發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)

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實(shí)驗(yàn)一 酸奶的制作與乳酸菌的活菌計(jì)數(shù)（5學(xué)時(shí)） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模? 1、學(xué)習(xí)并掌握酸奶制作的基本原理與方法。 2、了解市售酸奶的生產(chǎn)工藝。 3、掌握乳酸菌活菌計(jì)數(shù)方法與操作。 實(shí)驗(yàn)原理： 乳酸菌在乳中生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵分解乳糖產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，導(dǎo)致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等電點(diǎn)附近發(fā)生凝集。 乳酸菌屬于兼性厭氧微生物，在無(wú)氧條件下生長(zhǎng)繁殖較好，實(shí)驗(yàn)室條件下利用混菌培養(yǎng)的方法，盡可能讓乳酸菌在無(wú)氧條件下生長(zhǎng)，每個(gè)單菌落代表一個(gè)微生物細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： （一）酸奶制作 1、10%脫脂奶粉溶解于熱水（80℃左右）中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，配成調(diào)制乳； 2、添加蔗糖：為了緩和酸奶的酸味，改善酸奶口味，在調(diào)制乳中加人4-8％的蔗糖。 3、滅菌：方法有兩種：將乳加熱至90℃，保溫5min； 4、接種：往冷卻到43-45℃滅過(guò)菌的乳中加入乳酸菌，接種量為2%-5%。 5、分裝：酸奶受到振動(dòng)，乳凝狀態(tài)易被破壞，因此，不能在發(fā)酵罐容器中先發(fā)酵然后再進(jìn)行分裝，須是將含有乳酸菌的牛乳培養(yǎng)基先分裝到小容器中，加蓋后送入恒溫室培養(yǎng)，在小容器中發(fā)酵制成酸奶。 6、發(fā)酵：發(fā)酵的溫度保持在40-43 ℃，一般發(fā)酵時(shí)間為3-6h。 發(fā)酵終點(diǎn)的確定有兩種方法： 1）檢測(cè)發(fā)酵奶的酸度，達(dá)到65-70 T。 2）傾斜觀察，瓶?jī)?nèi)酸奶流動(dòng)性差，而且瓶中部有細(xì)微顆粒出現(xiàn)。 7、冷卻：發(fā)酵結(jié)束，將酸奶從發(fā)酵室取出，用冷風(fēng)迅速將其冷印到10℃以下，一般2 h，使酸奶中的乳酸菌停止生長(zhǎng)，防止酸奶酸度過(guò)高而影響口感。 8、冷藏和后熟：經(jīng)冷卻處理的酸奶，貯藏在2-5℃的冷藏室中保存。 9、感官指標(biāo) 1）色澤：色澤均勻一致，呈乳白色，或稍帶微黃色。 2）組織狀態(tài)：凝塊稠密結(jié)實(shí)均勻細(xì)膩，無(wú)氣泡，允許少量乳清析出。 3）氣味：具有清香純凈的乳酸味，無(wú)酒精發(fā)酵味，無(wú)霉味和其他外來(lái)不良?xì)馕丁? （二）乳酸菌活菌檢測(cè) ①、檢測(cè)培養(yǎng)基：蛋白胨15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化鈉5g，碳酸鈣10g，瓊脂粉20g，水1000ml，115～121℃滅菌20min，滅菌后放置水浴52℃保溫備用。 ②、稀釋：取10克樣品放入添加90ml無(wú)菌水的帶4-6顆玻璃珠的250ml三角瓶中，搖床180rpm震蕩30min，即為10－1樣品溶液；再?gòu)闹腥?ml至添加9.0ml無(wú)菌生理鹽水三角瓶中，稀釋至10－2，以此類推稀釋至10－8，即稀釋了1億倍; ③、倒培養(yǎng)平板，從上述已稀釋了1億倍的乳酸菌懸液中取1ml，在無(wú)菌操作臺(tái)上注入9.0cm培養(yǎng)皿中，再將已經(jīng)滅了菌的保持在52℃水浴鍋中的呈溶解狀態(tài)的培養(yǎng)基，倒入15毫升左右于培養(yǎng)皿中，全部浸到培養(yǎng)皿，與菌懸液充分混合均勻（倒入培養(yǎng)基后，馬上用手轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)動(dòng)幾下，讓其混合均勻），然后等其凝固再移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，注意最后一步倒平皿必須在超凈臺(tái)無(wú)菌操作，以免雜菌污染。每次稀釋均要換滅好菌的移液管。 ④、培養(yǎng)條件：37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72h。 ⑤、培養(yǎng)完畢后，取出進(jìn)行計(jì)數(shù)，因?yàn)槭窍♂屃?