《蛋白質(zhì)芯片技術(shù)》PPT課件.ppt

生命科學(xué)領(lǐng)域的新工具SELDI蛋白質(zhì)芯片,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì) 臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,20世紀(jì)90年代，隨著全球基因組計(jì)劃的推進(jìn)，人類對(duì)生命科學(xué)的認(rèn)識(shí)達(dá)到了新的未有的深度和高度。人類基因組工作草圖公布后，標(biāo)志著基因框架已經(jīng)繪就，人類染色體總DNA有32億堿基對(duì)，包含有3萬個(gè)左右基因，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于原有約10萬個(gè)基因的估計(jì)。但是，由于真核生物中基因結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及現(xiàn)有基因識(shí)別技術(shù)發(fā)展的嚴(yán)重不足，所以適用范圍僅限于原核生物或低等真核生物，此情況進(jìn)一步表明人類對(duì)自身基因組的所有基因及其間隔序列還沒有完全確定。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,一、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的興起及蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的問世,加之mRNA自身在貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解、翻譯調(diào)空以及產(chǎn)物的翻譯后加工，難以準(zhǔn)確地反映基因功能的真正執(zhí)行體的質(zhì)與量。而功能性蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行體，能直接反應(yīng)基因給予的信息，后基因時(shí)代便接踵而來。以蛋白質(zhì)作為研究對(duì)象，對(duì)正常細(xì)胞及變異細(xì)胞功能進(jìn)行分析，從而可以尋找疾病的特異性標(biāo)志物；也可以利用尋找終末點(diǎn)的方法來對(duì)化學(xué)制劑和藥物毒副作用進(jìn)行評(píng)估。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,一、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的興起及蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的問世,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,Enabling Proteomics,美國Ciphergen生物公司生產(chǎn)的SELDI-TOF MS（surface enhanced laser desorprion/ionization-time of flight mass）主要包括三個(gè)基本部分： 特殊材料制成的固相載體，即蛋白芯片陣列，組成芯池的特殊材料是根據(jù)要捕獲蛋白質(zhì)的屬性而設(shè)計(jì)的，概括起來可歸納為兩大類型：a.化學(xué)型材料；b.生物化學(xué)型材料。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,二、SELDI蛋白質(zhì)芯片儀的組成及工作原理,蛋白質(zhì)芯片解讀儀（proteinchip reader）， 蛋白質(zhì)芯片解讀儀是安裝有脈沖式紫外線/氮激光光源的解析離子化（laser desorption ionization，LDI）時(shí)間-飛行質(zhì)譜儀（TOF MS）?；|(zhì)分子吸收激光能量，樣品解吸附，基質(zhì)樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離，經(jīng)解析/離子化過程而形成氣化離子狀態(tài)，它們進(jìn)入TOF-MS區(qū)域飛行。根據(jù)蛋白質(zhì)通過離子室的飛行速度，得出每個(gè)蛋白質(zhì)的質(zhì)量/電荷比（m/z），其公式為：E1/2mv2ZV；M/ZK*t2（其中Z為電荷數(shù)，V為 電壓，v為飛行速度，K為一常數(shù)）。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,用蛋白質(zhì)芯片儀測(cè)定 Detection Using the ProteinChip System,用激光解吸電離發(fā)法將保留在芯片上的蛋白質(zhì)洗脫下來 Retained proteins are “eluted” from the ProteinChip Array by Laser Desorption and Ionization 電離的蛋白質(zhì)可以通過飛行時(shí)間質(zhì)譜儀精確地測(cè)定它們的質(zhì)量 Ionized proteins are detected and their mass accurately determined by Time-of-Flight Mass Spectrometry,蛋白質(zhì)芯片軟件控制分析系統(tǒng)（Software） SELDI TOF-MS 控制分析軟件，由Ciphergen公司研發(fā)，軟件控制分析系統(tǒng)使整個(gè)操作過程變的自動(dòng)化、簡捷化、人性化。目前所用的軟件系統(tǒng)為proteinchip software 3.11版本，它主要包括：a.數(shù)據(jù)庫的建立；b.內(nèi)部信息及外部信息的校準(zhǔn)；c.數(shù)據(jù)處理與分析。二維凝膠電泳（2-DE）是經(jīng)典的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)樣品的要求以及對(duì)樣品的處理大大簡化SELDI蛋白質(zhì)芯片儀最適合分析多肽及蛋白質(zhì)混合物，它是現(xiàn)今靈敏度最高的質(zhì)譜儀，能夠?qū)O微量樣品進(jìn)行分析。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,Protein Discovery and Characterization ProteinChip Advantages 蛋白質(zhì)飛行質(zhì)譜的技術(shù)優(yōu)勢(shì),從未經(jīng)提純的生物或臨床樣品中直接捕獲, 檢測(cè)和分析蛋白質(zhì), 不需任何標(biāo)記或加尾. 