人肝癌細胞感染藍舌病毒HbC3株超微結(jié)構(gòu)的動態(tài)觀察

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1、人肝癌細胞感染藍舌病毒HbC3株超微結(jié)構(gòu)的動態(tài)觀察 　　 目的 探討藍舌病毒靶向抗腫瘤的細胞生物學(xué)機制。方法 利用透射電鏡觀察藍舌病毒HbC3株感染人肝癌細胞Hep3B的形態(tài)發(fā)生學(xué)以及該病毒引起的細胞的病理改變。結(jié)果 BTVHbC3以受體介導(dǎo)的胞飲作用穿入細胞，溶酶體水解病毒外衣殼，使之成為亞病毒粒子，胞漿內(nèi)有病毒包涵體及未裝配成熟的亞病毒顆粒。隨后亞病毒顆粒裝配上外層蛋白結(jié)構(gòu)，形成成熟的病毒粒子。病毒感染細胞12～18h時，細胞以擠出的方式釋放病毒并達到高峰。18～48h時，病毒進入超感染期, 大量細胞發(fā)生病變, 出現(xiàn)細胞凋亡和溶解。結(jié)論 一旦藍舌病毒感染Hep3

2、B腫瘤細胞即可在細胞內(nèi)增殖并誘導(dǎo)該腫瘤細胞進入凋亡，死亡的腫瘤細胞釋放出的病毒粒子并再次感染其他腫瘤細胞，直至將全部腫瘤細胞殺滅，其溶瘤方式為鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 藍舌病毒HbC3（BTVHbC3） 人肝癌細胞（Hep3B） 形態(tài)發(fā)生學(xué) 溶癌病毒 　　0引言　　癌的治療問題至今尚未得到有效解決的重要原因之一是現(xiàn)有治療手段缺乏靶向性。我們在長期的病毒與癌的研究過程中發(fā)現(xiàn)：不感染人正常細胞的藍舌病毒HbC3株(BluetongueVirusHbC3 strain,BTVHbC3)卻能有效地殺死某些人和動物腫瘤[1,2]。BTVHbC3種生物學(xué)特性展示了其發(fā)展為靶向人癌病毒的潛能。本文以人

3、類原發(fā)性肝癌細胞感染BTVHbC3為模型系統(tǒng)，進一步報導(dǎo)其相互作用后的超微結(jié)構(gòu)變化，以初步探討B(tài)TVHbC3靶向抗癌的細胞生物學(xué)機制。 　　1材料與方法 　　1.1病毒與細胞　　BTV HbC3株為本研究室于1994年湖北省分離的病毒株，人肝癌細胞Hep3B購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。Vero細胞為本室保存的BTVHbC3敏感增殖細胞株。Vero 細胞用于BTVHbC3的培養(yǎng)增殖和病毒效價測定；Hep3B細胞用于實驗研究。 　　1.2細胞培養(yǎng)、傳代　　Hep3B細胞采用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5％ CO2條件下培養(yǎng)，常規(guī)法培養(yǎng)傳代Hep

4、3B細胞分別于25ml 10個培養(yǎng)瓶里。 　　1.3BTV HbC3病毒增殖及病毒懸液制備　　采用添加10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細胞，待細胞生長至80％～90％時，接種BTV HbC3懸液1ml于培養(yǎng)瓶，置37℃吸附1h后，棄培養(yǎng)液，以2％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。觀察細胞病變效應(yīng)（CPE）達到90％時收獲細胞，反復(fù)凍溶3次，使細胞完全脫離；破碎、釋出病毒；4 000r/min離心15min，收集上清。按本研究室常規(guī)方法[1]進行病毒TCID50滴定，病毒效價為105 TCID50/ml。然后按每試管1ml病毒懸液分裝于10個試管，－80℃凍存?zhèn)溆谩? 　

5、　1.4BTV HbC3感染Hep3B細胞的樣品制備　　按每25ml培養(yǎng)瓶接種0.1ml病毒懸液（104TCID50）于10瓶Hep3B細胞，吸附細胞lh后，棄病毒液，洗細胞2次，然后加入含2％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。根據(jù)病毒感染細胞病變的特性，分別在不同10個時間段：2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、32h、40h、48h收獲細胞。所有收獲細胞用PBS洗2遍，EDTA消化，1 500r/min離心10min，棄上清，加2.5％戊二醛室溫固定lh后，送電鏡室制片。 　　1.5電鏡超薄切片的制備及電鏡觀察　　將所固定樣品，用0.1mol／L二甲砷酸鈉緩沖液(p

6、H7.4)在4℃下漂洗細胞2次，1％四氧化鋨固定1h，梯度酒精脫水，Epon812包埋，LKB—V型超薄切片機切片，常規(guī)醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色。日立H－600透射電鏡觀察。 　　2結(jié)果　　　　2.1BTVHbC3感染Hep3B細胞超微結(jié)構(gòu)的動態(tài)觀察　　BTVHbC3感染細胞2～4h時段， BTV吸附在細胞膜表面， 細胞膜逐漸包裹、 內(nèi)陷， 以胞飲囊泡吞入方式進入細胞漿,隨之在溶酶體的酸性環(huán)境下脫去外衣殼， 將含病毒內(nèi)衣殼和基因組的亞病毒核殼釋放到細胞基質(zhì)中（見圖1）。 6～8h時， 胞漿內(nèi)可見脫去部分外層衣殼的不完整病毒顆粒， 即亞病毒顆粒和病毒包涵體的形成（見圖2）。 8～12

7、h時， 病毒晚期蛋白合成， 主要是裝配病毒顆粒的蛋白質(zhì)、 酶和非結(jié)構(gòu)蛋白。 胞漿內(nèi)大量亞病毒顆粒裝配上外層蛋白結(jié)構(gòu)， 逐漸形成成熟的病毒粒子。 12～18h時， 病毒包含體裂解和子代病毒的釋放達到高峰。 病毒釋放通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以出芽方式形成小泡， 轉(zhuǎn)運高爾基復(fù)合體送出細胞外。 18～32h時， 胞漿內(nèi)可見大量病毒增殖并伴隨病毒包涵體裂解， 釋放出感染性的子代病毒顆粒及病毒核物質(zhì)。 釋放的子代病毒感染新的宿主細胞， 新一輪復(fù)制周期開始， 病毒進入超感染期。 32～48h時， 大量細胞病變和凋亡、 胞質(zhì)內(nèi)均富含不同發(fā)育階段的病毒顆粒， 完整病毒顆粒、 病毒空衣殼和核物質(zhì)， 細胞溶解和病毒徹底釋放（見圖3、4）。 凋亡細胞核膜結(jié)構(gòu)完整， 核內(nèi)染色質(zhì)濃縮、 成塊、 邊聚， 細胞漿中有增殖的病毒顆粒， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴展并形成空泡， 線粒體腫脹， 為典型凋亡特征。