醫(yī)學分子生物學原理：第7章 第6節(jié) 生物芯片技術

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1、第十四章第十四章Biochip Technology醫(yī)學分子生物學實驗技術醫(yī)學分子生物學實驗技術藥立波藥立波 主編主編第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述 一、生物芯片的概念一、生物芯片的概念二、二、DNADNA芯片芯片一、基因表達譜研究一、基因表達譜研究一、原位合成一、原位合成DNADNA芯片制作芯片制作 二、二、DNADNA微陣列芯片制作微陣列芯片制作一、待測樣品的準備一、待測樣品的準備 二、分子雜交反應二、分子雜交反應三、檢測分析三、檢測分析第二節(jié)第二節(jié) 生物芯片的制作生物芯片的制作 第三節(jié)第三節(jié) DNADNA芯片使用的基本流程芯片使用的基本流程 第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片第五節(jié)第五節(jié) 生物

2、芯片的基本操作和流程生物芯片的基本操作和流程二、二、DNADNA測序測序 三、基因突變檢測三、基因突變檢測四、基因診斷四、基因診斷五、蛋白質(zhì)芯片的應用五、蛋白質(zhì)芯片的應用六、藥物研發(fā)六、藥物研發(fā)2022年年6月月3日日14時時43分分2 生物芯片生物芯片(biochip) (biochip) 技術技術是是2020世紀世紀9090年代初，由年代初，由分子生物學、微電子學、物理學、化學和計算機科學分子生物學、微電子學、物理學、化學和計算機科學等多學科交叉融合而發(fā)展起來的高新技術。等多學科交叉融合而發(fā)展起來的高新技術。 生物芯片生物芯片是繼是繼大規(guī)模集成電路大規(guī)模集成電路之后的又一次具有之后的又一次

3、具有深遠意義的科學技術革命。深遠意義的科學技術革命。 生物芯片將生物芯片將會會改變生命科學的研究方式，革新醫(yī)改變生命科學的研究方式，革新醫(yī)學診斷和治療學診斷和治療，極大地提高人口素質(zhì)和健康水平。極大地提高人口素質(zhì)和健康水平。 因既具有重大的學術價值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化因既具有重大的學術價值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景，被評為前景，被評為19981998年度世界十大科技進展之一年度世界十大科技進展之一?；蛐酒l(fā)展歷史基因芯片發(fā)展歷史 薩瑟恩薩瑟恩提出的提出的核酸雜交核酸雜交理論，即標記的核酸分子理論，即標記的核酸分子能夠與被固化的能夠與被固化的、與之互補配對的核酸分子雜交。與之互補配對的核酸分子雜

4、交。（Edwin Mellor SouthernEdwin Mellor Southern） Southern Southern雜交雜交可以被看作是生物芯片的雛形?？梢员豢醋魇巧镄酒碾r形。2022年年6月月3日日14時時43分分5 桑格桑格和和吉爾伯特吉爾伯特發(fā)明了現(xiàn)在廣泛使用的發(fā)明了現(xiàn)在廣泛使用的DNADNA測序測序方方法，并由此在法，并由此在19801980年獲得了年獲得了諾貝爾獎諾貝爾獎。（Frederick Sanger ）（Walter Gilbert） 生物芯片這個概念首先是由生物芯片這個概念首先是由Fred SangerFred Sanger和和Walter Walter G

5、ilbertGilbert提出的；解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術復雜、提出的；解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術復雜、自動化程度低、低通量等不足。自動化程度低、低通量等不足。2022年年6月月3日日14時時43分分6 1989，Stephen Fodor(Stephen Fodor(斯蒂文斯蒂文弗爾多弗爾多) ) 發(fā)明了發(fā)明了高密度生物芯片高密度生物芯片和和芯片閱讀器芯片閱讀器，為生物芯片產(chǎn)業(yè)開創(chuàng)，為生物芯片產(chǎn)業(yè)開創(chuàng)及發(fā)展奠定了良好的基礎。及發(fā)展奠定了良好的基礎。 1992 1992，AffymatrixAffymatrix公司公司FodorFodor小組運用半導體照小組運用半導體照相平板技術，對相平板技

