核酸擴增技術(shù) 課件

《核酸擴增技術(shù) 課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《核酸擴增技術(shù) 課件（93頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、核酸擴增技術(shù)主要內(nèi)主要內(nèi)容容第一節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)第二節(jié) 熒光定量PCR技術(shù)第三節(jié) 其他核酸擴增技術(shù)第四節(jié) 臨床基因擴增實驗室的管理與質(zhì)量控制第一節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù) polymerase chain reaction, PCR一、 PCR技術(shù)發(fā)展簡史二、 PCR技術(shù)原理三、 PCR反應(yīng)體系、條件及其優(yōu)化四、擴增產(chǎn)物檢測及分析五、 PCR常見問題與原因分析六、PCR衍生技術(shù)PCR技術(shù)發(fā)展簡史 Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設(shè)想。 1985年Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)，使用的DNA聚合酶是Klenow片段。(1993年諾貝爾化學(xué)獎獲得者年諾貝爾化學(xué)獎獲得者

2、) PCR技術(shù)發(fā)展簡史 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR。 1988年Saiki 發(fā)現(xiàn)Taq DNA聚合酶，從此PCR技術(shù)得以廣泛應(yīng)用?；驹?N= N0(1+E)cPCR反應(yīng)體系、條件及其優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系 模板（template） 引物（primers） DNA 聚合酶 (DNA polymerase) dNTP PCR緩沖液（PCR buffer） PCR反應(yīng)條件 變性 退火 延伸 循環(huán) DNA RNA：總RNA、mRNA、tRNA、 rRNA、 病毒RNA基因組DNA質(zhì)粒DNA引物（primers) 引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)

3、域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補。3355Sense primerAntisense primer引物的重要性 在整個PCR體系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對引物進行有效的延伸，可見引物設(shè)計好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。引物設(shè)計總原則 引物與模板的序列要緊密互補 引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu) 引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配)。 引物設(shè)計一般原則 引物長度 堿基分布的均衡性 Tm值 引物二級結(jié)構(gòu) 引物3端 引物

4、5端 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 引物的保守性與特異性 擴增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)引物長度 一般為15-30個核苷酸，常用的是18-24 bp。在做長片段在做長片段PCRPCR或做某些特殊的或做某些特殊的PCRPCR時應(yīng)使用較長的引物，但最多不超過時應(yīng)使用較長的引物，但最多不超過5050個個核苷酸。核苷酸。 引物過短會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于引物過短會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于16bp16bp是必是必要的（不容易引起錯配）。例如：一個長度為要的（不容易引起錯配）。例如：一個長度為12bp12bp的引物在的引物在人類基因組上存在人類基因組上存在200200個潛在的退火位點個潛在的退火位點(3 x

5、 10(3 x 109 9/4/41212=200 ).=200 ).而一個長度為而一個長度為20bp20bp的引物在人基因組上存在的退火位點只有的引物在人基因組上存在的退火位點只有1/4001/400個個. . 較長的引物（較長的引物（28-35bp)28-35bp)一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點堿基分布的均衡性 GC含量一般40-60%，推薦45-55%或50-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。 GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性 GC含量太高也易于引發(fā)

6、非特異擴增。 同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個引物Tm值 一般要求：55-65。 計算： 對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算 對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學(xué)參數(shù)，從“最近鄰位”的計算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計軟件最常用的計算方式。 Tm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15引物二級結(jié)構(gòu) 引物二聚體 盡可能避免兩個引物分子之間3端有有較多堿基互補 發(fā)夾結(jié)構(gòu) 尤其是要避免引物3端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。引物3端 引物的延伸從引物的延伸從3

7、3端開始，因此端開始，因此3 3端的幾個堿基與模板端的幾個堿基與模板DNADNA均需均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導(dǎo)致導(dǎo)致PCRPCR擴增完全失敗?？紤]到密碼子的簡并性，擴增完全失敗?？紤]到密碼子的簡并性，引物3端最后一個堿基最好不與密碼子第三個堿基配對。引物。引物3 3端端不要出現(xiàn)3 個以上的連續(xù)堿基，如，如GGG GGG 或或CCCCCC，否則會使錯誤引發(fā)機，否則會使錯誤引發(fā)機率增加。率增加。 引物引物3 3端的末位堿基對端的末位堿基對Taq Taq 酶的酶的DNADNA合成效率有較大的影響。合成效率有較大的影響

