驗?zāi)康臋z驗供試品中的的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。4.檢驗原理本操作程序通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來定性檢測或半定量檢測內(nèi)毒素。5.供試品溶液的制備某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水

3、性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH 值在6.08.0的范圍內(nèi)。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH 值，可使用酸、堿溶液或適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH 值。酸或堿溶液須用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。緩沖液必須經(jīng)過驗證不含內(nèi)毒素和干擾因子。6.供試品細(xì)菌內(nèi)毒素的限值(L)藥典有明確規(guī)定的按照藥典規(guī)定值，如無規(guī)定需經(jīng)計算得出，具體計算方法見各藥典。7.供試品最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)和最小有效稀釋濃度的確定(MVC)最大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗中供試品溶液被允許達(dá)到稀釋的最大倍數(shù)( 1MVD )，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限

4、值的檢測。用以下公式來確定MVD，MVD=cL /。式中L 為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；c 為供試品溶液的濃度，當(dāng)L 以EU / ml 表示時，則c為1ml / ml ，當(dāng)L 以EU / mg 或EU / U 表示時，c的單位需為mg / ml 或U / ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD 取1 ，可計算供試品的最小有效稀釋濃度c=/L ；為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度EU / ml （商品包裝上有標(biāo)示）。舉例：設(shè)設(shè)鱟試劑的靈敏度為0.25 EU/ml，即=0.25 EU/ml，英國藥典規(guī)定檸檬酸的限值L為0.5 IU/mg(IU與EU等同)，由于檸檬酸為固體，則可以通過c=/L，

5、確定最小有效稀釋濃度，即MVC=0.25/0.5=0.5 mg/ml。8.設(shè)備和試劑8.1電子天平8.2電熱滅菌干燥箱，溫度能達(dá)到250攝氏度8.3恒溫水浴或恒溫培養(yǎng)箱，能滿足恒溫在3718.4渦旋混合器8.5 無菌工作臺8.6微量加樣器，200 ul8.7去熱源一次性吸頭8.8凝集管(10mm75mm)8.9管架8.10錫紙8.11鱟試劑，應(yīng)具有國家主管部門的批準(zhǔn)文號。7.12細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，除另有規(guī)定外，應(yīng)使用由中國藥典生物制品檢定所統(tǒng)一發(fā)放的標(biāo)準(zhǔn)品7.13細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.015 EU/ml7.13細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用pH緩沖溶液注：以上試劑

6、推薦使用廈門鱟試劑實驗廠有限公司,湛江安度斯生物有限公司及湛江博康海洋生物公司9.實驗器皿去熱源實驗所用的器皿需經(jīng)處理，取出可能存在的外源性內(nèi)毒素。通常玻璃器皿首先細(xì)菌，再用錫紙包裹放入250干燥箱中進(jìn)行干熱滅菌。而使用不耐熱的塑料器皿，應(yīng)選用表面無內(nèi)毒素并且對實驗無干擾的器械。10.鱟試劑的靈敏度符合實驗在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示。當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗。10.1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，

7、然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開，開啟過程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。按照標(biāo)準(zhǔn)品說明書，加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進(jìn)行稀釋，制備成4個濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，即2.0、0.5、0.25（為所復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘（詳細(xì)過程參見標(biāo)準(zhǔn)品使用說明書）。10.2待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備取0.1ml/支的鱟試劑18支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解

8、，避免產(chǎn)生氣泡。若待復(fù)核鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時，取若干支按其標(biāo)示量加入檢查用水復(fù)溶，充分溶解后將鱟試劑溶液混合在一起，然后每0.1 ml分裝到10mm75mm凝集管中，要求至少分裝18管備用。10.3凝膠反應(yīng)將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分別加入0.1ml的2、0.5和0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；另2支（管）加入0.1ml檢查用水（如圖1）。加樣結(jié)束后，將鱟試劑用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放入371水浴或適宜恒溫器中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫602分鐘。圖110.4判定和計