6、術，對原位合成制備的原位合成制備的DNADNA芯片芯片作了首次報作了首次報道，這是世界上第一塊基因芯片。道，這是世界上第一塊基因芯片。2022年年6月月3日日14時時43分分7 1995 1995，StanfordStanford大學的大學的P.BrownP.Brown實驗室發(fā)明了第實驗室發(fā)明了第一塊以玻璃為載體的一塊以玻璃為載體的基因微矩陣芯片基因微矩陣芯片；將將cDNAcDNA密集密集點樣在玻璃片上，進行基因表達譜研究和點樣在玻璃片上，進行基因表達譜研究和SNPSNP分析。分析。2022年年6月月3日日14時時43分分8指通過微電子和微加工技術，將指通過微電子和微加工技術，將大量已知序列的

7、大量已知序列的核酸片段核酸片段或或蛋白肽蛋白肽段段等作為探針，等作為探針，有序地組合在有序地組合在1cm1cm2 2大小固相介質(zhì)表面而構成的大小固相介質(zhì)表面而構成的集成集成分析系統(tǒng)分析系統(tǒng)；2022年年6月月3日日14時時43分分10 可與標記的對應核酸或蛋白分子特異結(jié)合，實可與標記的對應核酸或蛋白分子特異結(jié)合，實現(xiàn)對核酸、蛋白等生物組分的快速、高效、敏感的現(xiàn)對核酸、蛋白等生物組分的快速、高效、敏感的處理與分析。處理與分析。 狹義的生物芯片狹義的生物芯片 包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細胞芯片和組織芯片等。細胞芯片和組織芯片等。 廣義的生物芯片廣義的生物芯片 還包括用于研

8、制生物計算機的還包括用于研制生物計算機的生物芯片生物芯片、將健康細胞與電子集成電路結(jié)合起來的、將健康細胞與電子集成電路結(jié)合起來的仿仿生芯片生芯片、縮微化的實驗室即、縮微化的實驗室即芯片實驗室芯片實驗室。根據(jù)根據(jù)芯片的用途可分為兩大類芯片的用途可分為兩大類2022年年6月月3日日14時時43分分11 生物分子間相互的特異識別和結(jié)合（如生物分子間相互的特異識別和結(jié)合（如: DNA: DNA分子互補鏈之間、蛋白分子之間、蛋白分子與分子互補鏈之間、蛋白分子之間、蛋白分子與DNADNA分子分子之間等）。之間等）。 高集成、高通量、并行化高集成、高通量、并行化, ,微型化、自動化、微型化、自動化、連續(xù)化連

9、續(xù)化2022年年6月月3日日14時時43分分12 又被稱為又被稱為基因芯片基因芯片(gene chips)、DNA陣列陣列(DNA array)、cDNA芯片芯片(cDNA chips)、寡核苷酸陣列寡核苷酸陣列(oligonucleotide array)等。等。 DNADNA芯片是指在固相支持物上芯片是指在固相支持物上寡核苷酸寡核苷酸或者直接將大量或者直接將大量預先合成的預先合成的DNADNA探針探針以顯微打印的方以顯微打印的方式有序地固化于式有序地固化于支持物表面；支持物表面； 使用時與使用時與標記的樣品雜交標記的樣品雜交，通過對雜交信號的，通過對雜交信號的檢測分析從而得出樣品的遺傳信息

10、檢測分析從而得出樣品的遺傳信息。2022年年6月月3日日14時時43分分1314A AA AA AC C C CT TC CG GT TT TT TC CG GG GG GA AA AA AA AC C C CT TC CG GT TT TT TC CG GG GG GA A原位合成芯片原位合成芯片(Synthetic Genechip)(Synthetic Genechip)DNADNA微陣列微陣列研發(fā)小組研發(fā)小組AffymatrixAffymatrix公司公司FodorFodor研研究組究組斯坦福大學斯坦福大學BrownBrown實驗室實驗室制作方式制作方式原位化學合成原位化學合成收集探針

11、，顯微打印收集探針，顯微打印探針類型探針類型寡核苷酸寡核苷酸cDNAcDNA、基因片段、寡核苷、基因片段、寡核苷酸、酸、RNARNA等等探針長度探針長度短，小于短，小于50 50 ntnt較長，較長，100100500 500 ntnt 或更長或更長最高集成度最高集成度10104040 萬點陣萬點陣/cm2/cm21 11010 萬點陣萬點陣/cm/cm2 2專利保護專利保護專利控制嚴格專利控制嚴格無專利控制無專利控制2022年年6月月3日日14時時43分分151. 1. 玻片型玻片型 這種芯片的點陣大多是通過原位合這種芯片的點陣大多是通過原位合成技術制作的，點陣密度很高，所以必須借助于特成技