8、。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3 3端使用堿基端使用堿基A A。引物5端 引物引物5 5端可以有與模板端可以有與模板DNADNA不配對堿基，在不配對堿基，在5 5端引端引入一段非模板依賴性序列。入一段非模板依賴性序列。 5 5端加上端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點序列（酶切位點（酶切位點5 5端加端加上適當(dāng)數(shù)量的保護堿基）。上適當(dāng)數(shù)量的保護堿基）。 5 5端的某一位點修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該端的某一位點修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點的

9、位點的點突變以作研究。以作研究。 5 5端端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。辛等）。引物的保守性與特異性 保守性：通用引物檢測同一類病原微生物盡可能多的型別 特異性：避免非特異性擴增擴增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu) 模板DNA的某些區(qū)域具有高度復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，在選擇引物時，應(yīng)使擴增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域。 擴增區(qū)域的自由能（G。）小于58.61kJ/mol 引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30 Tm product = 81.5 + 16.6 log (K+/(1+0.7K+) + 0.41 (%G + %C) - 500/length

10、(primer premier 5.0)lTm product = 81.5 + 16.6(log10(Na+) + 0.41 (%G + %C) - 600/length (primer 3)引物與PCR 引物濃度：一般為0.1-0.5umol/L 引物濃度(uM)=n OD33/（A312C288G328T303-61）/VH2O VH2O (單位：L) 退火溫度 最適退火溫度（Ta Opt ） = 0.3 (Tm of primer) + 0.7 (Tm of product) 25 一般采用較引物Tm值低5作為PCR退火溫度。引物設(shè)計軟件引物設(shè)計軟件 Primer Premier 5.

11、0 Oligo Primer express primer 3 MethPrimerDNA 聚合酶(DNA polymerase) 特性： 熱穩(wěn)定性:92.5、95、97.5時，半衰期分別為130min、40min、5-6min 延伸效率:75-80時，150個核苷酸/s 校正功能:Taq DNA聚合酶沒有3-5外切酶活性，Vent 、pfu等具有3-5外切酶活性dNTP dNTP：包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。 量：20-200umol/L dNTP會絡(luò)合Mg2+，當(dāng)PCR需要較高濃度的dNTP時，應(yīng)在反應(yīng)體系中適當(dāng)增加Mg2+濃度。 PCR緩沖液（PCR buffer） 一般

12、組成：50mM KCl, 10-50mM Tris-Cl(室溫PH8.3) ，1.5mM MgCl2 Mg2+濃度： 附加成分：牛血清白蛋白、明膠、非離子去污劑（如Tween20，濃度0.05%）二甲亞砜（DMSO）PCR一般方案反應(yīng)組成 50 ul PCR反應(yīng)體系的組成： 樣品DNA 0.11ug； 正、負鏈引物（25umol/L）各1.0ul； 脫氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul 10PCR緩沖液 5.0ul ； MgCl2（25mmol/L）3.0ul ； Taq DNA聚合酶12.5u ； 蒸餾的去離子水補至50ul，短暫離心混勻。 陽性對照、空白對照分別以陽性模

13、板DNA、蒸餾的去離子水取代樣品DNA。 PCR 94, 300S 94, 60S 30 55, 60S 72, 60S 72, 5-10min PCRPCR一般方案一般方案熱循環(huán)熱循環(huán)PCR反應(yīng)體系、條件的優(yōu)化 三磷酸脫氧核苷酸 耐熱DNA聚合酶 緩沖液 模板核酸 引物 Mg2+ 變性溫度與時間 復(fù)性溫度與時間 延伸溫度與時間 循環(huán)數(shù)和擴增效率 降落PCR (Touchdown PCR) 熱啟動PCR（hot start PCR）降落 PCR(Touchdown PCR) 根據(jù)引物Tm值，選定一個退火溫度范圍（跨越10-20的溫度范圍，引物Tm值在這個范圍之內(nèi)）。在設(shè)置循環(huán)參數(shù)時，讓退火溫度

14、從選定范圍的最高溫度開始，逐步降低退火溫度（每次降低1-5），最后結(jié)束在選定范圍的最低溫度。在每一個退火溫度上循環(huán)2-5次。 舉例：如果一對引物的Tm值為60，可設(shè)置退火溫度從63降低到48，每次降低1，每個退火溫度循環(huán)兩個周期，最后在48退火溫度下做15個循環(huán)。熱啟動PCR（hot start PCR） PCR反應(yīng)體系中先不加Taq DNA聚合酶，等PCR擴增儀的溫度上升到80以后再加Taq DNA聚合酶。 將石蠟珠在Ependorf管中PCR反應(yīng)液上面融化并凝固，在石蠟層上面加上Taq DNA聚合酶。在溫度上升到變性溫度時，石蠟融化，Taq DNA聚合酶進入反應(yīng)體系，通過對流作用而混勻。