億倍，所以一個(gè)透明圈菌落代表1億/克，如果有200個(gè)透明圈，則是200億/克。 實(shí)驗(yàn)器材及試劑： 菌種：市售酸奶 試劑：白糖 奶粉 培養(yǎng)基各成分 器材：培養(yǎng)箱、電爐、鋁鍋5L，培養(yǎng)皿，酸奶發(fā)酵瓶（自帶） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、 詳細(xì)描述自己制作的酸奶結(jié)果： 答：制作后酸奶與市場(chǎng)所售酸奶比較，比市場(chǎng)所售酸奶更稠密，酸奶的香味與酸味明顯，制作成功 2、 記錄個(gè)人酸奶中各菌數(shù)測(cè)定的平行數(shù)據(jù)，計(jì)算最終平均值。 答：最終培養(yǎng)基上未出現(xiàn)乳酸菌菌落，全部為雜菌菌落，因此無(wú)法統(tǒng)計(jì)酸奶中的菌含量 3、 同時(shí)用圖片記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各現(xiàn)象與結(jié)果并對(duì)圖進(jìn)行注釋。 答：制備乳酸菌時(shí)，瓶子上方留有一部分空間，并未使乳酸菌完全處于無(wú)氧環(huán)境中發(fā)酵，但乳酸菌是兼性厭氧菌，因此在存在少量氧氣的環(huán)境中，乳酸菌也可以生長(zhǎng)，酸奶制備成功。但在平板接種時(shí)，由于污染雜菌，乳酸菌并未長(zhǎng)出。乳酸菌計(jì)數(shù)失敗。 思考題： 乳酸菌的保藏通常為低溫條件，這給運(yùn)輸、保藏帶來(lái)很大的成本，請(qǐng)問(wèn)可采用什么方法使乳酸菌在常溫條件下有很高的存活率？ 答：在基因水平上對(duì)乳酸菌進(jìn)行基因重組，從而獲得耐高溫乳酸菌。在基因庫(kù)里篩選抗高溫的基因并利用基因重組技術(shù)將其重組在乳酸菌基因上，對(duì)乳酸菌的基因進(jìn)行修飾使其表達(dá)，以此來(lái)獲得耐高溫菌株。 實(shí)驗(yàn)二 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵及活菌數(shù)測(cè)定（5學(xué)時(shí)） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模? 1、學(xué)習(xí)了解固態(tài)發(fā)酵原理； 2、以枯草芽孢桿菌為對(duì)象，了解固態(tài)發(fā)酵的控制技術(shù)； 3、掌握枯草芽孢桿菌活菌計(jì)數(shù)方法與操作。 實(shí)驗(yàn)原理： 作為抗生素的替代品，益生菌和酶制劑等的研究與開(kāi)發(fā)近幾年成為綠色飼料添加劑的熱點(diǎn)，其中益生菌倍受關(guān)注。作為益生菌的一種，芽孢桿菌制劑在動(dòng)物生產(chǎn)中的研究和應(yīng)用一直都是畜牧業(yè)科研和生產(chǎn)人員關(guān)注的焦點(diǎn)。目前芽孢桿菌多采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，再經(jīng)噴霧干燥進(jìn)行生產(chǎn)，對(duì)設(shè)備要求高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜；而固體發(fā)酵采用的原料一般是廉價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品(如草粉、麩皮等)，采用的設(shè)備也較液體發(fā)酵簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本大大低于液體發(fā)酵。所以近年來(lái)各生產(chǎn)廠家都在積極探索芽孢桿菌的固體發(fā)酵技術(shù)，以求簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。 固態(tài)發(fā)酵定義：指沒(méi)有或幾乎沒(méi)有自由水存在下，在有一定濕度的水不溶性固態(tài)基質(zhì)中，培養(yǎng)一種或多種微生物的生物反應(yīng)過(guò)程，是以氣相為連續(xù)相的生物反應(yīng)過(guò)程。 枯草芽孢桿菌屬于好氧微生物，實(shí)驗(yàn)室條件下利用稀釋涂布培養(yǎng)的方法，讓菌在有氧條件下生長(zhǎng)，每個(gè)單菌落代表一個(gè)微生物細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1、液體種子培養(yǎng)基配制： 葡萄糖0.2%，NaCl 0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，pH 7.0。 2、液體種子培養(yǎng)： 每300 mL三角瓶裝量50 mL液體種子培養(yǎng)基，在115℃條件下滅菌30 min。降溫后從斜面接一環(huán)菌苔至種子培養(yǎng)基。