色譜分析技術(shù)和色譜分析儀器.ppt

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1、第五章 色譜分析技術(shù)和色譜分析儀器,色譜儀器是近幾十年來迅速發(fā)展起來的一類新型分離分析儀器，主要用于復(fù)雜的多組分混合物的分離、分析。 本章將系統(tǒng)介紹有關(guān)色譜儀器的原理、結(jié)構(gòu)和使用。,第五章 色譜分析技術(shù)和色譜分析儀器,,第一節(jié) 色譜法概述,第二節(jié) 氣相色譜儀,第三節(jié) 高效液相色譜儀,第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),第五章 色譜分析技術(shù)和色譜分析儀器,目 錄,引言,本章內(nèi)容小結(jié),色譜法（chromatography）是一種物理分離技術(shù)，實質(zhì)上是利用混合物中各個組分在互不相溶的兩相（固定相和流動相）之間的分配的差異而使混合物得到分離的一種方法，也有人稱之為色層法、層析法等。,第一節(jié) 色譜法概述,,,

2、引 言,色譜儀（chromatograph）的實質(zhì)是利用色譜分離技術(shù)再加上檢測技術(shù)，對混合物進(jìn)行先分離后檢測，從而實現(xiàn)對多組分的復(fù)雜混合物進(jìn)行定性、定量分析。,第一節(jié) 色譜法概述,,,,色譜分離中的兩相是指系統(tǒng)具有一個有大比表面積的固定相（stationary phase）（可以是固體或以某種方式固定了的液體）和一個能攜帶待分離混合物流過固定相的所謂流動相（mobile phase）（可以是氣體或液體）。,第一節(jié) 色譜法概述,,,,色譜工作就是根據(jù)被測樣品（混合物）的性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)膬上嗪推渌僮鳁l件，利用分離系統(tǒng)將各個組分分離開來，通過檢測系統(tǒng)進(jìn)行定性、定量分析。具有高分辨率、高靈敏度、樣品

3、量少且速度較快、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，是分析混合物的有效方法。,第一節(jié) 色譜法概述,,,第一節(jié) 色譜法概述,目 錄,一、色譜法的研究進(jìn)展,二、色譜分離的基本原理,三、色譜儀的分類及特點,四、色譜儀的輸出信息,五、色譜技術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用,,一、色譜法的研究進(jìn)展 1903年至1906年俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）首先利用分離及分析技術(shù)進(jìn)行植物色素方面的研究，“色譜”因此而得名。 1931年，文特斯?。╓interstein)開始將這種分離技術(shù)應(yīng)用于無色物質(zhì)的分離。,第一節(jié) 色譜法概述,,,,1952年，馬?。∕artin）等人提出了氣液（分配）色譜法，正式推出了氣相色譜技術(shù)，為色譜技術(shù)及色譜儀

4、的發(fā)展開辟了廣闊的前景。在50年代60年代，氣相色譜儀的發(fā)展速度幾乎居各類分析儀器的首位。,第一節(jié) 色譜法概述,,,,,液相色譜技術(shù)的發(fā)展相當(dāng)緩慢。直到60年代初，由于高壓技術(shù)、高效固定相、檢測技術(shù)的發(fā)展以及電子、計算機(jī)技術(shù)等方面的新成就的不斷涌現(xiàn)，才給液相色譜技術(shù)及液相色譜儀的發(fā)展創(chuàng)造了有利條件，使它在70年代迅速發(fā)展起來。,第一節(jié) 色譜法概述,,,,,目前氣相色譜儀和液相色譜儀都已發(fā)展成熟廠家在生產(chǎn)此類儀器，應(yīng)用也十分普遍。 采用微處理器自動控制可以通過鍵盤操作完成色譜條件的設(shè)定、控制和對儀器工作狀態(tài)的監(jiān)控，色譜輸出信息也可通過接口電路送入計算機(jī)進(jìn)行計算、標(biāo)定、測量與分析，最后用打印機(jī)等輸

5、出設(shè)備給出需要的結(jié)果。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,,色譜儀的聯(lián)用技術(shù)也越來越受到廣泛的重視，如氣相色譜儀和質(zhì)譜儀的聯(lián)用已十分普及，液相色譜儀與質(zhì)譜儀的聯(lián)用也在不斷發(fā)展。微機(jī)化和聯(lián)用技術(shù)在目前的色譜儀中既已普遍采用又在不斷向縱深發(fā)展。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,,在氣相色譜儀中，除常用的填充柱氣相色譜儀外，由于毛細(xì)管柱尤其是大口徑毛細(xì)管柱的發(fā)展，毛細(xì)管柱氣相色譜儀由于其強(qiáng)大的分離效能也得到了越來越普遍的應(yīng)用。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,,在液相色譜儀中，用得最多的還是高效液相色譜儀，但隨著生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)科的發(fā)展，制備型液相色譜儀、低壓液相色譜儀、超臨界流體色譜儀（特別是毛細(xì)管超臨界流體

