掃描電鏡樣品制備.ppt

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實(shí)驗(yàn)十一掃描電鏡樣品制備,選作,,,,,掃描電鏡即掃描電子顯微鏡（ScanningElectronMicroscope，簡(jiǎn)稱SEM）。主要用于觀察樣品的表面形貌、割裂面結(jié)構(gòu)、管腔內(nèi)表面的結(jié)構(gòu)等。,,,一、掃描電鏡工作原理：主要是利用樣品表面產(chǎn)生的二次電子成像來對(duì)物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，是探索微觀世界的有力工具。主要優(yōu)點(diǎn)：景深長(zhǎng)，所獲得的圖像立體感強(qiáng)，可用來觀察生物樣品的各種形貌特征。,二、實(shí)驗(yàn)用品,材料植物的的根、莖、葉或動(dòng)物的臟器等。2.試劑丙酮、乙醇、2％戊二醛溶液、1％鋨酸、0.1mol/LPH7.2磷酸緩沖液、醋酸異戊酯、液體二氧化碳、導(dǎo)電膠等。3.器材掃描電鏡、臨界點(diǎn)干燥法、真空噴鍍儀、青霉素小瓶、培養(yǎng)皿、載玻片、牙簽、脫脂棉等。,三、掃描電鏡樣品的制備,●,取樣：將取下的動(dòng)植物組織放入預(yù)冷的含有2％戊二醛溶液的載玻片上，用刀片將組織塊切成長(zhǎng)4mm左右、高3mm左右的小塊。2.樣品的清潔：把載玻片上切好的樣品快，用牙簽輕輕地逐個(gè)撥入盛有0.1mol/LPH7.2磷酸緩沖液的青霉素小瓶中漂洗，并反復(fù)更換用于清洗的緩沖液，一般漂洗1小時(shí)，換液3-4次。,3.樣品的固定樣品的固定、漂洗和脫水等處理所用的試劑和方法基本上與透射電鏡的樣品相同，但由于掃描電鏡觀察的是樣品的表面，主要是要求保持樣品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脫水過程也與透射電鏡樣品處理有不同之處。一般在4℃的條件下完成固定比較好，戊二醛、鋨酸均可單獨(dú)固定，也可用“戊二醛-鋨酸”雙重固定法。固定1-3小時(shí)（依樣品種類和固定劑而已）后，吸出固定液，加入0.1mol/LPH7.2磷酸緩沖液，漂洗1小時(shí)，換液3-4次。,4.脫水從小瓶中吸出緩沖液，加入乙醇逐級(jí)梯度脫水，脫水劑的乙醇濃度依次為30%－50%－70%－80%－90%－100%乙醇（兩次）逐級(jí)脫水；樣品在每級(jí)停留15-30分鐘。5.置換乙醇吸出乙醇，加入醋酸異戊酯與乙醇1：1的混合液，浸泡10-20分鐘并適當(dāng)搖動(dòng)，再吸棄混合液，加入純醋酸異戊酯浸泡10-20分鐘并適當(dāng)搖動(dòng)。6.樣品的干燥常規(guī)臨界點(diǎn)干燥法。,臨界點(diǎn)干燥法,臨界點(diǎn)干燥法是一種消除了物相界面(液相／氣相)，也就是消除了表面張力來源的干燥方法。這種方法由于沒有表面張力的影響，所以樣品不易收縮和損傷。具體處理步驟如下：裝樣：將樣品從醋酸異戊酯中挑入(或倒入)樣品籠中，用濾紙吸去樣品籠外圍的醋酸異戊酯，然后連籠移入儀器的樣品杯(高壓容器)內(nèi)，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。(注：在裝樣前，應(yīng)先打開儀器電源，將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在0℃處預(yù)冷10～15min，以保證液態(tài)二氧化碳有足夠量進(jìn)入樣品杯中)。注入液體二氧化碳依次打開二氧化碳鋼瓶排氣閥和儀器的進(jìn)氣閥在0～10℃下，向樣品杯注入液體二氧化碳。當(dāng)液體二氧化碳充至樣品杯容積的50％(通過刻度尺觀察，以液面超過樣品籠為度)時(shí)，關(guān)閉儀器進(jìn)氣閥，靜置15～20min，讓醋酸異戊酯向液態(tài)二氧化碳中充分?jǐn)U散，然后，打開儀器排氣流量計(jì)閥門和進(jìn)氣閥門，讓其邊排氣邊充液10min左右，(讓含有醋酸異戊酯的二氧化碳排出和充入新鮮的液態(tài)二氧化碳)再關(guān)閉排氣閥；繼續(xù)充入液體二氧化碳至樣品杯的80％左右，關(guān)閉進(jìn)液閥，停止充液。,加溫置換：將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在20℃處經(jīng)15～20min后，由于溫度升高，杯內(nèi)液體二氧化碳逐漸氣化，因此，壓力也隨之上升至7000Pa左右，樣品中的醋酸異戊酯將與二氧化碳充分置換。