置37℃控溫?fù)u床培養(yǎng)。轉(zhuǎn)速200 rmin-1，至芽孢率達(dá)90%以上時(shí)停止，約需24 h。 3、固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮60%，稻草粉10%，玉米粉5%，豆粕25%，硫酸鎂0.05%，硫酸銨0.5%，料水比為1:1.1。 4、三角瓶固體發(fā)酵培養(yǎng)： 每250 mL三角瓶裝量20-30 g（濕重），固體發(fā)酵培養(yǎng)基原料試劑混合料，加水，料水比為1:1.1，攪拌均勻，培養(yǎng)基經(jīng)121℃滅菌30 min，降溫后接種量為2%(V/M：V—液體菌種體積數(shù)，M—固體發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量)，然后置37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，間時(shí)拍打，使其均勻生長(zhǎng)。至脫落芽孢率為80%以上時(shí)，停止發(fā)酵，約需48 h。 （二）枯草芽孢菌活菌檢測(cè) ①、檢測(cè)培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%，NaCl 0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，瓊脂粉2%，pH 7.0。115℃滅菌20min，滅菌后放置水浴52℃保溫備用。 ②、稀釋：取10克樣品放入添加90ml無(wú)菌水的帶玻璃珠的250ml三角瓶中，搖床180rpm震蕩30min，即為10－1樣品溶液；再?gòu)闹腥?ml至添加9.0ml無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，稀釋至10－2，……以此類推稀釋至10－8，即稀釋了1億倍; ③、倒培養(yǎng)平板，將已經(jīng)滅了菌的保持在52℃水浴鍋中的呈溶解狀態(tài)的培養(yǎng)基，倒入15毫升左右于培養(yǎng)皿中，全部浸到培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基凝固；從上述已稀釋了1億倍的菌懸液中取0.2ml于已凝固的培養(yǎng)基表面，用玻璃刮鏟涂布均勻，靜止10min，然后再移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 ④、培養(yǎng)條件：37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h； ⑤、培養(yǎng)完畢后，取出進(jìn)行計(jì)數(shù)。 （三）芽孢率測(cè)定:采用芽孢革蘭氏染色后顯微鏡下觀察 實(shí)驗(yàn)器材及試劑： 菌種：枯草芽孢桿菌 試劑：培養(yǎng)基成分 器材：培養(yǎng)箱、滅菌鍋，培養(yǎng)皿 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、 詳細(xì)描述枯草芽孢桿菌固態(tài)培養(yǎng)物（外觀、氣味、培養(yǎng)物狀態(tài)等）： 答：枯草芽孢桿菌淡黃色，中間色深，表面較平整，無(wú)光澤，邊緣不整齊，形成的菌落為圓形。培養(yǎng)基中的枯草芽孢桿菌有腥臭味，長(zhǎng)勢(shì)良好，觀察培養(yǎng)基，無(wú)明顯染菌現(xiàn)象。 2、 記錄活菌測(cè)定中各平行數(shù)據(jù)，計(jì)算最終平均值。 答： 數(shù)量 稀釋倍數(shù) 密度（/g） 第一個(gè)平板 112 5107 5.6109 第二個(gè)平板 65 5107 3.25109 第三個(gè)平板 22 5107 1.1109 平均值 3.32109 3、同時(shí)用圖片記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各現(xiàn)象與結(jié)果，并對(duì)圖進(jìn)行注釋。 菌落成白色，菌落表面有褶皺 思考題： 在枯草芽孢桿菌固態(tài)生產(chǎn)過(guò)程中，為了防止霉菌與酵母的污染，可如何進(jìn)行操作？ 答：加入抗真菌抑制劑 實(shí)驗(yàn)三、 淀粉糖化與酒精發(fā)酵（5學(xué)時(shí)） 實(shí)驗(yàn)類型：綜合性實(shí)驗(yàn)?zāi)康模? 1．了解酒精發(fā)酵的主要類型、工藝原理及其控制條件 2．熟悉酒精生產(chǎn)的工藝流程、掌握酒精發(fā)酵的操作方法 3. 掌握用酶法從淀粉原料到水解糖的制備原理及方法 4. 