熒光分光光度法測(cè)定藥液維生素B2含量總論ppt課件

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熒光分光光度法測(cè)定藥液維生素B2的含量,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)熒光分光光度法測(cè)定藥液中維生素B2的分析原理。 掌握熒光分光光度計(jì)的操作技術(shù)和測(cè)定藥液中維生素B2 的方法。,1,實(shí)驗(yàn)原理,常溫下，處于基態(tài)的分子吸收一定的紫外可見光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子通過無輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再以輻射躍遷的形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長長的光而產(chǎn)生熒光。 在稀溶液中，熒光強(qiáng)度IF與物質(zhì)的濃度c有以下的關(guān)系： 當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系： 這是熒光光譜法定量分析的理論依據(jù)。,2,a. 與紫外-可見分光度法比較，熒光分析法具有更高的靈敏度。 b. 選擇性好。熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜，又能依據(jù)吸收光譜來鑒定物質(zhì)。 c. 所需試樣量少、操作方法簡(jiǎn)便。,3,激發(fā)光譜：固定測(cè)量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大。 發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長), 化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。 固定發(fā)射光波長進(jìn)行激發(fā)光波長掃描，找出最大激發(fā)光波長，然后固定激發(fā)光波長進(jìn)行熒光發(fā)射波長掃描，找出最大熒光發(fā)射波長。激發(fā)光波長和發(fā)射熒光波長的選擇是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。,激發(fā)光譜,發(fā)射光譜,4,常用的熒光分析儀器由激發(fā)光源、單色器、液槽、檢測(cè)器和顯示記錄器五部分構(gòu)成，如下圖所示： 熒光分析儀器與分光光度計(jì)比較主要差別有兩點(diǎn)： a.熒光分析儀器采用垂直測(cè)量方式，以消除透射光的影響； b.熒光分析儀器有兩個(gè)單色器，能夠獲得單色性較好的激發(fā)光并消除其它雜散光干擾。,5,a.光源：在熒光計(jì)中常用鹵鎢燈作光源；熒光分度計(jì)常采用高壓汞燈或氙弧燈做光源。 b.單色器：熒光計(jì)的單色器是濾光片，只能用于定量分析；熒光分光光度計(jì)采用兩個(gè)光柵單色器，可獲得激發(fā)光譜和熒光光譜。 c.檢測(cè)器：熒光計(jì)采用光電管作檢測(cè)器；熒光分光光度計(jì)采用光電倍增管作檢測(cè)器。,儀器部件,6,維生素B2（又叫核黃素，VB2）是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶，其結(jié)構(gòu)式為： 維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對(duì)熱穩(wěn)定。,7,維生素B2溶液在430440 nm藍(lán)光的照射下，發(fā)出綠色熒光，其峰值波長為525 nm。VB2的熒光在pH=67時(shí)最強(qiáng)，在pH=11時(shí)消失。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會(huì)發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多，故測(cè)VB2的熒光時(shí)溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行。,光黃素,8,實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí),預(yù)習(xí)熒光分光光度法測(cè)定維生素B2的分析原理。 了解熒光光度計(jì)的操作步驟和測(cè)定維生素B2 的方法。,9,F96型熒光光度計(jì)（上海棱光分析儀器有限公司） 5 mL吸量管1只，2 mL吸量管1只， 50 mL容量瓶7只 10.0gmL-1VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液（置陰暗處保存），冰乙酸（AR）， 藥用VB2試樣,儀器與試劑,10,1. 打開氙燈，再打開主機(jī)，然后打開計(jì)算機(jī)啟動(dòng)工作站并初始化儀器。 2. 儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測(cè)量項(xiàng)目，設(shè)置適當(dāng)?shù)膬x器參數(shù)：激發(fā)波長= 440 nm（本儀器只有356 nm ），發(fā)射波長=540 nm。 3. 樣品測(cè)定。 4. 退出主程序，關(guān)閉計(jì)算機(jī)，先關(guān)主機(jī)，最后關(guān)氙燈。,基本操作,11,1. 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度的測(cè)定： 在六個(gè)干凈的50 mL容量瓶中，分別吸取0.50、1.00、1.50，2.00 、2.50和3.00 mL VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入2.00 mL冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。從稀到濃測(cè)量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。 2. 未知試樣的測(cè)定: 移取0.1 mL試樣,用少量水溶解后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，加2.00 mL冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。用測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列時(shí)相同的條件，測(cè)量其熒光強(qiáng)度。,實(shí)驗(yàn)步驟,12,1. 用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。 2. 根據(jù)待測(cè)液的熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得其濃度，計(jì)算出試樣中VB2含量。,數(shù)據(jù)處理,13,1. 解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因。 2. 維生素B2在pH67時(shí)熒光最強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)為何在酸性溶液中測(cè)定？,注意事項(xiàng)和問題,14,