12、術制作的，點陣密度很高，所以必須借助于特殊的儀器對測定結(jié)果進行解讀和分析。殊的儀器對測定結(jié)果進行解讀和分析。2022年年6月月3日日14時時43分分16 有 此 類有 此 類產(chǎn) 品 研 制產(chǎn) 品 研 制能 力 的 公能 力 的 公司不多司不多,如如Affimetrix公司。公司。2. 2. 薄膜型薄膜型如聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍如聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等。這種類型膜等。這種類型“芯片芯片”的點陣是通過的點陣是通過“點膜點膜”形形式制作的，并通過一定的方法使探針能夠牢固地結(jié)式制作的，并通過一定的方法使探針能夠牢固地結(jié)合于其上，整個過程類似于斑點雜交技術（如合于其上，整個過程類似于斑點

13、雜交技術（如Clone Tech公司）。公司）。2022年年6月月3日日14時時43分分17 3. 3. 微板型微板型 這種芯片實質(zhì)上是一種具有高密這種芯片實質(zhì)上是一種具有高密度、小容量測試孔的小型酶聯(lián)免疫檢測板（如度、小容量測試孔的小型酶聯(lián)免疫檢測板（如PEPE公司等）。公司等）。2022年年6月月3日日14時時43分分18 4. 4.集成電路型集成電路型 將雜交技術與微電子技術結(jié)將雜交技術與微電子技術結(jié)合于一體，通過電子裝置檢測或控制合于一體，通過電子裝置檢測或控制DNA等生物等生物大分子的作用過程（如大分子的作用過程（如Nanogen公司）公司）2022年年6月月3日日14時時43分分1

14、9分子印章法分子印章法針式點樣針式點樣噴墨點樣噴墨點樣 顯微光蝕刻技術顯微光蝕刻技術(光引導原位合成光引導原位合成)分子印章法分子印章法壓電打印法壓電打印法2022年年6月月3日日14時時43分分20經(jīng)化學處理經(jīng)化學處理, ,連接光敏連接光敏保護基保護基(X)(X), , 選用選用保護非聚合部位；保護非聚合部位；2. 2. 用激光點光源照射聚合部位用激光點光源照射聚合部位, ,去除光敏保護基去除光敏保護基(X), (X), 暴露暴露3. 3. 加入加入單核苷酸單核苷酸( (如如dTMPdTMP) )的亞磷酰胺活化端的亞磷酰胺活化端與與發(fā)發(fā) 生化學偶聯(lián)生化學偶聯(lián) , ,光敏保護非活化端；光敏保護

15、非活化端；4. 4. 更換掩模更換掩模(M2)(M2)，激光點光源照射下一個位點；，激光點光源照射下一個位點；5. 5. 脫保護，偶聯(lián)第二個核苷酸脫保護，偶聯(lián)第二個核苷酸( (如如dCMP)dCMP)；6. 6. 重復上述步驟，直至合成完所需探針重復上述步驟，直至合成完所需探針2022年年6月月3日日14時時43分分212022年年6月月3日日14時時43分分232022年年6月月3日日14時時43分分241、芯片制備芯片制備2 2、樣品制備與標記、樣品制備與標記3 3、雜交反應、雜交反應4 4、信號檢測和結(jié)果分析、信號檢測和結(jié)果分析2022年年6月月3日日14時時43分分25離心離心2022

16、年年6月月3日日14時時43分分26編輯打印程序、探針打印編輯打印程序、探針打印紫外線照射紫外線照射( (使探針與玻片交聯(lián)結(jié)合使探針與玻片交聯(lián)結(jié)合) )80 80 烘干固定、室溫避光保存烘干固定、室溫避光保存 NaOH NaOH乙醇浸泡振蕩至少乙醇浸泡振蕩至少2 hr2 hr；雙蒸水反復漂洗。；雙蒸水反復漂洗。溶液浸泡振蕩溶液浸泡振蕩15 min1 hr；雙；雙蒸水反復漂洗；離心、蒸水反復漂洗；離心、45 45 干燥。干燥。2022年年6月月3日日14時時43分分272022年年6月月3日日14時時43分分28( peptide nucleic acid , PNA：以以多聚多聚甘氨酸甘氨酸鏈