超高的檢測(cè)靈敏度 (1-50 fmole的蛋白質(zhì)) 從超小樣品體積(0.5 l)到大體積(400 l)的靈活選用 小型實(shí)驗(yàn)或高通量篩選的自由選擇: 每次可準(zhǔn)備8, 16, 96, or 192 個(gè)樣品 快速獲取實(shí)驗(yàn)結(jié)果 超精確的蛋白質(zhì)分子量,在識(shí)別特定蛋白質(zhì)表達(dá)物，細(xì)胞株肽庫的建立，完成腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物的篩選和鑒定，從蛋白質(zhì)水平上對(duì)藥物毒性和安全性的評(píng)價(jià)等方面均證實(shí)蛋白質(zhì)芯片是一種高通量、高靈敏度、高特意性且微型化的蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和證實(shí) 疾病監(jiān)測(cè) (藥物療效的追蹤等) 毒理學(xué) 臨床診斷 藥物動(dòng)力學(xué),免疫方法設(shè)計(jì)與篩選 受體配體反應(yīng) 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 DNA-蛋白質(zhì)相互作用,純化策略的設(shè)計(jì)與純化過程的監(jiān)測(cè) 蛋白質(zhì)身份檢索 蛋白質(zhì)修飾分析 (磷酸化, 糖基化等) 抗原決定位點(diǎn)分析,蛋白質(zhì)指紋圖譜分析,蛋白質(zhì)的純化與分析,分子識(shí)別,ProteinChip Applications 蛋白質(zhì)飛行質(zhì)譜的應(yīng)用,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,由于新的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)能快速方便地找出痕量存在的蛋白質(zhì)，因此可廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。Diamord DL等將Epstein-Barr病毒基因?qū)隑細(xì)胞內(nèi)，利用SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測(cè)B細(xì)胞所分泌微量球蛋白的變化，精確篩選靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，達(dá)到預(yù)期試驗(yàn)?zāi)康?。SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)正如基因芯片、組織芯片等生物芯片為生物信息時(shí)代的發(fā)展注入了活力。,1.在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,Ad是神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性退變而形成的一種疾病，它是癡呆性疾病中最常見的一種。AD突出的特點(diǎn)表現(xiàn)在大腦組織中出現(xiàn)退化斑塊及神經(jīng)纖維聯(lián)系混亂。Huw Davies等人利用SELDI蛋白質(zhì)芯片儀對(duì)患者腦脊液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了-淀粉樣蛋白肽（Amyloid peptide，A），可導(dǎo)致人腦產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變；該研究小組還論證了A的差異性變體A1-42對(duì)大腦神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。,2.在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：老年癡呆癥（AD）,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,前列腺癌在西方國家發(fā)病率較高，美國前列腺癌的發(fā)病率占男性惡性腫瘤第一位。由于血清中PSA的低特異性，導(dǎo)致許多假陽性和假陰性的發(fā)生，說明PSA作為前列腺癌早期診斷及前列腺內(nèi)皮細(xì)胞惡變初期的檢測(cè)指標(biāo)不甚令人滿意，GL Wright Jr等人運(yùn)用SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)不但快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)到未被檢測(cè)出的前列腺癌患者的PSA，而且在前列腺癌患者的血清中發(fā)現(xiàn)三種具有免疫球蛋白捆綁因子活性的蛋白質(zhì)，對(duì)前列腺癌的早期診斷有重要意義。Adam運(yùn)用同樣的技術(shù)在前列腺癌患者的尿液中發(fā)現(xiàn)9個(gè)蛋白質(zhì)與正常人及前列腺增生患者尿液中的蛋白質(zhì)含量不同，其靈敏度可達(dá)83，特異性為97，陽性預(yù)測(cè)率值為96。,2.在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：前列腺癌,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,膀胱腫瘤在歐美一些國家的發(fā)病率僅次于前列腺癌，在我國是泌尿生殖系中最常見的腫瘤。Vlahou A等學(xué)者收集94份尿液樣本，其中包括膀胱移行細(xì)胞腫瘤患者（transitional cell carcinoma of the bladder，TCC），正常人和泌尿系其它良性疾病。TCC病人組中發(fā)現(xiàn)5個(gè)新的特異性蛋白標(biāo)志物和7個(gè)蛋白質(zhì)簇（分子量范圍在3.3133kd）。利用SEDLI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，檢測(cè)TCC蛋白標(biāo)志物的靈敏度為87，特異性達(dá)66。,2.在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：膀胱癌,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,乳腺癌是女性腫瘤死因的重要?dú)⑹种?。Paweletz CP等應(yīng)用SEDLI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)乳頭吸取液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢查，在對(duì)12個(gè)乳腺癌患者及15個(gè)健康對(duì)照者的檢查對(duì)比中，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者4,233kd和9,470kd分子量的蛋白質(zhì)含量明顯增高。