15、在PCR反應(yīng)液中加入Taq DNA聚合酶的單克隆抗體，再加入Taq DNA聚合酶，在溫度上升到將此抗體變性滅活前，抗體中和Taq DNA聚合酶活性，Taq DNA聚合酶對引物無法進行延伸。待溫度上升到足夠高時，抗體失活，擴增反應(yīng)開始。 擴增產(chǎn)物的檢測及分析 凝膠電泳： 瓊脂糖凝膠電泳法 聚丙烯酰胺凝膠電泳法 PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析法（PCR-RFLP） 單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SSCP） 核酸探針雜交法 PCR產(chǎn)物測序 瓊脂糖凝膠電泳 制膠 加樣 電泳 紫外光檢測 特點： 分辨力高，長度僅相差1bp的DNA分子即可分開； 上樣量遠大于瓊脂糖凝膠； 回收的DNA純度高； 采用銀染

16、色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點。 用途：PCR擴增指紋圖、多重PCR。聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 據(jù)目的基因序列可查出所包含的酶切位點，用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶消化PCR擴增產(chǎn)物，然后進行電泳，觀察消化片段的大小是否與序列資料相符。 用途： 傳染病病原體基因分型 人類基因的變異性研究。單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP） 將PCR 產(chǎn)物雙鏈DNA（

17、dsDNA）變性為單鏈DNA （ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，由于DNA 分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，而空間結(jié)構(gòu)又與ssDNA序列有關(guān)。因此，電泳結(jié)束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。核酸探針雜交法 點雜交 反向點雜交 微孔板雜交 熒光探針雜交法點雜交（dot blot） 原理：將擴增產(chǎn)物變性后直接點在尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的寡核苷酸探針與之雜交。 探針： 放射性同位素標(biāo)記探針檢測的敏感、特異，具有不穩(wěn)定性和放射性危害。 非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛、熒光素等）標(biāo)記的探針穩(wěn)定性高、使用安全、檢測速

18、度快 用途：主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。反向點雜交(reverse dot blot) 原理：使用帶有標(biāo)記物的引物進行PCR擴增，然后將擴增產(chǎn)物變性。將不同的寡核酸探針固定在尼龍膜上，用變性的PCR產(chǎn)物與之雜交。 探針：嚴格設(shè)計，具有相同的雜交反應(yīng)條件。 用途：反向點雜交特別適用于遺傳性疾病多個位點的點突變分析。 結(jié)果分析： 正常純合子 突變純合子 雜合子微孔板雜交( microplate hybridization) 夾心雜交夾心雜交熒光探針雜交法 目前臨床上常用熒光探針法來檢測PCR產(chǎn)物，主要的方法有TaqMan技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)、復(fù)合探針法等。PCR產(chǎn)物測序 對PCR產(chǎn)物進行

19、測序是檢測PCR產(chǎn)物特異性最可靠的方法，可將PCR產(chǎn)物克隆到載體上進行測序，也可對直接PCR產(chǎn)物進行測序。常見問題原因分析及處理 假陽性 非特異性PCR產(chǎn)物 假陰性 引物二聚體 假陽性 PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。 含有靶DNA序列的質(zhì)粒的污染。 陽性對照的污染。 標(biāo)本之間的交叉污染。 Taq聚合酶中帶有細菌DNA，當(dāng)PCR擴增片段為保守的rRNA序列時，易造成假陽性。 怎么可能全家人都得了性病 ? 何某，女，46歲，某部隊衛(wèi)生所護士，離婚10年，與一男友交往5年。她近來忽然感到陰部瘙癢，白帶有異味，想到自己有非婚性行為，怕萬一得性病被人知道，便悄悄到郊區(qū)一個小診所去看病。結(jié)果被告知是淋病，用