6、色譜儀）、膜色譜技術(shù)、離子色譜儀也在不斷研究、開發(fā)和應(yīng)用。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,二、基本原理 色譜是利用待分離的樣品組分在兩相中分配的差異而實現(xiàn)分離的。,第一節(jié) 色譜法概述,,,,第一節(jié) 色譜法概述,,,,,由此可見，色譜分離的兩要素是互不相溶的兩相（流動相及固定相）以及樣品（混合物）各組分在兩相中分配的差異，它是決定色譜最終分離結(jié)果好壞的基礎(chǔ)。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,三、色譜儀的分類及其特點1.色譜儀的分類 目前比較成熟的主要是氣相色譜儀與液相色譜儀（高效液相色譜儀）兩大類。儀器的組成極為相似，主要由流動相供給、進(jìn)樣、分離（色譜柱）、檢測、數(shù)據(jù)處理記錄、溫度控制和其他控制系統(tǒng)等組

7、成。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,氣相色譜儀具有高分辨率、高速度、高靈敏度及選擇性好等優(yōu)點。但只能用于被氣化物質(zhì)的分離、檢測，而常壓下可氣化或可定量轉(zhuǎn)變?yōu)闅饣难苌锏奈镔|(zhì)，其總的比例大約只占幾百萬種化合物的20左右。大部分物質(zhì)不能被氣化，因而也就不能用氣相色譜法。,,,,,第一節(jié) 色譜法概述,液相色譜的樣品無需氣化而直接導(dǎo)入色譜柱進(jìn)行分離、檢測，特別適用于氣化時易分解物質(zhì)的分離、分析。約有70左右的有機(jī)物能分析。通常認(rèn)為有機(jī)物質(zhì)分子量400時，用氣相色譜儀；在4001000時，最好用高效液相色譜儀；1000時用凝膠色譜(排阻色譜)。,,,,,第一節(jié) 色譜法概述,2.色譜儀的特點 根據(jù)色譜分離

8、的基本原理可以看出：色譜儀的主要特點是可以對混合物進(jìn)行多組分分析或全分析。儀器結(jié)構(gòu)簡單，操作使用方便，具有應(yīng)用范圍廣、樣品用量少、高選擇性、高效能、高速度以及高靈敏度等優(yōu)點。,,,,,第一節(jié) 色譜法概述,（1）應(yīng)用范圍廣是指色譜儀可用于所有化合物的分離和分析，既能對有機(jī)物、無機(jī)物、低分子或高分子化合物，又能對有生物活性的生物大分子分離和測定。（2）樣品用量少是指色譜儀用極少的樣品就能完成一次分離及分析，進(jìn)而可以實現(xiàn)痕量分析、微量分析。,,,,,第一節(jié) 色譜法概述,（3）高選擇性是指對性質(zhì)極為相近的物質(zhì)，如同位素、同分異構(gòu)體等，通過選取適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗉傲鲃酉嗪头蛛x條件，可實現(xiàn)分離及分析。（4）高效

9、能是指色譜分析能夠分析分配系數(shù)極為接近的組分，從而可分離并分析極為復(fù)雜的混合物。,,,,,第一節(jié) 色譜法概述,（5）高靈敏度是指色譜儀能分析含量極微的物質(zhì)，如氣相可檢出10-11g1013g物質(zhì)。液相也接近此精度。 （6）色譜儀的分析速度較快，只需幾分鐘至幾十分鐘就可完成一個樣品的分析工作。,,,,,第一節(jié) 色譜法概述,與光譜儀、質(zhì)譜儀等分析儀器相比較，色譜儀的突出優(yōu)點是對多組分混合物分離、分析能力較強(qiáng)，其分析靈敏度與質(zhì)譜儀接近，比光譜儀高。而且造價低，使用方便。,,,,,第一節(jié) 色譜法概述,色譜儀最大的不足之處是難于分析未知物。因此，可以將其與光譜儀、質(zhì)譜儀聯(lián)合起來使用，優(yōu)勢互補(bǔ)，形成色譜-

