掃描電鏡樣品制備.ppt

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實驗十一掃描電鏡樣品制備,選作,,,,,掃描電鏡即掃描電子顯微鏡（ScanningElectronMicroscope，簡稱SEM）。主要用于觀察樣品的表面形貌、割裂面結構、管腔內表面的結構等。,,,一、掃描電鏡工作原理：主要是利用樣品表面產生的二次電子成像來對物質的表面結構進行研究，是探索微觀世界的有力工具。主要優(yōu)點：景深長，所獲得的圖像立體感強，可用來觀察生物樣品的各種形貌特征。,二、實驗用品,材料植物的的根、莖、葉或動物的臟器等。2.試劑丙酮、乙醇、2％戊二醛溶液、1％鋨酸、0.1mol/LPH7.2磷酸緩沖液、醋酸異戊酯、液體二氧化碳、導電膠等。3.器材掃描電鏡、臨界點干燥法、真空噴鍍儀、青霉素小瓶、培養(yǎng)皿、載玻片、牙簽、脫脂棉等。,三、掃描電鏡樣品的制備,●,取樣：將取下的動植物組織放入預冷的含有2％戊二醛溶液的載玻片上，用刀片將組織塊切成長4mm左右、高3mm左右的小塊。2.樣品的清潔：把載玻片上切好的樣品快，用牙簽輕輕地逐個撥入盛有0.1mol/LPH7.2磷酸緩沖液的青霉素小瓶中漂洗，并反復更換用于清洗的緩沖液，一般漂洗1小時，換液3-4次。,3.樣品的固定樣品的固定、漂洗和脫水等處理所用的試劑和方法基本上與透射電鏡的樣品相同，但由于掃描電鏡觀察的是樣品的表面，主要是要求保持樣品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脫水過程也與透射電鏡樣品處理有不同之處。一般在4℃的條件下完成固定比較好，戊二醛、鋨酸均可單獨固定，也可用“戊二醛-鋨酸”雙重固定法。固定1-3小時（依樣品種類和固定劑而已）后，吸出固定液，加入0.1mol/LPH7.2磷酸緩沖液，漂洗1小時，換液3-4次。,4.脫水從小瓶中吸出緩沖液，加入乙醇逐級梯度脫水，脫水劑的乙醇濃度依次為30%－50%－70%－80%－90%－100%乙醇（兩次）逐級脫水；樣品在每級停留15-30分鐘。5.置換乙醇吸出乙醇，加入醋酸異戊酯與乙醇1：1的混合液，浸泡10-20分鐘并適當搖動，再吸棄混合液，加入純醋酸異戊酯浸泡10-20分鐘并適當搖動。6.樣品的干燥常規(guī)臨界點干燥法。,臨界點干燥法,臨界點干燥法是一種消除了物相界面(液相／氣相)，也就是消除了表面張力來源的干燥方法。這種方法由于沒有表面張力的影響，所以樣品不易收縮和損傷。具體處理步驟如下：裝樣：將樣品從醋酸異戊酯中挑入(或倒入)樣品籠中，用濾紙吸去樣品籠外圍的醋酸異戊酯，然后連籠移入儀器的樣品杯(高壓容器)內，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。(注：在裝樣前，應先打開儀器電源，將溫度調節(jié)設定在0℃處預冷10～15min，以保證液態(tài)二氧化碳有足夠量進入樣品杯中)。注入液體二氧化碳依次打開二氧化碳鋼瓶排氣閥和儀器的進氣閥在0～10℃下，向樣品杯注入液體二氧化碳。當液體二氧化碳充至樣品杯容積的50％(通過刻度尺觀察，以液面超過樣品籠為度)時，關閉儀器進氣閥，靜置15～20min，讓醋酸異戊酯向液態(tài)二氧化碳中充分擴散，然后，打開儀器排氣流量計閥門和進氣閥門，讓其邊排氣邊充液10min左右，(讓含有醋酸異戊酯的二氧化碳排出和充入新鮮的液態(tài)二氧化碳)再關閉排氣閥；繼續(xù)充入液體二氧化碳至樣品杯的80％左右，關閉進液閥，停止充液。