20、了許多藥，未見明顯好轉(zhuǎn)。她通過查書感到問題嚴重”，擔(dān)心全家都會傳染，尤其是正讀初中的女兒被傳染上怎么辦？為了孩子，顧不上面子了。她不僅帶自己的女兒、70歲老母到醫(yī)院檢查，還動員最近與其同居一處的妹妹、妹夫及14歲的外甥女都到醫(yī)院檢查。醫(yī)師給他們用最先進的PCR”檢測，結(jié)果6個人都是淋球菌感染”！ 非特異性PCR產(chǎn)物 引物特異性不高，引物用量過多，應(yīng)調(diào)換引物或降低引物用量。 Taq DNA聚合酶質(zhì)量不好或用量偏高，應(yīng)降低酶量或使用質(zhì)量較好的酶。 Mg2+ 濃度過高，可適當(dāng)調(diào)節(jié)Mg2+濃度。 退火溫度過低，退火及延伸時間偏長，可提高退火溫度，減少退火及延伸時間，或者采用二溫循環(huán)PCR進行擴增。 熱

21、循環(huán)次數(shù)過多，適當(dāng)增加模板用量，減少循環(huán)次數(shù)。假陰性 引物設(shè)計是否合理 標(biāo)本中是否有Taq酶抑制劑，Taq酶是否失活。 反應(yīng)體系中有無蛋白酶或核酸酶降解DNA聚合酶或模板DNA，可在95以上加熱10分鐘使其滅活。 反應(yīng)體系中是否有較難去除的蛋白質(zhì)抑制PCR系統(tǒng)，用蛋白酶K重新處理?？色@預(yù)期結(jié)果。 循環(huán)溫度，特別是解鏈溫度是否準(zhǔn)確，退火溫度是否過高。有些PCR儀指示溫度與實際溫度不符，過高則酶在前幾個循環(huán)中迅速失活，過低則模板變性不徹底 檢測PCR產(chǎn)物方法靈敏度不夠，如瓊脂糖凝膠電泳法敏感性較低。 靶序列發(fā)生突變、缺失等引物二聚體 v兩個相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對，特別是引物3端

22、有互補區(qū)。v引物模板比例太高，可增加模板用量。v退火溫度過低。v熱循環(huán)次數(shù)過多。 PCR污染及預(yù)防措施 分開操作區(qū)域。 耐高壓的試劑及器材應(yīng)高溫高壓滅菌。 使用一次性Tip頭、Eppendorf管等。 小量分裝試劑。 樣品制備應(yīng)按無菌操作原則進行，避免樣品間相互污染。 操作者帶手套操作，且應(yīng)勤換手套。 使用尿嘧啶-DNA-糖基化酶控制PCR產(chǎn)物交叉污染。 每次PCR操作都應(yīng)設(shè)陽性及陰性對照 。 RNA酶的污染與預(yù)防 去除外源RNase污染 玻璃器皿常規(guī)洗凈后，應(yīng)用0.1% DEPC處理。 所有溶液應(yīng)加DEPC至0.05%0.1%，室溫處理過夜，然后高壓處理。 操作者戴口罩和手套。 材料器材使用

23、滅菌一次性用品。 抑制內(nèi)源性RNase的活性 使用低特異性RNase抑制物：如皂土、復(fù)合硅酸鹽、肝素、DEPC等。 去除蛋白質(zhì)物質(zhì)：蛋白質(zhì)變性劑、蛋白酶K、陰離子去污劑等，常與RNA酶抑制物聯(lián)合使用，以加強對RNase活力的抑制。 RNase的特異性抑制劑：如RNase阻抑蛋白（RNasin）、氧釩核糖核苷復(fù)合物。 PCR衍生技術(shù) 巢式PCR（nested PCR ） 逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 多重PCR(multiplex PCR) 重組PCR(recombinant PCR) 錨定PCR（anchored PCR, A-PCR） 不對

24、稱PCR（asymmetric PCR） 反向PCR（inverse PCR） 擴增長片段PCR（long PCR，long-distance PCR） 免疫PCR(immuno-PCR) 定量PCR 巢式PCR（nested PCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為42）MoMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為37）逆轉(zhuǎn)錄引物逆轉(zhuǎn)錄引物隨機引物；隨機引物；Oligo(dT)；特異性引物。特異性引物。one-step RT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄：在同一體

25、系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、引物、Taq DNA聚合酶、聚合酶、PCR引物、引物、dNTP和緩沖液，直和緩沖液，直接以接以mRNA 為模板進行逆轉(zhuǎn)錄和為模板進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，稱為一步法擴增，稱為一步法RT-PCR。多重PCR(multiplex PCR) 重組PCR(recombinant PCR) 錨定PCR（anchored PCR, A-PCR） 基本原理：抽提細胞總基本原理：抽提細胞總RNA或或mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成作用下合成cDNA，通過，通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA 3端加上端加上poly(dG)尾。據(jù)此設(shè)計錨定引物尾。據(jù)此設(shè)計錨定引物po