9、算鱟試劑靈敏度的測定值(c) 觀察并記錄結(jié)果。將試管架從水浴中輕輕取出，避免振動，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180觀察，管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（）；未形成凝膠或凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（）。當(dāng)最大濃度2管均為陽性，最低濃度0.25管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（c）。cantilg（X / 4 )，式中X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg ）。反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。當(dāng)c在0.52(包括0.52)時，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該

10、批鱟試劑的靈敏度。10.5舉例設(shè)待復(fù)核鱟試劑的靈敏度為0.25 EU/ml，即=0.25 EU/ml。實驗結(jié)果如下：內(nèi)毒素濃度 （EU/ml） 0.50 0.25 0.125 0.062 Nc 反應(yīng)終點濃度X 1 + + - - - 0.25 2 + - - - - 0.50 3 + + + - 0.125 4 + + + - 0.125則：c =antilg(X/4)=antilg（lg0.25lg0.50lg0.125lg0.125）/4= antilg(-0.602-0.301-0.903-0.903)/4= antilg(-0.508)=0.310（EU/ml）c在0.5-2范圍內(nèi)，符

11、合規(guī)定。11.干擾實驗干擾試驗的目的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。11.1制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液取1支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液即2.0、0.5、0.25。11.2制備含內(nèi)毒素的供試品溶液將供試品稀釋至預(yù)實驗中確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液將11.1中的同支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成4個濃度即2.0、1.0、0.5、0.25的含內(nèi)毒素的供試品溶液。11.3鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑36支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，

12、防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若待復(fù)核鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時，按其標(biāo)示量加入檢查用水復(fù)溶，將復(fù)溶后的鱟試劑溶液混和在一起，然后每0.1ml分裝到1075mm凝集管中，要求至少分裝36管備用。11.4凝膠反應(yīng)將準(zhǔn)備好的鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。將另外18支（管）鱟試劑放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的

13、4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素的含供試品溶液；另一列2支（管）加入0.1ml供試品溶液作為樣品陰性對照，如表1所示。加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，兩同試管架放入371水浴或適宜恒溫器中，保溫602分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。表l 凝膠法干擾試驗溶液的制備編號內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2/供試品溶液供試品溶液12421440.5480.254C2/檢查用水檢查用水12421440.5480.254D無/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為干擾試劑系列；C鱟試劑標(biāo)示靈敏度

14、的對照系列；D為陰性對照。11.5判定并計算C和B的反應(yīng)終點濃度的集合平均值(Es和Et) 只有當(dāng)溶液A 和陰性對照溶液D 的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C 的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時，試驗方為有效。按下式計算系列溶液C 和B 的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Es和Et ) :Es= antilg （Xs / 4 )Et=antilg （Xt / 4 )式中Xs、Xt分別為系列溶液C 和溶液B 的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。當(dāng)Es在0.52（包括0.5和2）及Et在0.5Es 2 Es （包括0.5Es和 2 Es）時，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD 的稀釋倍

15、數(shù)下對試驗有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過MVD 的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗?？赏ㄟ^對供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗。當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進(jìn)行干擾試驗。當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進(jìn)行干擾試驗。12.凝膠限度試驗12.1供試品溶液的制備將供試品進(jìn)行稀釋，其稀釋倍數(shù)為MVD并且已經(jīng)排除干擾。12.2陽

16、性對照溶液的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制成2濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液。12.3供試品陽性對照溶液的制備用待檢測的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2濃度的內(nèi)毒素溶液。12.4陰性對照液即細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。12.5鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑8支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解、輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)溶物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若使用的鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時，取若干支，按其標(biāo)示量加入檢查用水復(fù)溶，充分溶解后將鱟試劑溶液混和在一起，然后每0.1ml分裝到1075mm凝集管中，要求至

17、少分裝8管備用。12.6凝膠反應(yīng)取8支（管）溶解好的鱟試劑，其中2支加入0.1ml供試品稀釋液作為供試品管，2支加入0.1ml陽性對照溶液作為陽性對照管，2支加入0.1ml檢查用水作為陰性對照管， 2支加入0.1ml供試品陽性對照溶液作為供試品陽性對照管，見表2。將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入371水浴或適宜恒溫器中，保溫602分鐘。保溫和取放試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。表2 凝膠限度試驗溶液的制備編號內(nèi)毒素濃度被加入內(nèi)毒家的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液2B2供試品溶液2C2檢查用水2D無檢查用水2注：A 為供試品溶液；B 為供試品陽性對照；C 為陽性對照；D 為陰