10、光譜法、色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用技術(shù)，再配備上微機(jī)進(jìn)行自動控制與信息處理。多機(jī)聯(lián)用與微機(jī)化、自動化是現(xiàn)代分析儀器發(fā)展的重要趨勢。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,四、色譜儀的輸出信息1.色譜圖（chromatogram） 表明已被色譜柱分離的物質(zhì)流過檢測器的含量與時間的關(guān)系。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,,,,第一節(jié) 色譜法概述,,2.基線（base line） 是圖中與時間軸平行t的記錄線b。它表明純流動相流過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)。判斷基線穩(wěn)定與否的標(biāo)準(zhǔn)是基線穩(wěn)定性，即基線b與時間軸t平行或偏離的程度。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,,3.色譜峰 檢測器的輸出信號隨流入組分的濃度或質(zhì)量的變化出一個個的峰形，即為

11、色譜峰（chromatographic peak）。色譜峰所包圍的面積稱為峰面積，是色譜定量分析的基礎(chǔ)。色譜峰最高點至峰底的垂直距離稱為峰高（peak height)h。,,,,,第一節(jié) 色譜法概述,進(jìn)樣峰（injection peak）是進(jìn)樣時操作條件被干擾出現(xiàn)的，也可在進(jìn)樣時通過連動裝置進(jìn)行標(biāo)記，是色譜分離過程中時間的起點?？諝夥澹╝ir peak）是由于空氣等物質(zhì)不被固定相吸收，最先被流動相沖洗出來到達(dá)檢測器而形成的峰形。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,,4.保留時間 從進(jìn)樣開始到出現(xiàn)色譜峰最大值所需的時間為保留時間（re-tention time）。常用tR（組分名）（或簡寫為tR）表示，

12、如tR1、tR2等，單位為min。與保留時間有關(guān)的其他參數(shù)，如保留體積、校正保留時間等，統(tǒng)稱保留參數(shù)。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,,5.死時間 死時間（dead time）是指惰性物質(zhì)組分，從注入到出現(xiàn)峰的最高點所需時間，若組分是空氣，用符號t0表示，單位為min。死體積（dead volume）指色譜柱內(nèi)流動相的體積，在實際中包括從進(jìn)樣系統(tǒng)到檢測器的體積。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,五、色譜技術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用 氣相色譜儀常用于人體微量元素的快速分析，血與尿等體液中的脂肪酸、氨基酸、甘油三酸酯、甾族化合物、糖類、蛋白質(zhì)、維生素、巴比妥酸等化合物的分析，分析鑒定藥物的組成和含量、檢測人體的代

13、謝產(chǎn)物，通過氣相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜，在“興奮劑”檢測中可分析100余種違禁藥品等。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,高效液相色譜儀可以應(yīng)用在：分析人體體液內(nèi)正常與異常代謝物質(zhì)；分析藥物的組成和含量，在藥物生產(chǎn)中進(jìn)行中間控制；分析藥物在體內(nèi)的殘留量，測定藥物在各器官中的代謝產(chǎn)物，進(jìn)行治療藥物效果的監(jiān)測（治療藥物檢測)；定性測定細(xì)胞核中的核苷及核苷酸，分析核酸以及分析氨基酸、酶、糖；激素水平的測定，微生物的鑒定等。,,,,第一節(jié) 色譜法概述,一臺典型的氣相色譜儀主要由氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)(色譜柱)、檢測系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理、記錄系統(tǒng)及電源、電子線路等構(gòu)成。,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,國產(chǎn)氣相色

14、譜儀,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,國外產(chǎn)氣相色譜儀,圖5.3 氣相色譜儀方框圖,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,第二節(jié) 氣相色譜儀,一、氣路系統(tǒng),二、進(jìn)樣系統(tǒng),三、氣相色譜柱及溫度控制,四、程序升溫氣相色譜法,五、氣相色譜儀常用檢測器,六、氣相色譜儀的操作,目 錄,一、氣路系統(tǒng) 氣相色譜儀的氣路系統(tǒng)通常由載氣源、減壓閥、凈化器、穩(wěn)壓閥、穩(wěn)流閥、柱子及全部連接管道構(gòu)成。氣路系統(tǒng)的目的是向色譜柱提供質(zhì)地潔凈、流動平穩(wěn)的流動相。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,（一）載氣源和減壓閥 載氣一般選用氦氣、氮氣、氫氣或氬氣。貯存在高壓氣瓶中。減壓閥作用是把氣體的壓強(qiáng)從10MPa15MPa的高壓降低到0.2MPa0.4

