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1、第2節(jié) 蛋白質(zhì)的提取和分離,1.簡述蛋白質(zhì)提取的基本過程和方法。 2.記住電泳法等分離蛋白質(zhì)的基本原理。,一,二,一、同工酶以及乳酸脫氫酶 1.同工酶 指催化相同的化學反應,而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫學性質(zhì)不同的一組酶。 2.乳酸脫氫酶 (1)種類:一般含有5種同工酶。 (2)特點:相對分子質(zhì)量相同,但所帶電荷不同,電泳結(jié)果應該形成5個條帶。,,,,,,一,二,二、乳酸脫氫酶同工酶的提取和分離 1.提取原理 乳酸脫氫酶同工酶可以與特定的底物進行反應,形成特殊的藍紫色產(chǎn)物。同工酶檢測必須依靠其具有催化活性的特點,從而使其和其他的可溶性蛋白質(zhì)區(qū)分開來。因此在提取此類蛋白質(zhì)時必須提供必要的
2、緩沖系統(tǒng)和低溫環(huán)境以保持其生物活性。,,,,,一,二,2.分離原理 蛋白質(zhì)在立體網(wǎng)狀的瓊脂糖凝膠中電泳時,其遷移率主要取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。因此,乳酸脫氫酶同工酶可以通過電泳分開。 思考： 可否利用蛋白質(zhì)的提取與分離技術(shù)快速診斷早期癌變? 提示:可以。只需從早期患者的尿液、血液或細胞裂解液中提取少量蛋白質(zhì)樣品,采用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù),就可以更加快速、簡便、準確地對細胞癌變作出診斷。 3.實驗步驟 (1)提取過程:制備勻漿→獲取酶。 (2)分離過程:制瓊脂糖凝膠電泳板→加樣、電泳→染色、觀察。,,,,,1.蛋白質(zhì)分離提純技術(shù) 將生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)提取出來并加以分離,就可以得
3、到高純度的,甚至是單一種類的蛋白質(zhì)。 目前常用的蛋白質(zhì)分離提純技術(shù)包括離心技術(shù)、層析技術(shù)和電泳技術(shù)等。其中,電泳技術(shù)最為快捷靈敏、簡便易行。 蛋白質(zhì)含有游離的氨基和羧基,是兩性電解質(zhì),在一定pH條件下帶有電荷。作為帶電粒子,蛋白質(zhì)在電場中可以向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動,這就是電泳現(xiàn)象。蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)越多,移動得越快;電荷數(shù)相同時,相對分子質(zhì)量越小,則移動越快。這就是利用電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)的原理。,2.聚丙烯酰胺凝膠電泳 電泳需要支持物,常用的是聚丙烯酰胺凝膠,由此而來的技術(shù)稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳,簡稱PAGE。 不同蛋白質(zhì)的混合溶液,在經(jīng)過同一個電場電泳后,會在凝膠上形成不同的帶
4、紋。每一種帶紋可能就是一種蛋白質(zhì)。如果要對每一個帶紋做進一步的研究,只需將這些帶紋一個一個地剪下來,分別予以洗脫,然后對洗脫液中的蛋白質(zhì)做進一步的分離。如果待測洗脫液不能再分離,則這個帶紋中很可能只含有一種單純蛋白質(zhì)。如果待測洗脫液還能再分離,則這個帶紋中含有多種蛋白質(zhì),需要進一步分離,直至提純。,3.用凝膠色譜法分離血紅蛋白的過程 凝膠色譜法也稱分配色譜法,是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠實際上是一些由多糖類化合物構(gòu)成的微小多孔球體,在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道,相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過凝膠時速度不同。相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道,路程較長,移動速
5、度較慢;而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道,只能在凝膠外部移動,路程較短,移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。 凝膠色譜的操作:第一步要制作凝膠色譜柱。第二步要裝填凝膠色譜柱,因為干的凝膠和用緩沖液平衡好的凝膠的體積差別很大,所以裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時,不得有氣泡存在,因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序,降低分離效果。第三步是樣品的加入和洗脫。,特別提醒不是所有種類的蛋白質(zhì)的提取和分離都用同一種方法,蛋白質(zhì)的來源和性質(zhì)不同,分離方法差別很大。,4.緩沖溶液 在一定范圍內(nèi),能對抗少量外來強酸、強堿或具有稍加稀釋不引起溶
6、液pH明顯變化的作用叫做緩沖作用,具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一種或兩種化合物(緩沖劑)溶解于水中制得的,調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液。緩沖溶液的作用是維持反應體系的pH基本不變。在生物體內(nèi)進行的各種生物化學過程都是在精確的pH下進行的,受到氫離子濃度的嚴格調(diào)控。為了在實驗室條件下準確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境,就必須保持體外生物化學反應過程有與體內(nèi)過程相同的pH。,題型一,題型二,電泳技術(shù)的原理與操作 【例題1】 下列關(guān)于電泳的說法,不正確的是( ) A.電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程 B.帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動 C.蛋白質(zhì)在