,加溫置換：將溫度調節(jié)設定在20℃處經15～20min后，由于溫度升高，杯內液體二氧化碳逐漸氣化，因此，壓力也隨之上升至7000Pa左右，樣品中的醋酸異戊酯將與二氧化碳充分置換。氣化：將溫度旋鈕調至臨界溫度以上(35～40℃)，此時隨著溫度升高，樣品杯內的壓力也逐漸增加，達到二氧化碳的臨介點，界面也隨之消失。當壓力達到7134Pa時，經5min后，即可排氣。排氣：在保持溫度不變的條件下(即不關電源)，打開流量計的排氣閥門，以1.0～1.51／min的速度排氣(速度慢些更好)。約經45～60min后，排氣完畢，樣品杯的壓力下降到零，將溫度調節(jié)至室溫約5rain后，即可取出樣品裝臺鍍膜(若不能立即裝臺，應置于干燥器內保存)。,臨界點干燥操作時的注意事項：在樣品放進樣品杯前，樣品杯應預先冷卻至0～10℃。樣品不宜過濕，但也不能讓其表面干涸，應在半干半濕時送入樣品杯。因為過濕表明乙酸異戊脂太多會干燥后樣品仍含有乙酸異戊脂，影響干燥效果。而過干又會因空氣干燥而造成樣品己變形，再進行臨介點干燥也沒有意義了。一次加入的樣品不宜過多，以免帶進過多的中間液，使樣品干燥不完全，另外，樣品過多使二氧化碳量充入不足而達不到臨界點。充入液體二氧化碳的量要足。因為充液量不足，達不到臨界值，起不到臨界點干燥作用，一般充液量應達樣品杯容積的2/3左右。在加溫氣化時，實際操作溫度應超過臨界值，以保證達到充分的臨界狀態(tài)。"開"、"閉"閥門時，動作要輕緩，盡量防止二氧化碳液對樣品產生突然沖擊而造成樣品損傷。因此，樣品籠的上下應墊上一層鏡頭紙或濾紙。排氣速度也應盡量緩慢，一般放氣時間應在．4Omin以上，有時也可以放氣過夜或過中午。,7.粘貼樣品用牙簽將少量導電膠涂到樣品臺上，膠面應略小于樣品底面。用鑷子輕夾樣品側面，保證觀察面向上貼牢在涂膠上。粘貼后，待導電膠干透，才能進行真空鍍膜和SEM鏡檢。8.樣品的導電處理生物樣品和其他非金屬樣品的表面電阻率很高，在電鏡觀察時，往往容易發(fā)生荷電現象。另外，生物樣品都是由低原子序數的碳、氫、氧、氮等元素組成，二次電子的發(fā)射率很低，信號弱，難以獲得必要的圖像反差。因此，為了消除或減少以上不良現象的產生，生物樣品和非導電的樣品在掃描電鏡觀察前，均需進行表面導電處理。掃描電鍍樣品的表面導電處理方法，主要有金屬鍍膜法和組織導電處理法兩種。其中金屬鍍膜法又有真空鍍膜及離子濺射鍍膜法等方法，本實驗采用離子濺射鍍膜法進行鍍膜。,離子濺射鍍膜法:,在低真空中進行輝光放電時，由于離子沖擊，陰極金屬物質有飛濺現象稱為濺射。利用離子濺射儀對樣品進行金屬鍍膜的方法，稱為濺射鍍膜法。濺射鍍膜法的裝置很簡單，主要由真空部分(真空泵)和濺射部分(真空罩)組成，在真空罩內裝有陰極和陽極，陰極對著陽極的一面裝有用于濺射用的金屬靶(黃金靶、鉑靶、白金靶或鈀靶等)，樣品放在陽極的樣品座上面。當真空罩內的真空度抽到10～1Pa時，在陰極與陽極之間加上1000～3000V的直流電壓，兩極之間產生弧光放電的電場。在電場的作用下，罩內殘余的氣體分子被電離為正離子和電子，正離子被陰極吸引轟擊金屬靶，激發(fā)出金屬顆粒和電子，并被陽極吸引附著在樣品表面而形成金屬導電膜。,離子濺射鍍膜法操作注意事項：樣品要充分干燥，否則，金屬顆粒不但不能附著，反而會引起樣品損傷，特別是能放出有機氣體的樣品，有機氣體會因放電而分解，使樣品引起碳化污染。加高壓時輝光放電的顏色應為藍色或紫藍色，若是紅色，應立即停止加高壓，繼續(xù)抽氣。加高壓后，若真空度下降幅度較大，應立即停止鍍膜，待充分抽氣后再繼續(xù)鍍膜。,一些電鏡圖片,染色體染色體被精子包圍的卵子,骨髓細胞SARSAIDS,