掌握在實(shí)驗(yàn)室中模擬酒精發(fā)酵的工藝流程 實(shí)驗(yàn)原理 玉米粉、大米粉中可供發(fā)酵的物質(zhì)主要是淀粉，而釀酒酵母由于缺乏相應(yīng)的酶，所以不能直接利用淀粉進(jìn)行酒精發(fā)酵，因此必須對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理，包括蒸煮（液化）、糖化等，蒸煮可使淀粉糊化，并破壞細(xì)胞，形成均一的醪液，能更好的接受糖化酶的作用，并轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，以便酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵。在無(wú)氧條件下酵母菌利用可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳的作用，稱為酒精發(fā)酵，是生產(chǎn)酒精及各種酒類的基礎(chǔ)，可通過(guò)測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生CO2的量和最終產(chǎn)物酒精的量得知酵母的發(fā)酵能力。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1、原料的粉碎 將玉米、大米用粉碎機(jī)粉碎，玉米淀粉含量為70%，大米淀粉含量為75%。 2、蒸煮糊化 稱取一定量的粉碎后淀粉質(zhì)原料，按一定的料水比（100g：200ml），調(diào)制淀粉乳，90-100℃條件下恒溫水浴加熱，淀粉乳受熱后，在一定溫度范圍，淀粉粒開(kāi)始破壞，晶體結(jié)構(gòu)消失，體積膨大，粘度急劇上升，呈粘稠的糊狀，即成為非結(jié)晶性的淀粉。 3、糖化 經(jīng)蒸煮糊化后的醪液，經(jīng)過(guò)淀粉酶的糖化作用，將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，供酵母利用。 酶參考用量：淀粉乳33%，60℃，ph4.5，酶240U/g絕干淀粉，糖化時(shí)間16h。 糊化醪液調(diào)整pH4.5，往其中加入一定量的淀粉酶（120U/g）、糖化酶（120U/g），60℃恒溫下不斷攪拌，直至粘度下降到一定程度，淀粉完全糖化 4、發(fā)酵 （1）干酵母活化 將干酵母按1:20的比例投放于37℃的溫水中復(fù)水20min。目的：恢復(fù)酵母細(xì)胞的正常功能。 （2）淀粉醪液糖化后，取400ml上清液于潔凈的大可樂(lè)瓶中，加相同體積的水稀釋，加入活化好的酵母種液5ml，混勻，28度培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)36h左右。 5、二氧化碳生成的檢驗(yàn) （1）觀察三角瓶中的發(fā)酵液有無(wú)氣泡溢出； （2）滴入10%氫氧化鈉1ml于發(fā)酵液試管中，觀察，如氣體逐漸消失，則說(shuō)明有二氧化碳的存在； 6、二氧化碳生產(chǎn)量的測(cè)定 （1）接種完，擦干瓶外壁，于天平上稱量，記為W1; （2）實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取出瓶輕輕搖動(dòng)，使二氧化碳盡量溢出，在同一天平上稱量，記為W2； （3）二氧化碳生成量= W1-W2 7、酒精生成的檢驗(yàn) （1）打開(kāi)瓶塞，嗅聞?dòng)袩o(wú)酒精氣味； （2）取發(fā)酵液5ml，加10%硫酸2ml； （3）再加入1% K2Cr2O7溶液10-20滴，如顏色由黃色變?yōu)辄S綠色說(shuō)明有酒精產(chǎn)生。 K2Cr2O7+H2SO4+CH3CH2OH——CH3COOH+K2SO4+Cr2（SO4）3 實(shí)驗(yàn)器材及試劑： 菌種：活性干酵母 試劑：培養(yǎng)基各成分、大米粉、活性干酵母、淀粉酶、糖化酶、大可樂(lè)瓶 溶液：10% H2SO4、1%K2Cr2O7、10%NaOH 器材：試管、培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、水浴鍋、粉碎機(jī)、離心機(jī) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、 詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各參數(shù)及數(shù)據(jù)。 淀粉 淀粉酶 CaCl2 糖化酶 100g 10g 0.17g 2.5g 2.對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷與分析。 答: 1二氧化碳生成的檢驗(yàn)培養(yǎng)約48h后，觀察瓶中混合液，淀粉大部分沉降在瓶底，上清濃度較稀，靠瓶壁邊緣有一連串微小氣泡 2酒精生成的檢驗(yàn)打開(kāi)瓶塞，聞到有濃重酒精氣味。取發(fā)酵液5ml, 加10%硫酸2ml,加1%K2Cr2O7溶液10-20滴，顏色由黃色變?yōu)辄S綠色，稍加熱后現(xiàn)象產(chǎn)生更快，更明顯。 思考題：現(xiàn)有3株不同來(lái)源的酒精酵母，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)與本實(shí)驗(yàn)操作不同的實(shí)驗(yàn)，判斷哪株酵母發(fā)酵酒精能力最強(qiáng)？ 