17、鏈替代替代糖糖- -磷酸主鏈磷酸主鏈的的DNADNA類似物類似物)2022年年6月月3日日14時時43分分292022年年6月月3日日14時時43分分30(入射入射)激光束激光束發(fā)射光發(fā)射光濾鏡濾鏡檢測透鏡檢測透鏡檢測器檢測器共聚焦共聚焦針孔針孔熒光束熒光束光束分離器光束分離器(分光鏡分光鏡)物鏡物鏡支持物支持物由樣品發(fā)射的熒光由樣品發(fā)射的熒光圖圖14-4 14-4 共聚焦掃描示意圖共聚焦掃描示意圖反反光鏡光鏡樣品樣品放大器放大器數(shù)模轉(zhuǎn)數(shù)模轉(zhuǎn)換器換器計算機計算機2022年年6月月3日日14時時43分分31激光器激光器擴光器擴光器樣品樣品濾光片濾光片針孔針孔檢測器檢測器入射光入射光 發(fā)射光發(fā)射光

18、長通濾光片長通濾光片入射光入射光 發(fā)射光發(fā)射光長通濾光片長通濾光片激光器激光器擴光器擴光器樣品樣品濾光片濾光片針孔針孔檢測器檢測器入射光入射光 發(fā)射光發(fā)射光長通濾光片長通濾光片激光器激光器擴光器擴光器樣品樣品濾光片濾光片針孔針孔檢測器檢測器2022年年6月月3日日14時時43分分355. 圖圖 像像 處處 理理Detector 1Detector 2False-color differential image2022年年6月月3日日14時時43分分372022年年6月月3日日14時時43分分38cDNA2022年年6月月3日日14時時43分分392022年年6月月3日日14時時43分分4020

19、22年年6月月3日日14時時43分分412022年年6月月3日日14時時43分分422022年年6月月3日日14時時43分分432022年年6月月3日日14時時43分分442022年年6月月3日日14時時43分分452022年年6月月3日日14時時43分分462022年年6月月3日日14時時43分分47綠綠每個探針每個探針3 3個點的陽性雜交信號均一性及個點的陽性雜交信號均一性及3 3次實次實驗的重復性均較好。驗的重復性均較好。均無信號或很弱均無信號或很弱,圖圖(1)(1)和圖和圖(2)(2)中倒中倒1 1行第行第13-1813-18個點及第個點及第7-127-12個點個點 圖圖(1)(1)和

20、圖和圖(2)(2)中倒中倒1 1行第行第1-61-6個熒光點分別代表個熒光點分別代表GAPDHGAPDH的的Cy3Cy3和和Cy5Cy5信號強度，且信號強度，且Cy3Cy3/ /Cy5Cy5 =1.0=1.0( (以以色色) )，見圖，見圖14-614-6中的中的(2)(2)所示所示 表明：探針是特異的，結(jié)果是可靠的。表明：探針是特異的，結(jié)果是可靠的。2022年年6月月3日日14時時43分分48紅色表示上調(diào)；紅色表示上調(diào)； 黃色表示不變；黃色表示不變；綠色表示下調(diào)綠色表示下調(diào)2022年年6月月3日日14時時43分分492022年年6月月3日日14時時43分分50. . . . . . .202

21、2年年6月月3日日14時時43分分52 寡核苷酸探針設計、合成，在其末端加上寡核苷酸探針設計、合成，在其末端加上1015個堿基的個堿基的polyT作為連接分子臂，分子臂末端進行氨作為連接分子臂，分子臂末端進行氨基修飾，如加上氨基臂基修飾，如加上氨基臂PO4(CH2)6NH2。 玻片通常先采用玻片通常先采用氨基硅烷氨基硅烷(3-(3-氨丙基三甲氧基硅氨丙基三甲氧基硅烷等烷等) )處理，再以處理，再以1,4-1,4-苯二異硫氰酸鹽苯二異硫氰酸鹽處理，使處理，使氨基氨基轉(zhuǎn)化為具有可與氨基反應交聯(lián)的轉(zhuǎn)化為具有可與氨基反應交聯(lián)的異硫氰酸基異硫氰酸基。 將加有將加有polyT分子臂和氨基臂分子臂和氨基臂P

