流式細胞儀檢測細胞周期操作步驟.doc

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流式細胞儀檢測細胞周期操作步驟取對數生長期的A549細胞，按1106 cells/ mL以1mL接種于100mm培養(yǎng)皿內24h后，進行所需的處理（比如加藥,照射）特定時間后終止培養(yǎng)，進行下一步的實驗收集原培養(yǎng)液，洗后的PBS和消化后的細胞，將三者混勻放入15ml離心管中1000rpm離心5min（短時低速離心）棄上清，用1.5ml預冷PBS，1000rpm離心5min后去除PBS和細胞懸液內的細胞碎片加入1.5ml預冷PBS,在渦旋狀態(tài)下加入3.5ml無水乙醇，混勻后，于4固定30min,或-20長期保存。1000r/min,離心5min將乙醇吸除，加PBS清洗混勻1000r/min,5min再離心一遍，將殘留在細胞上的乙醇除去吸除離心管內PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37下孵育30min)加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室溫下避光染色30min 將離心管內的細胞過濾(300um尼龍網膜)至含有PBS的EP管中（PI具有很強的粘附性，容易使細胞聚團），標記EP管提前一天網上預約開機（先開儀器后開軟件）流式細胞儀的結構一般分為5部分：流動室及液流驅動系統(tǒng)； 激光光源及光束成形系統(tǒng)； 光學系統(tǒng)； 信號檢測、存貯、顯示、分析系統(tǒng)； 細胞分選系統(tǒng)。檢測前先渦旋使細胞混勻懸浮呈單個細胞，然后插入流式細胞儀上流動室內充滿鞘液，細胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細胞液柱液柱與激光束相交，細胞上的熒光染料被激發(fā)產生熒光（488nm激發(fā)光源）熒光信號變成電信號輸出到計算機，軟件分析（熒光染料和細胞DNA分子特異性結合，可以檢測出細胞周期各時相細胞比例）在用第三方軟件分析之前，將流式結果按如下所示導出結果分析Modfit軟件分析圖片拷貝：直接Ctrl+CFlowjo軟件分析FCM-DNA 量分析 1 個細胞增殖群時，可將DNA 含量分布組方圖分為三部分，即 G0/1、S、G2M。G0/1和G2M 細胞峰的 DNA 分布均為正態(tài)分布，S 期可以認為是一個加寬的正態(tài)分布檢測結果刻錄光盤保存關機（先關軟件后關儀器，關機前需清洗）正常細胞DNA含量：2n-4n凋亡細胞：核內DNA斷裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丟失，胞內DNA含量減少。PI染色后，熒光強度減小而形成一個DNA含量小于2n的分布區(qū)（亞G1峰）。1、縱坐標Cell Number：即計數的有效細胞數； 2、橫坐標DNA Content：即DNA含量； 3、G1、G2、S三期在圖中已經標示；4、右側數字含義：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值為55.56；53.84%即G1期細胞數占總數的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值為107.72，5.64%即G2期細胞數占總數的5.64%；Annexin V-EGFP/PI雙染法檢測細胞凋亡基本原理：磷脂酰絲氨酸（PS）能與連接素（Annexin）發(fā)生特異結合；PI是核酸熒光染料，不能透過正常細胞膜，只能進入已經破損的細胞膜，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光，熒光強度與PI結合量呈良好的線性關系。正常細胞：膜完整，PS不外翻PI-/Annexin-凋亡早期：膜完整，PS翻轉PI-/Annexin+凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加PI+/Annexin+壞死細胞：膜嚴重破損，PS不外翻PI+/Annexin+ 幾乎不存在膜結構PI+/Annexin-實驗步驟：取對數生長期的細胞，按1106 cells/ mL以1mL接種于培養(yǎng)皿內24h后，進行所需的處理（比如加入藥物）特定時間后終止培養(yǎng)，進行下一步的實驗細胞用0.25%胰酶37消化5min(胰酶消化時間不易過長，以防引起假陽性）加入PBS制成細胞懸液（移液槍吹打6-8次）倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)（單個分離懸?。⒓毎麘乙阂迫?5ml離心管中2000rpm離心5min,PBS吸除用PBS 清洗細胞2次（2000rpm，離心5min收集細胞）用400ul 1Binding Buffer 懸浮細胞(濃度大約為1106 cells/ml)在細胞懸液中加入5ul Annexin V-EGFP，輕輕混勻后于2-8避光條件下孵育15 min加入10ul PI 后輕輕混勻,于2-8避光條件下孵育5 min在1 h內用流式細胞儀檢測 流式細胞儀激發(fā)光波長采用Ex.= 488nm雙波長激發(fā)，Em.= 510 nm檢測EGFP熒光(FL1 channel)和575 nm的發(fā)射波長檢測PI。細胞應可分成三個亞群：活細胞僅有很低的熒光強度，凋亡細胞有較強的綠色熒光，壞死細胞（包括極晚期凋亡細胞）有綠色和紅色熒光雙重染色。在流式細胞術雙參數散點圖上左下象限顯示活細胞，為（Annexin V-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為Annexin V +/PI+；而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)Annexin V +/PI-。