答：按實(shí)驗(yàn)步驟配制等量的三組醪液，加入等量糖化酶進(jìn)行糖化作用，將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，向三組糖化后的淀粉上清中加入等量3株不同來(lái)源的酒精酵母種液，相同條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，分別測(cè)定三組實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的CO2的質(zhì)量，進(jìn)行比較。產(chǎn)CO2越多表示發(fā)酵酒精能力越強(qiáng)。 實(shí)驗(yàn)四 黑曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶及酶解底物反應(yīng)（5學(xué)時(shí)） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模? 1、了解黑曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)酶情況 2、掌握微生物固體發(fā)酵操作技術(shù) 3、了解纖維素酶提取方法及酶活性定性測(cè)定方法 實(shí)驗(yàn)原理：纖維素酶是降解纖維素的一組酶的總稱，是起協(xié)同作用的多組分酶系，屬于誘導(dǎo)酶，其產(chǎn)生需要纖維素類物質(zhì)的誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)中以米曲霉為發(fā)酵菌株，稻草作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1、黑曲霉菌種活化 （1）配制PDA培養(yǎng)基：稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過(guò)濾，再加20g葡萄糖和20g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過(guò)濾，分裝試管，每試管約5-10ml（視試管大小而定），15磅蒸氣（121℃）滅菌20分鐘左右后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩? （2）在無(wú)菌超凈臺(tái)上接種保藏的黑曲霉于PDA斜面，28℃培養(yǎng)5-7天，斜面上長(zhǎng)滿孢子。 2、配制發(fā)酵培養(yǎng)基：15g麩皮+10g稻草粉，0.5%KH2PO4，0.5% (NH4)2SO4，加15ml水（加水量40%～60%），拌勻，裝瓶； 3、滅菌：121℃ 滅菌30min，冷卻至室溫。 4、黑曲霉孢子懸浮液制備 已培養(yǎng)好的黑曲霉孢子斜面一支，加入約10ml無(wú)菌水，洗下孢子，制成孢子懸液。 5、接種：用移液管在無(wú)菌條件下吸取一定量的懸液，移入滅菌好的固體培養(yǎng)基中，于30度條件下培養(yǎng)96h，期間每隔12h搖動(dòng)三角瓶一次。 6、提取粗酶液 向瓶中加入無(wú)菌水約50ml，浸泡固體曲30min-1h；過(guò)濾得粗酶液。 7、酶活性測(cè)定 （1）配制1%CMC底物平板： 配方：1g羧甲基纖維素鈉，1.8g瓊脂， 100ml，瓊脂完全溶解后，加入0.03g曲利本藍(lán)，倒平板，每皿約15ml。 （2）打孔：打孔器經(jīng)酒精燃燒滅菌后，每平板打4孔，并在酒精燈火焰上稍稍加熱打孔處，使孔周圍的培養(yǎng)基微融，然后平放冷卻。 （3）加樣：往孔內(nèi)加入粗酶液適量（約100ul），同時(shí)需設(shè)對(duì)照。 （4）培養(yǎng)（反應(yīng)）：將加樣后的平板小心平端放入30℃培養(yǎng)箱，放置20小時(shí)左右。 （5）觀察結(jié)果：可直接觀察透明圈有無(wú)、測(cè)定透明圈直徑。 實(shí)驗(yàn)器材及試劑： 菌種：黑曲霉 試劑：土豆、稻草、麩皮、硫酸銨、羧甲基纖維素鈉（CMC） 器材：培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、搖床、離心機(jī)、天平、三角瓶 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、 仔細(xì)觀察固體培養(yǎng)基發(fā)酵前后的狀態(tài)，并描述； 答：固體培養(yǎng)基發(fā)酵前：培養(yǎng)基顏色較淺，各成分（麩皮、稻草）新鮮，粘度大成團(tuán)狀 固體培養(yǎng)基發(fā)酵后：培養(yǎng)基中產(chǎn)生較多黑色孢子及菌體，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分被利用，體積縮小 2、 仔細(xì)觀察底物平板酶解前后的現(xiàn)象，并測(cè)量水解圈大小。 