18、性對照。12.7判定若陰性對照溶液D 的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B 的平行管均為陽性，陽性對照溶液C 的平行管均為陽性，試驗有效。若溶液A 的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定；若溶液A 的兩個平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液A 的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時，溶液A 需做4 支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定；否則判定供試品不符合規(guī)定。13. 凝膠半定量試驗半定量實驗是使用凝膠法估測供試品中內(nèi)毒素含量的方法。系利用供試品系列與鱟試劑反應(yīng)的終點濃度計算出供試品中內(nèi)毒素的含量。13.1供試品系列的制備用檢查用水將供試品溶液從

19、已確定的不干擾濃度或稀釋倍數(shù)下開始進(jìn)行對倍稀釋，制備成1、2、4、8等濃度，但最大稀釋倍數(shù)不得超過MVD。13.2內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成4個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液即2.0、1、0.5、0.25。13.3供試品陽性對照溶液的制備用已確定不干擾濃度或稀釋倍數(shù)的供試品溶液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2濃度的內(nèi)毒素溶液。13.4陰性對照液即細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。13.5鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支或分裝好的鱟試劑至少20支，其他操作按前文所述。13.6凝膠反應(yīng)將準(zhǔn)備好的鱟試劑取其中10支（管）放在試管架上，排成5列，每列2支。其中4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、0.5、0.25的

20、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。另外8支（管）鱟試劑放在試管架上，排成4列，每列2支（管）。每列每支分別加入0.1ml一個濃度的供試品溶液。另2支（管）加入0.1ml供試品陽性對照溶液作為供試品的陽性對照，如表3。表3 凝膠半定量試驗溶液的制備編號內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液檢查用水12224282B2/供試品溶液122C2/檢查用水檢查用水12221240.5280.252D無/檢查用水2注：A為不超過MVD并且通過干擾試驗的供試品溶液。從通過干擾試驗的稀釋倍數(shù)開始用檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和

21、8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過MVD。B為2濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽性對照）。C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列。D為陰性對照。13.7判定與供試品濃度CE的計算若陰性對照溶液D 的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B 的平行管均為陽性，系列溶液C 的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值在0.52之間，試驗有效。系列溶液A 中每一系列平行管的終點稀釋倍數(shù)乘以，為每個系列的反應(yīng)終點濃度，所有平行管反應(yīng)終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度按公式CE=antilg（X / 2 ），在某稀釋倍數(shù)下，供試品溶液的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值 。如果檢驗時采用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內(nèi)毒素濃度時要將結(jié)果

22、乘以稀釋倍數(shù)。如試驗中供試品溶液的所有平行管均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記為小于乘以供試品進(jìn)行半定量試驗的初始稀釋倍數(shù)）。如果供試品溶液的所有平行管均為陽性，應(yīng)記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以。若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限值，判定供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限值，判定供試品不符合規(guī)定。13.8舉例供試品濃度計算的舉例：設(shè)供試品為某注射液，干擾實驗已確定其最小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍，其內(nèi)毒素限值為10EU/ml，現(xiàn)使用靈敏度為0.03EU/ml的鱟試劑檢測供試品中的內(nèi)毒素含量。MVD=CL/=10/0.03320倍，將供試品溶液先稀釋至20倍后，再進(jìn)行對倍稀釋。將20倍稀釋液稀釋2、4、8、16倍，同時制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列。 則有：供試品稀釋倍數(shù) 1 2 4 8 16 PPC 反應(yīng)終點稀釋倍數(shù) 1 8 2 4CE=antilg(X/2)=antilglg（80.03）lg（40.03）/2=0.170 EU/ml供試品20倍稀釋液的內(nèi)毒素含量=0.170EU/ml由于供試品先被稀釋了20倍，因此供試品的內(nèi)毒素含量為：0.17020=3.40EU/ml低于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，此批注射液內(nèi)毒素檢查項符合規(guī)定。第 8 頁 共 9 頁