15、MPa的工作壓強(qiáng)。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,（二）凈化器 載氣中一般含有水、碳?xì)浠衔?、二氧化碳和其他惰性氣體。 載氣是否凈化對檢測器的穩(wěn)定性和響應(yīng)的影響的嚴(yán)重程度與檢測器的靈敏度的增加成正比。凈化器主要對載氣凈化，去掉其中的水分、有機(jī)烴類雜質(zhì)。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,（三）穩(wěn)壓閥和穩(wěn)流閥 用于控制載氣流量和壓強(qiáng)，保證載氣的平穩(wěn)性。均為機(jī)械負(fù)反饋形式，通過波紋管壓縮、伸張或彈性膜片受力改變產(chǎn)生機(jī)械作用，帶動入氣口或出氣口的改變，引起氣體流量的變化，從而調(diào)整壓強(qiáng)或流量，達(dá)到載氣流量或壓強(qiáng)恒定的目的。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,A,B,,,,第二節(jié) 氣相色譜

16、儀,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,二、進(jìn)樣系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng)由載氣預(yù)熱器、取樣器、樣品分流器和進(jìn)樣氣化裝置等組成。進(jìn)樣系統(tǒng)的要求一方面是準(zhǔn)確定量，迅速注入。另一方面氣態(tài)或經(jīng)氣化的樣品能在載氣中形成一個窄帶集中地進(jìn)入色譜柱，否則測量結(jié)果將毫無意義。,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,（一）載氣預(yù)熱器、取樣器 載氣預(yù)熱器是一種可以給載氣加熱的裝置，主要是為了防止氣化后的樣品遇上冷的載氣而被冷凝下來，影響樣品的分離。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,液體樣品進(jìn)入色譜柱的最普通的方法是使用微升注射器。樣品量在1l10l之間。常用5l和10l注射器。當(dāng)是氣態(tài)樣品時，必須有一個理想規(guī)格（0.1ml5ml）的氣密注射器。,,

17、,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,為了取樣的準(zhǔn)確性，常選用專門的取樣閥取樣。氣體取樣閥按其結(jié)構(gòu)通常分為膜片式、拉動式和旋轉(zhuǎn)式幾種。也可按樣品和載氣分為四通、六通、十通閥等類型。以旋轉(zhuǎn)式六通閥最為常用。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,（二）進(jìn)樣氣化裝置 進(jìn)樣氣化裝置（或稱氣化器）功能是接收樣品后，立即使其氣化。由于液體樣品進(jìn)入后在瞬間應(yīng)使其各組分完全氣化，并保證組分瞬間完全氣化，而又不致于分解。,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,三、氣相色譜柱及溫度控制（一）氣相色譜柱1.固定相 整個氣相色譜系統(tǒng)的核心是分析柱，混合物各個組分的分離就是在此完成。在使用氣相色譜儀的過程中，優(yōu)良的柱子應(yīng)該

18、具有適當(dāng)?shù)某叽绾瓦m當(dāng)?shù)墓潭ㄏ唷?,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,一般說來，非極性液態(tài)固定相最適于分離鏈烷烴之類的非極性混合物，而極性固定相最好是分離極性化合物，如醇或酚等。 在氣固色譜中，常選用的填充吸附劑主要有強(qiáng)極性的硅膠，中等極性的氧化鋁，非極性的活性炭以及分子篩等。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,2.柱管形狀和尺寸 柱管形狀一般有三種，即U型管、盤形管和螺線管，其中以U型管最常用。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,柱子的尺寸應(yīng)對容量（樣品量）和分析速度最佳化。為獲得最大效率，可用內(nèi)徑較小、長度較長的毛細(xì)管柱。 當(dāng)分析的樣品量較大且分離不困難時，可用內(nèi)徑較大、長度較短的填充柱。,,,,第二節(jié) 氣相色

19、譜儀,,（二）溫度控制 氣態(tài)樣品決定了必須進(jìn)行溫度操作。 首先，溫度對于固定相十分重要。操作時一定要知道所用固定相溫度的極限，把全部操作保持在臨界溫度以下100C150C進(jìn)行。這將有助于延長柱子的使用壽命和避免檢測器與其他裝置受固定相“流失”所造成的污染。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,其次，在氣相色譜儀中，溫度不僅對樣品在色譜柱上的分離過程有很大影響，對許多檢測器（如熱導(dǎo)、電子捕獲、示差折光等）的檢測結(jié)果也有很大影響。即溫度的測控與色譜儀的正常工作及其測量結(jié)果的可靠性有密切的關(guān)系。因此必須實行溫度控制。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,控溫的關(guān)鍵在于溫度條件的穩(wěn)定性。它將直接影響色譜柱的分離效