現(xiàn)象：紙片周圍出現(xiàn)淺淺的水解圈，打孔培養(yǎng)基未出現(xiàn)水解圈，紙片直徑2.5cm，水解圈3cm，直徑比5:6 思考題：纖維素是自然界最豐富的資源，從理論角度分析如何最大限度地通過(guò)酶法利用該資源？而現(xiàn)實(shí)存在什么問(wèn)題？目前對(duì)纖維素降解有哪些研究進(jìn)展？ 答：要想最大限度的利用纖維素，可從兩個(gè)方面入手。一是通過(guò)生產(chǎn)高性能纖維素酶的方法，二是找到蘊(yùn)含能量較高的纖維素。而現(xiàn)實(shí)中存在的問(wèn)題是高性能纖維素酶的獲取， 而可以通過(guò)誘變和篩選獲得可產(chǎn)生纖維素酶的新菌株。目前在纖維素的降解方面，微生物的研究較多，降解纖維素的真菌有很多，如木霉屬、青霉屬、曲霉屬、根霉屬、漆斑霉屬、枝頂孢霉屬、毛殼霉屬和脈孢霉屬等。其中，很多纖維素降解真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生菌絲，菌絲具有很強(qiáng)的穿透能力，能穿透植物角質(zhì)層的阻礙，緊緊依附和穿插在纖維物質(zhì)上，增大降解酶與纖維物質(zhì)的接觸面積，從而加快降解速率。如木霉屬、青霉屬、漆斑霉屬、毛殼霉屬和脈抱霉屬為絲狀真菌。目前，木霉屬是迄今所知纖維素酶系最全面和研究較多的一個(gè)屬。 實(shí)驗(yàn)五 甘露聚糖酶液體發(fā)酵及酶解反應(yīng)（6 學(xué)時(shí)） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模? 1. 了解并掌握液體發(fā)酵產(chǎn)酶操作及酶反應(yīng)條件的控制 2. 與固體發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)行比較分析 實(shí)驗(yàn)原理 甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，其主鏈?zhǔn)怯蛇拎事短菤埢?,4-β-D糖苷鍵連接而成。當(dāng)主鏈的某些殘基被葡萄糖取代，或半乳糖通過(guò)1,6-α-糖苷鍵與甘露糖殘基相連形成分枝，則稱之為異甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖。甘露聚糖是半纖維素的第二大組分，在自然界中分布廣泛，且多以異甘露聚糖的形式存在，同型甘露聚糖十分少見(jiàn)。β-甘露聚糖酶以內(nèi)切方式降解甘露聚糖主鏈產(chǎn)生不同聚合度的甘露寡糖和少量甘露糖，是甘露聚糖降解酶中最關(guān)鍵的酶。 甘露聚糖酶可廣泛應(yīng)用于食品、造紙、紡織印染等行業(yè)。利用β-甘露聚糖酶可以制取有特殊保健作用的甘露寡糖。在紙漿制造業(yè)，可用于代替堿法進(jìn)行脫色、漂白。在紡織印染方面，利用β-甘露聚糖酶與其它酶聯(lián)合作用，能有效去除產(chǎn)品上粘附的多余染料，降低能耗和對(duì)環(huán)境的污染等。甘露聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)將在許多行業(yè)產(chǎn)生很大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。因此，近年來(lái)甘露聚糖酶逐漸成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注和研究的熱點(diǎn)之一。甘露聚糖酶是一種半纖維素酶，其產(chǎn)生需要一定的誘導(dǎo)物存在。本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌為菌株，以魔芋粉為誘導(dǎo)物。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1. 菌種活化 （1）配制LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂 20g/L，待瓊脂充分溶解后趁熱紗布過(guò)濾，分裝試管，每試管約5-10ml（視試管大小而定），15磅蒸氣（121℃）滅菌20分鐘左右后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩? （2）在無(wú)菌超凈臺(tái)上接種保藏的枯草芽孢桿菌于LB斜面，28℃培養(yǎng)2天。 2. 配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，魔芋粉 30g/L， 3. 以10%的體積量分裝于三角瓶中（25ml液體培養(yǎng)基/250ml三角瓶），121℃滅菌20分鐘； 4. 菌懸液的制備 已培養(yǎng)好的枯草桿菌斜面一支，加入約10ml無(wú)菌水，洗下菌體，制成菌懸液。 5. 