7、聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少 D.用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子相對質(zhì)量的大小 解析:蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小和形狀等因素。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復合物,SDS 所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量,因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異,使電泳遷移率完全取決于分子相對質(zhì)量的大小。 答案:C,題型一,題型二,反思領(lǐng)悟電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)不同以及分子本身的大小、形狀不同,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,題型一,題型二,蛋白質(zhì)的提取
8、和分離 【例題2】 以下關(guān)于豬血紅蛋白提純的描述,不正確的是 ( ) A.洗滌紅細胞時,使用生理鹽水可防止紅細胞破裂 B.豬成熟紅細胞中缺少細胞器和細胞核,提純時雜蛋白較少 C.血紅蛋白的顏色可用于凝膠色譜法分離過程的監(jiān)測 D.在凝膠色譜法分離過程中,血紅蛋白比相對分子質(zhì)量較小的雜蛋白移動慢 解析:凝膠色譜法分離時,大分子物質(zhì)由于分子直徑較大,不易進入凝膠顆粒的微孔,而只能分布于凝膠顆粒之間,所以在洗脫時向下移動的速度較快,相反,相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)向下移動速度較慢。 答案:D,1,2,3,4,5,1.電泳過程中,什么樣的分子遷移速度最快?( ) A.纖維狀、大分子 B.纖維狀、小分子 C.
9、球狀、大分子 D.球狀、小分子 答案:D 解析:電泳就是利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同。一般來說,球狀分子比纖維狀分子移動快,小分子比大分子移動快。,1,2,3,4,5,2.下列說法不正確的是( ) A.在一定范圍內(nèi),緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對溶液pH的影響,維持pH基本不變 B.緩沖溶液通常由1~2種緩沖劑溶解于水中配制而成 C.透析袋能使小分子自由進出,而將大分子保留在袋內(nèi) D.乳酸脫氫酶一般含有4種同工酶 答案:D 解析:乳酸脫氫酶一般含有5種同工酶,其相對分子質(zhì)量相同,但所帶電荷不同。,1,2,3,4,5,3.蛋白質(zhì)的分離與純化技術(shù)是蛋白質(zhì)研
10、究的重要技術(shù)。下列有關(guān)敘述不正確的是( ) A.根據(jù)蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜的特性,可將樣品中各種不同的蛋白質(zhì)分離 B.根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小等,可通過電泳分離蛋白質(zhì) C.根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小,可通過凝膠色譜法分離蛋白質(zhì) D.根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同,可通過離心沉降法分離蛋白質(zhì) 答案:A 解析:蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜,據(jù)此可利用半透膜除去樣品中相對分子質(zhì)量小的雜質(zhì)。,1,2,3,4,5,4.使用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的實驗中,相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的行進過程,可表示為圖中( ) 答案:B 解析:本題考查對凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)原理的理解。相對分子質(zhì)量較
11、大的蛋白質(zhì)留在凝膠顆粒外面,相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)進入凝膠顆粒內(nèi)部;相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)通過凝膠間隙先被洗脫,相對分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)進入凝膠內(nèi)部而后被洗脫。,1,2,3,4,5,5.在利用凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)時,一定要加入緩沖溶液,其作用主要是( ) A.使酶的活力最高 B.使蛋白質(zhì)的活力最高 C.維持蛋白質(zhì)所帶的電荷 D.使蛋白質(zhì)帶上電荷 答案:C 解析:蛋白質(zhì)具有兩性,在一定pH下,蛋白質(zhì)分子的某些基團會帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下,這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。因此,加緩沖溶液的目的是維持蛋白質(zhì)所帶的電荷不發(fā)生改變。,
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