流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期操作步驟.doc

《流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期操作步驟.doc》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期操作步驟.doc（11頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期操作步驟取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，按1106 cells/ mL以1mL接種于100mm培養(yǎng)皿內(nèi)24h后，進(jìn)行所需的處理（比如加藥,照射）特定時(shí)間后終止培養(yǎng)，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)收集原培養(yǎng)液，洗后的PBS和消化后的細(xì)胞，將三者混勻放入15ml離心管中1000rpm離心5min（短時(shí)低速離心）棄上清，用1.5ml預(yù)冷PBS，1000rpm離心5min后去除PBS和細(xì)胞懸液內(nèi)的細(xì)胞碎片加入1.5ml預(yù)冷PBS,在渦旋狀態(tài)下加入3.5ml無(wú)水乙醇，混勻后，于4固定30min,或-20長(zhǎng)期保存。1000r/min,離心5min將乙醇吸除，加PBS清洗混勻1000r/min,5min再離心一遍，將殘留在細(xì)胞上的乙醇除去吸除離心管內(nèi)PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37下孵育30min)加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室溫下避光染色30min 將離心管內(nèi)的細(xì)胞過(guò)濾(300um尼龍網(wǎng)膜)至含有PBS的EP管中（PI具有很強(qiáng)的粘附性，容易使細(xì)胞聚團(tuán)），標(biāo)記EP管提前一天網(wǎng)上預(yù)約開(kāi)機(jī)（先開(kāi)儀器后開(kāi)軟件）流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)一般分為5部分：流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)； 激光光源及光束成形系統(tǒng)； 光學(xué)系統(tǒng)； 信號(hào)檢測(cè)、存貯、顯示、分析系統(tǒng)； 細(xì)胞分選系統(tǒng)。檢測(cè)前先渦旋使細(xì)胞混勻懸浮呈單個(gè)細(xì)胞，然后插入流式細(xì)胞儀上流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，細(xì)胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱液柱與激光束相交，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光（488nm激發(fā)光源）熒光信號(hào)變成電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，軟件分析（熒光染料和細(xì)胞DNA分子特異性結(jié)合，可以檢測(cè)出細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞比例）在用第三方軟件分析之前，將流式結(jié)果按如下所示導(dǎo)出結(jié)果分析Modfit軟件分析圖片拷貝：直接Ctrl+CFlowjo軟件分析FCM-DNA 量分析 1 個(gè)細(xì)胞增殖群時(shí)，可將DNA 含量分布組方圖分為三部分，即 G0/1、S、G2M。G0/1和G2M 細(xì)胞峰的 DNA 分布均為正態(tài)分布，S 期可以認(rèn)為是一個(gè)加寬的正態(tài)分布檢測(cè)結(jié)果刻錄光盤保存關(guān)機(jī)（先關(guān)軟件后關(guān)儀器，關(guān)機(jī)前需清洗）正常細(xì)胞DNA含量：2n-4n凋亡細(xì)胞：核內(nèi)DNA斷裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丟失，胞內(nèi)DNA含量減少。PI染色后，熒光強(qiáng)度減小而形成一個(gè)DNA含量小于2n的分布區(qū)（亞G1峰）。1、縱坐標(biāo)Cell Number：即計(jì)數(shù)的有效細(xì)胞數(shù)； 2、橫坐標(biāo)DNA Content：即DNA含量； 3、G1、G2、S三期在圖中已經(jīng)標(biāo)示；4、右側(cè)數(shù)字含義：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值為55.56；53.84%即G1期細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值為107.72，5.64%即G2期細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的5.64%；Annexin V-EGFP/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡基本原理：磷脂酰絲氨酸（PS）能與連接素（Annexin）發(fā)生特異結(jié)合；PI是核酸熒光染料，不能透過(guò)正常細(xì)胞膜，只能進(jìn)入已經(jīng)破損的細(xì)胞膜，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光，熒光強(qiáng)度與PI結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系。正常細(xì)胞：膜完整，PS不外翻PI-/Annexin-凋亡早期：膜完整，PS翻轉(zhuǎn)PI-/Annexin+凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加PI+/Annexin+壞死細(xì)胞：膜嚴(yán)重破損，PS不外翻PI+/Annexin+ 幾乎不存在膜結(jié)構(gòu)PI+/Annexin-實(shí)驗(yàn)步驟：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1106 cells/ mL以1mL接種于培養(yǎng)皿內(nèi)24h后，進(jìn)行所需的處理（比如加入藥物）特定時(shí)間后終止培養(yǎng)，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞用0.25%胰酶37消化5min(胰酶消化時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，以防引起假陽(yáng)性）加入PBS制成細(xì)胞懸液（移液槍吹打6-8次）倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)（單個(gè)分離懸?。⒓?xì)胞懸液移入15ml離心管中2000rpm離心5min,PBS吸除用PBS 清洗細(xì)胞2次（2000rpm，離心5min收集細(xì)胞）用400ul 1Binding Buffer 懸浮細(xì)胞(濃度大約為1106 cells/ml)在細(xì)胞懸液中加入5ul Annexin V-EGFP，輕輕混勻后于2-8避光條件下孵育15 min加入10ul PI 后輕輕混勻,于2-8避光條件下孵育5 min在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè) 流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)采用Ex.= 488nm雙波長(zhǎng)激發(fā)，Em.= 510 nm檢測(cè)EGFP熒光(FL1 channel)和575 nm的發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)PI。細(xì)胞應(yīng)可分成三個(gè)亞群：活細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，凋亡細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光，壞死細(xì)胞（包括極晚期凋亡細(xì)胞）有綠色和紅色熒光雙重染色。在流式細(xì)胞術(shù)雙參數(shù)散點(diǎn)圖上左下象限顯示活細(xì)胞，為（Annexin V-/PI-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為Annexin V +/PI+；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)Annexin V +/PI-。