氣化：將溫度旋鈕調(diào)至臨界溫度以上(35～40℃)，此時(shí)隨著溫度升高，樣品杯內(nèi)的壓力也逐漸增加，達(dá)到二氧化碳的臨介點(diǎn)，界面也隨之消失。當(dāng)壓力達(dá)到7134Pa時(shí)，經(jīng)5min后，即可排氣。排氣：在保持溫度不變的條件下(即不關(guān)電源)，打開流量計(jì)的排氣閥門，以1.0～1.51／min的速度排氣(速度慢些更好)。約經(jīng)45～60min后，排氣完畢，樣品杯的壓力下降到零，將溫度調(diào)節(jié)至室溫約5rain后，即可取出樣品裝臺(tái)鍍膜(若不能立即裝臺(tái)，應(yīng)置于干燥器內(nèi)保存)。,臨界點(diǎn)干燥操作時(shí)的注意事項(xiàng)：在樣品放進(jìn)樣品杯前，樣品杯應(yīng)預(yù)先冷卻至0～10℃。樣品不宜過濕，但也不能讓其表面干涸，應(yīng)在半干半濕時(shí)送入樣品杯。因?yàn)檫^濕表明乙酸異戊脂太多會(huì)干燥后樣品仍含有乙酸異戊脂，影響干燥效果。而過干又會(huì)因空氣干燥而造成樣品己變形，再進(jìn)行臨介點(diǎn)干燥也沒有意義了。一次加入的樣品不宜過多，以免帶進(jìn)過多的中間液，使樣品干燥不完全，另外，樣品過多使二氧化碳量充入不足而達(dá)不到臨界點(diǎn)。充入液體二氧化碳的量要足。因?yàn)槌湟毫坎蛔?，達(dá)不到臨界值，起不到臨界點(diǎn)干燥作用，一般充液量應(yīng)達(dá)樣品杯容積的2/3左右。在加溫氣化時(shí)，實(shí)際操作溫度應(yīng)超過臨界值，以保證達(dá)到充分的臨界狀態(tài)。"開"、"閉"閥門時(shí)，動(dòng)作要輕緩，盡量防止二氧化碳液對(duì)樣品產(chǎn)生突然沖擊而造成樣品損傷。因此，樣品籠的上下應(yīng)墊上一層鏡頭紙或?yàn)V紙。排氣速度也應(yīng)盡量緩慢，一般放氣時(shí)間應(yīng)在．4Omin以上，有時(shí)也可以放氣過夜或過中午。,7.粘貼樣品用牙簽將少量導(dǎo)電膠涂到樣品臺(tái)上，膠面應(yīng)略小于樣品底面。用鑷子輕夾樣品側(cè)面，保證觀察面向上貼牢在涂膠上。粘貼后，待導(dǎo)電膠干透，才能進(jìn)行真空鍍膜和SEM鏡檢。8.樣品的導(dǎo)電處理生物樣品和其他非金屬樣品的表面電阻率很高，在電鏡觀察時(shí)，往往容易發(fā)生荷電現(xiàn)象。另外，生物樣品都是由低原子序數(shù)的碳、氫、氧、氮等元素組成，二次電子的發(fā)射率很低，信號(hào)弱，難以獲得必要的圖像反差。因此，為了消除或減少以上不良現(xiàn)象的產(chǎn)生，生物樣品和非導(dǎo)電的樣品在掃描電鏡觀察前，均需進(jìn)行表面導(dǎo)電處理。掃描電鍍樣品的表面導(dǎo)電處理方法，主要有金屬鍍膜法和組織導(dǎo)電處理法兩種。其中金屬鍍膜法又有真空鍍膜及離子濺射鍍膜法等方法，本實(shí)驗(yàn)采用離子濺射鍍膜法進(jìn)行鍍膜。,離子濺射鍍膜法:,在低真空中進(jìn)行輝光放電時(shí)，由于離子沖擊，陰極金屬物質(zhì)有飛濺現(xiàn)象稱為濺射。利用離子濺射儀對(duì)樣品進(jìn)行金屬鍍膜的方法，稱為濺射鍍膜法。濺射鍍膜法的裝置很簡(jiǎn)單，主要由真空部分(真空泵)和濺射部分(真空罩)組成，在真空罩內(nèi)裝有陰極和陽(yáng)極，陰極對(duì)著陽(yáng)極的一面裝有用于濺射用的金屬靶(黃金靶、鉑靶、白金靶或鈀靶等)，樣品放在陽(yáng)極的樣品座上面。當(dāng)真空罩內(nèi)的真空度抽到10～1Pa時(shí)，在陰極與陽(yáng)極之間加上1000～3000V的直流電壓，兩極之間產(chǎn)生弧光放電的電場(chǎng)。在電場(chǎng)的作用下，罩內(nèi)殘余的氣體分子被電離為正離子和電子，正離子被陰極吸引轟擊金屬靶，激發(fā)出金屬顆粒和電子，并被陽(yáng)極吸引附著在樣品表面而形成金屬導(dǎo)電膜。,離子濺射鍍膜法操作注意事項(xiàng)：樣品要充分干燥，否則，金屬顆粒不但不能附著，反而會(huì)引起樣品損傷，特別是能放出有機(jī)氣體的樣品，有機(jī)氣體會(huì)因放電而分解，使樣品引起碳化污染。加高壓時(shí)輝光放電的顏色應(yīng)為藍(lán)色或紫藍(lán)色，若是紅色，應(yīng)立即停止加高壓，繼續(xù)抽氣。加高壓后，若真空度下降幅度較大，應(yīng)立即停止鍍膜，待充分抽氣后再繼續(xù)鍍膜。,一些電鏡圖片,染色體染色體被精子包圍的卵子,骨髓細(xì)胞SARSAIDS,