20、率，保留參數(shù)的重復(fù)性以及檢測器的性能。 溫度控制一般是通過對具有一定體積的恒溫箱內(nèi)部的溫度控制來實現(xiàn)的，對恒溫箱主要要求可概括為：,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,點溫度的穩(wěn)定性，即測量恒溫箱內(nèi)部任意一點的溫度，其精度一般應(yīng)保持在0.10.5 。溫度場的均勻性，要求恒溫箱內(nèi)部色譜柱的上、下端及沿柱（不單是一根柱）任意橫斷面平均溫度的差值不超過1 。 恒溫范圍可以調(diào)節(jié)。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,絕熱性能好，從起動到穩(wěn)定點的時間要短。要有足夠的可用恒溫空間，供裝色譜柱之用。 目前在色譜儀中一般通過提供電流的方式來給恒溫箱加熱，用空氣浴來進(jìn)行熱交換。溫度的調(diào)節(jié)與穩(wěn)定用溫度控制器來實現(xiàn)。,,,,第二節(jié)

21、 氣相色譜儀,,溫度控制器主要有三種形式：（1）開關(guān)式。（2）比例調(diào)節(jié)器式。（3）三作用調(diào)節(jié)器式。 目前用得較多的是比例式調(diào)節(jié)器。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,四、程序升溫氣相色譜法 氣相色譜儀的溫度操作（或控制）有恒溫（或定溫）和程序升溫兩種方式。恒溫是在整個工作過程中始終把溫度控制在一個設(shè)定范圍內(nèi)。對于樣品中各組分的沸點分布范圍較窄時，用恒溫操作，可以得到較好分離結(jié)果。,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,在樣品中各組分的沸點相差較大時，一般在沸點分布范圍大于80 100 時，采用恒溫，分離效果往往就不太理想，此時必須使用程序升溫。程序升溫是一般恒溫色譜法的一種邏輯推廣，在

22、一臺性能較為完善的氣相色譜儀中，都具有程序升溫裝置。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,（一）恒溫控制系統(tǒng) 是一種閉環(huán)負(fù)反饋自動控制系統(tǒng)。由恒溫控制電路、恒溫箱及測溫、補(bǔ)償?shù)拳h(huán)節(jié)構(gòu)成。電路形式多樣，但反饋原理類似。屬于連續(xù)溫度控制的方法，控溫精度比斷續(xù)式溫度控制高得多，因此色譜儀中大都采用此控溫方式。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,（二）程序升溫控制系統(tǒng) 程序升溫（temperature programmer）就是使色譜柱的溫度在分離的過程中按照預(yù)定的程序逐步增加。其目的是使樣品中每個組分都在最佳的溫度條件下流出色譜柱，以保持較好的峰形。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,常用的程序升溫方式有兩種：線性程序

23、（單階線性升溫）和非線性程序（多階線性升溫）。1.線性程序： 即柱溫T隨時間成比例地升高?？杀硎緸門=T0rT，式中T0為初溫， ；t表示時間，min；r代表升溫速度， /min。,,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,2.非線性程序 （1）線性恒溫：適于高沸點組分較多的樣品的分離。 （2）恒溫線性：適于低沸點組分較多的樣品的分離。 （3）恒溫線性恒溫：適于組分沸點范圍很寬的樣品。 （4）多種升溫速度。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,,t1,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,,,終止溫度,3.程序升溫控制方式 程序升溫控制方式最常見的有機(jī)電式與電子式兩種，而以電子式最常用。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,（1）機(jī)

24、電式：機(jī)電式程序升溫控制器通過振蕩器和環(huán)形脈沖分配器控制步進(jìn)電機(jī)，使它按程序控制單元所設(shè)置的時間線性地改變變阻器的阻值，將變阻器的阻值作為此調(diào)節(jié)器式溫度控制器的設(shè)定電阻，就可以達(dá)到程序升溫的目的。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,（2）電子式：由溫度定值器和溫度控制器構(gòu)成。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,4程序升溫操作中應(yīng)注意的問題（1）升溫方式：主要根據(jù)樣品的性質(zhì)決定。（2）起始溫度：主要根據(jù)樣品中沸點最低組分的沸點決定，在其附近或稍低一點。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,（3）升溫速度：升溫的快慢會影響到分離效率和分析時間，可視具體樣品性質(zhì)而定。對于內(nèi)徑為3mm6mm，長2m3m的填充柱，升溫速度

25、r一般可取3 /min8 /min，而對毛細(xì)管柱，一般選取0.5 /min2 /min為宜。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,（4）終止溫度：取決于固定液的最高使用溫度及高沸點組分的沸點?？梢砸云渲休^低的溫度為依據(jù)來確定終止溫度。,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,檢測器（detector）就是將樣品組分的濃度或質(zhì)量（含量）轉(zhuǎn)換為電信號、并進(jìn)行信號處理的一種傳感裝置。色譜儀除分離部分外，另一個十分重要的部分就是檢測器。檢測器性能的好壞將直接影響到色譜儀器最終分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,五、氣相色譜儀常用檢測器,,（一）氣相色譜儀檢測器分類 按照檢測器的輸出信號與物質(zhì)含量的關(guān)系可以將氣相色譜