Li J等將乳腺癌患者進(jìn)行臨床分期：0期4人，期38人，期37人，期24人，并設(shè)立對(duì)照組41人，其中25人為乳腺其它良性病變，其余為健康者。他們抽取患者血清利用IMAC3鎳螯合金屬芯片，發(fā)現(xiàn)0期和期患者血清中有3種蛋白質(zhì)含量明顯不同于無瘤者和期、期患者，為早期診斷乳腺癌提供了可靠依據(jù)。,2.在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：乳腺癌,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,目前尋找胰腺癌特異性腫瘤標(biāo)志物尤顯重要。Christophe Rosty等應(yīng)用SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)抽取的胰液樣本進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)胰腺腫瘤患者及其它胰腺疾病患者都存在一種特異性蛋白質(zhì)，分子量為16,570D，該蛋白質(zhì)在胰腺腫瘤患者中的檢出率為67（10/15），在其它胰腺疾病患者中的檢出率為14（1/7），經(jīng)證實(shí)該蛋白質(zhì)為肝-腸-胰相關(guān)蛋白（HIP/PAP-）。胰腺腫瘤患者組與對(duì)照組相比，HIP/PAP-在胰液中及血清中的水平都明顯增高（P0.001）。他們進(jìn)一步研究得出：胰液中HIP/PAP-水平升高尤為明顯，當(dāng)濃度20g/ml時(shí)，患胰腺癌的可能性較濃度20g/ml的高出21.9倍。,2.在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：胰腺癌,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,手術(shù)治療早期大腸癌的5年生存率可達(dá)99，效果良好，但由于各種原因的影響對(duì)高危人群的篩選及對(duì)大腸癌的早期診斷率只有37，所以對(duì)大腸癌的早期診斷尤顯重要。Roboz等分析大腸癌患者（34例）與正常對(duì)照組（14例）之間的血清蛋白圖譜的差異，其中大腸癌患者高表達(dá)8.9425.3kD蛋白質(zhì)，而9.3kD的蛋白質(zhì)呈低表達(dá)，正常對(duì)照組上述兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)情況與患者組正好相反。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明8.9kD和9.3kD蛋白質(zhì)可作為檢測(cè)大腸癌的腫瘤標(biāo)記物。,2.在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：大腸癌,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，在歐美地區(qū)的發(fā)病率及死亡率明顯高于亞非等國家。在我國，隨著人民生活水平的不斷提高，大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，這已引起人們的廣泛關(guān)注。目前臨床上缺乏早期診斷大腸癌的特異性標(biāo)記物，因此從血清中尋求特異性標(biāo)記物，用于大腸癌的早期診斷成為了急需解決的問題。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,我們應(yīng)用SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，利用IMAC3-Cu芯片對(duì)146例確診為大腸癌患者，62例正常人及32例大腸良性疾病患者的血清進(jìn)行蛋白質(zhì)對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)大腸癌患者血清中蛋白質(zhì)在4476 Da至15122Da間有十個(gè)蛋白質(zhì)含量有差異，靈敏度和特異性分別為97.26與95.92。同時(shí)用血清中CEA 做對(duì)照檢測(cè)，靈敏度不高，特異性僅為37。下一步的實(shí)驗(yàn)中，我們將對(duì)檢測(cè)出的特異性標(biāo)記物蛋白，進(jìn)行分離純化，將對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究，進(jìn)一步明確其結(jié)構(gòu)和大腸癌形成發(fā)展過程中的詳細(xì)功能。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,SEDLI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)問世以來，為研究蛋白質(zhì)的特征、屬性、功能提供了快速、準(zhǔn)確、高效的技術(shù)平臺(tái)。目前，SEDLI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、工業(yè)制藥、食品衛(wèi)生、生物工程等廣闊領(lǐng)域。這項(xiàng)技術(shù)結(jié)合對(duì)基因組知識(shí)的認(rèn)知，必將為疾病的早期診斷、療效監(jiān)測(cè)、生物及免疫治療提供了強(qiáng)有力武器，它將為人類的健康事業(yè)做出巨大貢獻(xiàn)。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對(duì)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,SEDLI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)應(yīng)在不斷實(shí)踐工作中進(jìn)行改進(jìn)，如：加大芯片攝取蛋白質(zhì)的數(shù)目和種類，盡可能多的捕獲蛋白質(zhì)信息；簡化操作過程，縮短試驗(yàn)成果向臨床實(shí)際應(yīng)用轉(zhuǎn)化的步驟和時(shí)間，切實(shí)做到快速準(zhǔn)確；加強(qiáng)計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)獲得信息的處理進(jìn)程，減少手工圖譜處理；降低工作成本，便于推廣。對(duì)蛋白質(zhì)的研究將成為新世紀(jì)最大戰(zhàn)略投入，蛋白質(zhì)組學(xué)必將成為后基因時(shí)代的“中流砥柱”。,