22、O4(CH2)6NH2的的寡核苷酸探針在處理后的玻片上點樣、反應而牢固寡核苷酸探針在處理后的玻片上點樣、反應而牢固地結(jié)合在玻片表面地結(jié)合在玻片表面。2022年年6月月3日日14時時43分分53.GCAAACGAGGCAAACGAGT TCAAAACTCCCAAAACTCC . .TTTGCTCTTTGCTCA AGTTTTCAGTTTTCATTTGCTCTTTGCTCC CGTTTTCAGTTTTCATTTGCTCTTTGCTCG GGTTTTCAGTTTTCATTTGCTCTTTGCTCT TGTTTTCAGTTTTCATTGCTCATTGCTCAC CTTTTCAGTTTTCAGTTGCT

23、CATTGCTCAA ATTTTCAGTTTTCAGTTGCTCATTGCTCAT TTTTTCAGTTTTCAGTTGCTCATTGCTCAG GTTTTCAGTTTTCAG靶分子靶分子探針探針T TG GC CA AT T T G C T CT T T G C T C A A G T T T T C AG T T T T C AT TG GC CA AT T T G C T CT T T G C T C A A G T T T T C AG T T T T C AT-G2022年年6月月3日日14時時43分分54.特點：特點：2022年年6月月3日日14時時43分分552022年年6月月3

24、日日14時時43分分56將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，加入待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中相支持物上，加入待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術。的一種技術。 基本原理：基本原理：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間在空間構象上蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間在空間構象上能特異性的相互識別和相互結(jié)合。能特異性的相互識別和相互結(jié)合。2022年年6月月3日日14時時43分分57 最常用的探針：最常用的探針：抗體抗體 檢測方法：檢測方法：標記檢測法、直接檢

25、測法標記檢測法、直接檢測法4.4.1.1.2.2.蛋白質(zhì)芯片的載體常選擇膜性材料，如蛋白質(zhì)芯片的載體常選擇膜性材料，如 尼龍膜、尼龍膜、 NC膜、聚偏氟乙烯膜等。膜、聚偏氟乙烯膜等。3.3.蛋白質(zhì)芯片的載體的處理方法與核酸蛋白質(zhì)芯片的載體的處理方法與核酸 芯片載體芯片載體 相似。相似。2022年年6月月3日日14時時43分分581.1.待檢測樣品抗原從體液、組織細胞待檢測樣品抗原從體液、組織細胞, , 或從或從cDNAcDNA表表 達文庫中提取多肽和蛋白質(zhì)。達文庫中提取多肽和蛋白質(zhì)。2.2.若作蛋白質(zhì)組學研究，應同時制備正常與病變組若作蛋白質(zhì)組學研究，應同時制備正常與病變組 織的蛋白質(zhì)樣品?？?/p>

26、的蛋白質(zhì)樣品。3.3.蛋白質(zhì)樣品的標記：采用熒光素蛋白質(zhì)樣品的標記：采用熒光素(Cy3(Cy3、Cy5)Cy5)、放、放 射性同位素等，也可用酶標法標記。射性同位素等，也可用酶標法標記。2022年年6月月3日日14時時43分分591.1.Ag + Ab H + R Ag-Ab H-R 2.2.等等。等等。2022年年6月月3日日14時時43分分60蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)表達譜研究表達譜研究 尋找藥物尋找藥物作作尋找尋找依據(jù)依據(jù)標志性蛋白質(zhì)分子標志性蛋白質(zhì)分子 藥物療效、藥物療效、毒副作用評價毒副作用評價2022年年6月月3日日14時時43分分612022年年6月月3日日14時時43分分62 2. 2.簡述基因芯片、蛋白質(zhì)芯片各自在生物醫(yī)簡述基因芯片、蛋白質(zhì)芯片各自在生物醫(yī)學中的應用主要有哪些？學中的應用主要有哪些？思考題：思考題： 3. 3.簡述采用簡述采用DNADNA芯片作基因差異表達譜分析的芯片作基因差異表達譜分析的基本過程；在圖像重疊分析中為何出現(xiàn)紅、黃、基本過程；在圖像重疊分析中為何出現(xiàn)紅、黃、綠綠3 3種顏色，各表明什么？種顏色，各表明什么？ 1. 1.簡述生物芯片的基本原理和特征？簡述生物芯片的基本原理和特征？