26、儀常用檢測器分為兩大類，一類是積分型的檢測器，另一類是微分型的檢測器。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,1.積分型檢測器 積分型檢測器所給出的響應(yīng)與色譜柱流出物的總量成正比，記錄儀記錄下來的色譜圖是一種階梯狀曲線。每一個階梯表示一種物質(zhì)從色譜柱中分離出來，而階梯的垂直高度則與該物質(zhì)的總量成比例。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,2.微分型檢測器 微分型檢測器所給出的響應(yīng)與已分離組分在載氣中的濃度或質(zhì)量流速有關(guān)，記錄儀記錄下來的色譜圖就是常用的具一個個峰形的曲線，每一個峰代表一種物質(zhì)的出現(xiàn)，峰與基線所包圍的面積與樣品組分的含量成比例。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,微分型檢測器又分為濃度檢測器（第一類）

27、和質(zhì)量流速檢測器（第二類）兩類。（1）濃度型檢測器的輸出與已分離的組分在載氣中的濃度成比例。色譜流出曲線上的每一點都對應(yīng)于該瞬間組分在載氣中的濃度。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,假定用某種濃度型檢測器測定某一樣品，其色譜圖如圖5-11所示。峰a為某組分的響應(yīng)曲線。峰面積為A，組分全部質(zhì)量為M，Xa表示該組分的瞬時濃度，系統(tǒng)工作在線性范圍之內(nèi)，即K1為一常數(shù)。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,則檢測器的響應(yīng)為： R1 = K1Xa （5-1）K1為比例系數(shù)。而 Xa = dma/（dma+dmc） = Va/（Va+Vc） （5-2）式中dma、dmc分別

28、為dt間期流過檢測器的組分和載氣的質(zhì)量，Va、Vc分別為相應(yīng)質(zhì)量流速。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,所以峰a面積A1為：,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,（2）質(zhì)量流速檢測器的輸出信號與已分離組分流過檢測器的質(zhì)量流速（單位時間內(nèi)通過的組分質(zhì)量）成比例。色譜峰上的每一點都對應(yīng)于分離物質(zhì)該瞬時的質(zhì)量流速，系統(tǒng)工作在線性范圍之內(nèi)，即K2為一常數(shù)。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,則檢測器的響應(yīng)為： 式中K2為比例系數(shù)。同樣可得此時峰a面積A2： 由此看出A2與M成比例而與載氣流速無關(guān)。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,（二）對氣相色譜儀檢測器的要求及綜合技術(shù)指標(biāo)1.靈敏度高。2.最小檢測量愈低愈好，

29、以適應(yīng)痕量分析的要求。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,所謂最小檢測量是指檢測器能確切反應(yīng)的物質(zhì)的最低含量（指能產(chǎn)生二倍于噪聲信號的響應(yīng)時，單位時間檢測器的樣品量，或單位體積載氣所含樣品量）。即：,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,3.線性范圍要寬。4.噪音要低、漂移要小。5.選擇性問題。6.響應(yīng)時間要快。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,（三）氣相色譜儀常用檢測器1.熱導(dǎo)檢測器 熱導(dǎo)檢測器（TCD，thermal conductivity detector）由熱導(dǎo)池、測量橋路、熱敏元件、穩(wěn)壓電路、信號衰減及基線調(diào)節(jié)等部分組成，具有結(jié)構(gòu)簡單，線性、穩(wěn)定性好，適用面廣等特點，還可與其他檢測器聯(lián)用。,,,,第二

30、節(jié) 氣相色譜儀,,熱導(dǎo)檢測器最基本的特點是載氣和樣品各組分具有不同的導(dǎo)熱系數(shù)。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,熱導(dǎo)檢測器基本上對所有的組分都敏感，但由于樣品量很小，樣品組分變化帶來的溫度變化必然很小，同時電橋電壓也不可能太大（20V50V）。因而熱導(dǎo)檢測器的靈敏度（10000mVmL/mg)不太高。最小檢測量一般在10-6g至10-8g左右，線性范圍104。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,2.氫火焰離子化檢測器（flame ioniza- tion detector，F(xiàn)ID） 簡稱氫焰檢測器，是電離檢測器的一種，屬第二類檢測器。主要基本構(gòu)成環(huán)節(jié)是：電極、電離室、離子源、極化電源、本底電流補(bǔ)償環(huán)節(jié)以