接種 用移液管在無(wú)菌條件下吸取一定量的懸液，移入滅菌好的固體培養(yǎng)基中，于37度200rpm條件下培養(yǎng)72h。 6. 粗酶液提?。?000rpm離心收集得到粗酶液 7. 酶解底物分析：準(zhǔn)備兩三角瓶，分別加入50ml自來(lái)水，46度水浴保溫 8. 往兩三角瓶中各加入1g魔芋粉，然后其中一個(gè)加入粗酶液1ml，另一個(gè)加入1ml蒸餾水（做空白對(duì)照）。以后每隔5-10min往兩三角瓶中各加入1g魔芋粉，前后共加5g 9. 酶解反應(yīng)30-60min，期間觀察反應(yīng)現(xiàn)象。 實(shí)驗(yàn)器材及試劑： 菌種：枯草芽孢桿菌 試劑：蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、魔芋粉 器材：培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、搖床、離心機(jī)、天平、三角瓶 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、 仔細(xì)觀察液體培養(yǎng)基發(fā)酵前后的狀態(tài)，并描述； 答： ①發(fā)酵之前的液體培養(yǎng)基的狀態(tài)：在配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基時(shí)，魔芋粉難溶解，依舊是固體顆粒。等完全滅完菌后，放正在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，等冷卻后，狀態(tài)比較像固體培養(yǎng)基，但魔芋粉依舊不溶解，其顆粒均勻地分布于培養(yǎng)基中。 ②經(jīng)過(guò)三天的培養(yǎng)之后，產(chǎn)酶培養(yǎng)基被液化，得到的是含有粗酶液的液體培養(yǎng)基，完全呈黃褐色的液體狀 2、 仔細(xì)觀察底物水解前后的現(xiàn)象。 答：對(duì)照組：魔芋粉結(jié)成團(tuán)，透明，具有彈性，黏度很大，無(wú)法攪拌，實(shí)驗(yàn)難以繼續(xù)。 實(shí)驗(yàn)組：魔芋粉已被完全酶解，三角瓶中完全是液體狀的酶解產(chǎn)物，溶液呈透明狀。 思考題： 以本人液體發(fā)酵產(chǎn)酶為例，請(qǐng)?jiān)敿?xì)介紹甘露聚糖酶定量測(cè)定的原理與方法。 答：原理：樣品中的甘露聚糖酶對(duì)底物－半乳甘露聚糖進(jìn)行水解，用DNS試劑（3,5-二硝基水楊酸）分光光度法測(cè)定水解所產(chǎn)生的還原糖量。 方法：別向2支試管中加入1.8mL底物溶液，置50℃水浴中保溫5min。在其中一支試管中加入200μL稀釋酶樣，磁力旋轉(zhuǎn)攪拌均勻，置于50℃水浴中準(zhǔn)確保溫5 min。加入3.0 mL DNS試劑至兩支試管中，攪拌均勻。在另一支試管（空白管）中加入200μL稀釋酶樣，同時(shí)將兩支試管放入沸水浴中準(zhǔn)確保溫5min，取出置入冷水中冷卻至室溫。于540 nm處測(cè)量酶樣對(duì)空白的吸光度，在酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取酶活，再乘以酶樣稀釋倍數(shù)。 實(shí)驗(yàn)六 從土壤中分離篩選產(chǎn)抗生素放線菌及抗菌譜分析 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模? 1、從土壤中分離產(chǎn)抗生素的放線菌。 2、抗生素產(chǎn)生菌的抗菌譜測(cè)定。 3、掌握微生物的基本操作。 實(shí)驗(yàn)原理： 放線菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中，其數(shù)量?jī)H次于細(xì)菌，一般在中性偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物群體中分離出來(lái)，從而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據(jù)放線菌的營(yíng)養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng)基或有機(jī)氮培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基成分改變，或土壤預(yù)先處理（120℃熱處理1h），或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴10%酚等），都可以使細(xì)菌（本實(shí)驗(yàn)加入重鉻酸鉀150㎎／L），霉菌出現(xiàn)的數(shù)量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過(guò)稀釋法，使放線菌在固體培養(yǎng)基上形成單獨(dú)菌落，并可得到純菌株。