26、ly(dC)，為，為提高擴增特異性，提高擴增特異性，poly(dC)在十二聚以上，錨定引物在十二聚以上，錨定引物5端可加上某些限制性內(nèi)切酶識別序列或其它序列信端可加上某些限制性內(nèi)切酶識別序列或其它序列信息。根據(jù)已知的息。根據(jù)已知的3端序列設(shè)計基因特異性引物，與錨端序列設(shè)計基因特異性引物，與錨定引物一起進行定引物一起進行PCR擴增。擴增。用途：檢測用途：檢測T細胞受體和免疫球蛋白基因的多態(tài)性。細胞受體和免疫球蛋白基因的多態(tài)性。不對稱PCR（asymmetric PCR） 基本原理：采用兩條不同濃度的引物，即非限制引物(高濃度引物)與限制性引物(低濃度引物)，二者之比為50-100：1。在PCR最

27、初10-15個循環(huán)中，擴增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA(dsDNA)；第15個循環(huán)以后，限制性引物已被耗盡，非限制性引物介導(dǎo)的PCR就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA(ssDNA)。 關(guān)鍵：控制限制性引物的絕對量，需多次摸索優(yōu)化兩條引物的比例。也有人先用等濃度的引物PCR擴增，制備雙鏈DNA；然后以雙鏈DNA為模板，再以其中的一條引物進行第二次PCR，制備單鏈DNA。 反向PCR（reverse PCR） 反向PCR用于快速擴增已知序列以外的未知DNA片段，從而對未知序進行分析研究。該法首先用已知序列和待擴增序列都沒有切點的限制性核酸內(nèi)切酶將模板DNA消化，再用連接酶使酶切產(chǎn)物環(huán)化，使已知的和待擴增的未知序列都

28、包含在環(huán)中。在已知序列內(nèi)設(shè)計一對反向的引物，即可擴增已知序列以外的區(qū)域。反向反向PCR已知序列PCR用途用途：未知序列的研究未知序列的研究限制酶切點（限制酶切點（X）限制酶切點（限制酶切點（X）限制酶限制酶X酶切酶切連接連接未知序列未知序列擴增長片段PCR（long PCR） 模板完整性：應(yīng)用瓊脂糖包埋細胞抽提法模板DNA 。 引物：一般較長（22-35nt），Tm值較大。 DNA聚合酶：長片段PCR應(yīng)采用錯配率低的耐熱DNA聚合酶：如Ampli Taq、rTth、Hot Tube、Vent、Deen Vent、Pfu、rTma等。Vent、Deen Vent、Pfu、rTma等聚合酶有3-5

29、外切酶活性。 PCR緩沖液：增加Tris的濃度或改用Tricine緩沖液以增強緩沖能力，并使緩沖液pH適度升高。此外，加入適量的甘油、DMSO（二甲亞砜）、明膠、聚乙二醇、Tween 20等物質(zhì)，有助于模板變性和維持DNA聚合酶的穩(wěn)定。 熱循環(huán)：增加延伸時間（一般1kb/min），提高退火溫度，同時采用熱啟動。熱循環(huán)后期，適當(dāng)增加延伸時間，以保證產(chǎn)物充分延伸。免疫PCR(immuno-PCR)原位PCR（in situ PCR ） 直接法：使用標(biāo)記（放射性同位素、生物素、地高辛、熒光素等）的引物或脫氧三磷酸核苷酸（如dUTP）進行PCR擴增，則標(biāo)記物摻入到PCR 產(chǎn)物中。最后用放射自顯影、免疫

30、組化或熒光法檢測 PCR 產(chǎn)物及其在細胞內(nèi)位置。 間接法：先進行細胞內(nèi)DNA的原位擴增，然后用標(biāo)記的核酸探針進行原位雜交。 原位逆轉(zhuǎn)錄PCR（in situ reverse transciption PCR）定量PCR 概念：通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，對PCR起始模板進行定量的技術(shù) 。 N= N0(1+E)c 定量PCR中擴增產(chǎn)物的檢測方法 凝膠電泳： PCR-ELISA 熒光PCR法 由于熒光PCR可使用現(xiàn)代化儀器對PCR產(chǎn)物實行實時檢測，很容易保證擴增在指數(shù)增長期內(nèi)進行，是定量PCR擴增產(chǎn)物檢測的一個發(fā)展方向。第二節(jié) 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Fluorescence Qua