31、及靜電計、記錄儀等。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,氫焰檢測器輸出信號是電流，輸出阻抗很大，其后所接的微電流放大器必須要有更高的輸入阻抗，信號才能正常傳遞下去?？刹捎媒^緣柵場效應(yīng)管作為輸入級，同時采用較高放大倍數(shù)的負(fù)反饋放大器，以保證微電流放大器具有輸入阻抗高，穩(wěn)定性好等特點。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,氫焰檢測器是一種選擇性檢測器，對含碳有機(jī)物較敏感。由于氫焰檢測器是通過電離的方式檢測離子流，其靈敏度高，約在10-10g/s10-12g/s。最小檢測量可達(dá)10-11g/s10-13g/s。線性范圍廣（51065107）。穩(wěn)定性好，響應(yīng)時間快。,,,,第二節(jié) 氣相色

32、譜儀,,3.電子捕獲檢測器（electron capture detector，ECD） 可以分為兩類，一類是由一個陰極（內(nèi)裝圓筒狀放射源3H或63Ni的池體)和一個不銹鋼陽極組成。稱之為放射性電子捕獲檢測器。另一類是非放射性電子捕獲檢測器。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,載氣受低能射線照射后發(fā)生電離，產(chǎn)生正離子和低能量的電子。如 電負(fù)性組分即是具有親負(fù)性離子的中性分子，或?qū)﹄娮泳哂休^大親和力易捕獲電子的物質(zhì)。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,電子捕獲檢測器是一種濃度型檢測器，它具有選擇性，只對具有電負(fù)性的組分有響應(yīng)，且其靈敏度隨電負(fù)性的增加而增加。其靈敏度最高，最小檢

33、測量可達(dá)10-13g/s10-14g/s。其線性范圍較窄。在做痕量分析時常用電子捕獲檢測器。,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,六、氣相色譜儀的操作 在氣相色譜儀的操作過程中，要特別注意柱參數(shù)的合理選擇。它對色譜的分離效果會產(chǎn)生很大的影響，可以認(rèn)為柱參數(shù)就是有關(guān)色譜操作的所有參數(shù)的統(tǒng)稱。,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,1.色譜柱和填料（固定相） 所有新柱子，使用前必須經(jīng)老化處理。老化處理就是在比操作溫度高200C的條件下，將色譜柱“烘烤”12h以上。目的：有助于除去填料中的污染物和減輕對檢測器的污染。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,2.柱長 選擇柱長的依據(jù)是分離度和分離速度。增加柱長可提高分離度，但分析時間

34、也會加長?；疽笫牵诒ＷC樣品各個組分完善分離的條件下，盡量縮短柱長，以提高分析速度。填充柱則以1m3m為宜。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,3.載氣流速 以兼顧靈敏度和分辨率為出發(fā)點，外徑為3.175mm的柱子，載氣流速可在1530ml/min的范圍內(nèi)選擇，外徑為6.35mm的柱子，可在40100ml/min范圍內(nèi)選擇流速。 載氣流速主要會影響樣品的保留時間和峰高，必須讓它保持恒定。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,4.進(jìn)樣器和檢測器的溫度 要求大約比恒溫箱最高溫度高出25 50 ，主要是為了防止樣品組分冷凝。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,5.恒溫操作 恒溫操作的溫度一般要求比樣品最高沸點低40

35、 左右，也可以取樣品組分的平均沸點或稍低一點的溫度。也可視樣品不同而上下調(diào)節(jié)。一般的原則是溫度每上升1 ，保留時間縮短5。溫度每上升30 ，分配系數(shù)下降一半，分析速度加快一倍。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,6.程序操作 在樣品沸點分布范圍較大，用恒溫操作的方法很難完善地分離樣品時，可用程序升溫技術(shù)，保證在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)流出低沸點和高沸點相差甚遠(yuǎn)的樣品組分來。具體操作中可根據(jù)組分沸點分布情況選擇適當(dāng)?shù)纳郎胤绞健?,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,7.進(jìn)樣 注射器進(jìn)樣最為常用。在進(jìn)樣時，注射器應(yīng)保持垂直于進(jìn)樣器隔膜，以保證重復(fù)性。進(jìn)樣時要穩(wěn)而快，以保證樣品完全氣化。,,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,8.初步分

36、析 色譜工作本身就是一個不斷改進(jìn)操作參數(shù)、改善分離的過程，通過對結(jié)果的初步分析，將有助于操作者修改和確定最佳的操作條件。這也是色譜工作過程中所必須作的工作。,,,第二節(jié) 氣相色譜儀,,高效液相色譜儀又稱高速液相色譜儀、高壓液相色譜儀等。依據(jù)分離的原理雖有吸附、分配、離子交換、凝膠色譜等不同的類型。主要由溶濟(jì)輸送系統(tǒng)、 進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)(色譜柱)、溫度控制系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理與記錄系統(tǒng)等構(gòu)成。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,一、溶劑輸送系統(tǒng),二、進(jìn)樣系統(tǒng),三、分離系統(tǒng)和溫度控制系統(tǒng),四、高效液相色譜儀用檢測