放線菌可以產(chǎn)生抗生素，抑制其他菌種的生長(zhǎng)，挑取純菌落進(jìn)行抗菌譜分析，指示菌為大腸桿菌（G-）和枯草芽孢桿菌（G+）。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1、高氏一號(hào)培養(yǎng)基的制備 可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g,氯化鈉0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.4。 配制時(shí)，先用冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補(bǔ)足水分至1000ml。112℃滅菌20分鐘（實(shí)驗(yàn)中所用無(wú)菌器具均在此時(shí)滅菌）。 2、土壤取樣及其懸液梯度稀釋 選定取樣點(diǎn)（最好是有機(jī)質(zhì)含量高的菜地），按對(duì)角交叉（五點(diǎn)法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取2～10cm處的土壤。盛土的容器應(yīng)是無(wú)菌的。將5點(diǎn)樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等，土樣取回后應(yīng)盡快投入實(shí)驗(yàn)。 3、稱土樣10g于盛有90mL無(wú)菌水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10～20min，使土樣中的菌體、芽孢或孢子均勻分散，此即為10-1濃度的菌懸液，靜置30s。另取裝有9ml無(wú)菌水的試管4支，編號(hào)10-2、10-3、10-4、10-5。用無(wú)菌吸管無(wú)菌操作取10-1濃度的土壤懸液1ml并加入編號(hào)10-2的無(wú)菌試管中，并吹吸吸管3~4次，使與9ml水混勻，即為10-2濃度的土壤稀釋液。依此類推，直到稀釋至10-5的試管中（每個(gè)稀釋度換1支無(wú)菌吸管）。稀釋過(guò)程需在無(wú)菌室或無(wú)菌操作條件下進(jìn)行。 4、稀釋倒平板法分離土壤中放線菌 取3支1毫升移液管分別從10-3、10-4、10-5菌懸液中吸取1毫升菌懸液，分別注入編號(hào)10-3、10-4、10-5的培養(yǎng)皿內(nèi)，每一梯度兩個(gè)平板。將溫度為45～50℃的高氏一號(hào)培養(yǎng)基倒入上述各培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使菌懸液充分混合均勻，凝固后，將培養(yǎng)皿倒扣放置在溫暖處（28℃左右）培養(yǎng)一周，每天觀察培養(yǎng)基表面有無(wú)微生物菌落。 將平皿上的放線菌菌落挑取在淀粉瓊脂平皿上四區(qū)劃線進(jìn)行分離純化，28℃恒溫培養(yǎng)一周左右，觀察放線菌菌落特征。 5、抗菌譜測(cè)定：（1）配制LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂 20g/L。滅菌后倒平板。 （2）將搖床培養(yǎng)12h的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌分別涂布于固態(tài)LB培養(yǎng)基，靜置10min。 （3）挖取一個(gè)放線菌菌落（含培養(yǎng)基），倒置于平板分區(qū)的中央，培養(yǎng)一天后，觀察并測(cè)量抑菌圈大小。 實(shí)驗(yàn)器材及試劑： 菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌 試劑：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂、可溶性淀粉、硝酸鉀、氯化鈉、K2HPO4 ?3H2O 、MgSO4?7H2O 、FeSO4?7H2O 、酒精、土壤 器材：培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、搖床、天平、三角瓶、試管、棉塞、涂布棒、接種環(huán) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1 描述分離到的放線菌培養(yǎng)特征； 放線菌表面光滑，顏色各異，黃，黑，褐，白，橙色，菌落較小。 2 觀察并測(cè)量對(duì)指示菌的抑菌圈大小。 枯草芽胞桿菌沒(méi)有抑菌圈，大腸桿菌基本都有抑菌圈，菌圈直徑0.8cm，抑菌圈直徑小的0.93cm，大的1.3cm。 思考題： 以某一抗生素為例，描述其工業(yè)生產(chǎn)操作。 1.制備孢子 2.斜面接種 3.接種到大米上，產(chǎn)生米孢子 4.將米孢子接種到一級(jí)種子罐 5.接種到二級(jí)種子罐 6.接種到發(fā)酵罐 7.預(yù)處理罐 8.過(guò)濾器 9.萃取器 10.蒸發(fā)器 11.結(jié)晶器 12.工業(yè)鹽 13