31、ntitive Polymerase Chain Reaction，F(xiàn)Q-PCR） 一、熒光定量PCR技術(shù)基本原理 二、熒光定量PCR技術(shù) 三、熒光定量PCR測定的數(shù)據(jù)處理 四、實時熒光定量 PCR技術(shù)的應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)基本原理 熒光擴增曲線圖 Ct值 標(biāo)準(zhǔn)定量曲線 熒光擴增曲線圖熒光定量PCR：通過對 PCR 擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。隨著 PCR 反應(yīng)的進行,PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每個循環(huán)收集一個熒光強度信號，通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線.Ct 值 N= N0(1+E) c

32、 logN=logN0+clog(1+e) Ct值的重現(xiàn)性 PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。初始模板量的對數(shù)與初始模板量的對數(shù)與C(T)C(T)循環(huán)數(shù)之間循環(huán)數(shù)之間 呈線性關(guān)系呈線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)定量曲線標(biāo)準(zhǔn)定量曲線熒光強度熒光強度-循環(huán)數(shù)曲線循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)初始模板量對數(shù)-C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線熒光定量PCR技術(shù) 熒光染料法熒光標(biāo)記探針 TaqMan熒光標(biāo)記探針 molecular Beacon熒光標(biāo)記探針 熒光標(biāo)記雜交雙

33、探針熒光染料法SYBR染料 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。5353SGExcitationSGSGSGSGEmission雙鏈熒光染料雙鏈熒光染料5353SGSGSGSGSGExcitationEmission溶解曲線分析（溶解曲線分析（TmTm）特異性問題特異性問題TaqMan探針法 遵循一般引物設(shè)計原則； 引物之間的Tm相差避免超過2； 為避免基因組的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子；TaqMan技術(shù)引物設(shè)計原則Taq

34、Man探針設(shè)計原則 先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近探針； 探針長度應(yīng)在15-45bp（最好是20-30bp)，以保證結(jié)合特異性； 探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)；盡量避開二級結(jié)構(gòu)； Tm值在65-70，通常比引物Tm值高5-10，GC含量在40%70%； 探針的5端應(yīng)避免使用G鳥嘌呤因為5G會有淬滅作用，而且即使是被切割下來還會存在淬滅作用； 整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量G含量高會降低反應(yīng)效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針； 為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。TaqMan MGB 探針設(shè)

35、計 盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長度不少于13bp。 盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn)4個或4個以上的G重復(fù)出現(xiàn)。 原則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號)。分子信標(biāo)技術(shù) 工作原理 發(fā)夾形的寡聚核苷酸探針 內(nèi)部淬滅的熒光團Loop 能和靶序列互補Stem 是由互補序列組成RQExcitationRQQRExcitationEmissionOligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640FRET ProbesExcitationEmissionTransfer熒光能量傳遞熒光能量傳遞復(fù)

36、合探針法 其他核酸擴增技術(shù) 核酸序列依賴性擴增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA) 連接酶鏈反應(yīng)(ligase chain reaction，LCR) 分枝DNA信號放大系統(tǒng) 核酸序列依賴性擴增連接酶鏈反應(yīng)分枝DNA信號放大系統(tǒng)第四節(jié) 臨床基因擴增實驗室的管理與質(zhì)量控制 一、臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置 二、操作人員培訓(xùn) 三、臨床基因擴增檢驗實驗室質(zhì)量保證 臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置操作人員培訓(xùn) 臨床基因擴增檢驗實驗室技術(shù)人員必須進行上崗培訓(xùn)。經(jīng)過培訓(xùn)合格者，由培訓(xùn)單位頒發(fā)合格證書，并將培訓(xùn)合格人員名單報衛(wèi)生部臨檢中心備案。獲得培訓(xùn)合格證書者方可從事臨床基因擴增檢驗工作。臨床基因擴增檢驗實驗室質(zhì)量保證 標(biāo)本的采集 標(biāo)本的預(yù)處理 標(biāo)本的運送 臨床標(biāo)本的接收 核酸的提取 靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄和擴增 污染與預(yù)防 擴增產(chǎn)物的分析 質(zhì)量控制 室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC） 標(biāo)本制備 逆轉(zhuǎn)錄和擴增 板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質(zhì)控 測定結(jié)果的評價與報告 室間質(zhì)量評價（EQA）