37、器,五、操作條件的選擇,目 錄,一、溶劑輸送系統(tǒng) 又稱輸液系統(tǒng)，對其主要要求是能有效的容納所要求的溶劑，并將溶劑輸送到系統(tǒng)的各個有關(guān)部位。它應(yīng)具備寬的流速范圍和入口壓力范圍，并能適用于所有的溶劑。這里的溶劑就是高效液相色譜儀的流動相。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,該系統(tǒng)主要由液源、脫氣裝置、高壓輸液泵、流量控制器及梯度洗脫裝置等構(gòu)成。（一）液源、脫氣裝置 色譜柱極易被微小的顆粒雜質(zhì)堵塞，使操作壓力速升高而無法使用。 氣體可能形成氣泡影響工作。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,（二）高壓輸液泵 是高效液相色 譜儀最重要的部件 之一，它將洗脫液 在高壓下連續(xù)不斷 地送入分離柱以完 成色譜分離過程

38、。其性能對分離及檢測均有十分明顯的影響。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,對高壓輸液泵的要求：（1）能產(chǎn)生較高的壓力推動流動相，且壓力要平穩(wěn)，脈動小。（2）能提供無脈動恒定流量。（3）輸送流動相的流量能在較大范圍內(nèi)連續(xù)調(diào)節(jié)。（4）更換流動相方便。（5）便于實現(xiàn)程序控制。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,高效液相色譜儀中常用的高壓泵大致可分為兩類，一類是恒壓泵，常用的有直接氣動泵和氣動放大泵等。另一類是恒流泵，如機(jī)械注射泵、機(jī)械往復(fù)式柱塞泵都屬于恒流泵。目前最常用的高壓泵是機(jī)械往復(fù)式柱塞泵。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,出 口,入 口,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

39、,,,,,,,,,,,,,,,,,單 向 閥,液缸,圖5-17 機(jī)械往復(fù)式柱塞泵示意圖,,,,,,,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,注意：機(jī)械往復(fù)式柱塞泵的工作過程是抽液和排液交替進(jìn)行，因此其輸出的流量必然有脈動?？朔@個問題常采用下述方法。（1）可通過采用多頭泵交替工作。（2）設(shè)置壓力緩沖器。（3）采用更合理的驅(qū)動凸輪幾何形狀設(shè)計方案。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,機(jī)械往復(fù)式柱塞泵通過調(diào)整凸輪的驅(qū)動電壓來自動控制流量。在工作過程中，如果有管道堵塞或流量過大等原因造成壓力過高而不能監(jiān)測出來，就可能造成儀器有關(guān)部件的損壞。由此可見，在自動化程度越高的儀器中，越應(yīng)該有完善的監(jiān)測保護(hù)裝置，以提高

40、儀器使用的安全性。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,（三）梯度洗脫及洗脫方式 控制高效液相色譜儀流動相的有常液洗脫（isocratic elution）和梯度洗脫兩種方式。梯度洗脫與程序升溫具有相似的作用及目的。常液洗脫是在樣品分離過程中從始至終采用相同的流動相和相同的流量，在樣品各組分K值分布范圍不是很寬時，可得到較好的分離效果。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,對于一些復(fù)雜樣品各組分的 K值對任意一種流動相都分布很寬時，分配比小的先出色譜柱，但往往分離不好，甚至不能完全分離。而最后出來的若干組分因時間太長，峰形擴(kuò)散，致使檢測器的靈敏度顯著降低，甚至無法檢出。解決此問題可用下列措施：,第三節(jié)

41、 高相液相色譜儀,,,,,,,圖5-18 復(fù)雜樣品的不良分離,,,,重疊峰,拖尾峰,t (min),檢測器的響應(yīng) R,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,1.程序升溫;,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,2.程序變流速;,3.組合柱;,4.梯度洗脫。,梯度洗脫是在色譜的分離過程中，把兩種或更多的不同極性互溶洗脫液隨時間按某種變化的比例混合，使流入色譜柱的洗脫液組成作連續(xù)的改變。其目的是讓樣品每個組分都在最佳分配系數(shù)的條件下分離出來，以獲得較好的峰形。 梯度洗脫分為內(nèi)梯度洗脫（高壓）和外梯度洗脫（低壓）兩類。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,,,,,,,,,,,,圖5-

42、19 梯度洗脫裝置原理示意圖,(a)外梯度洗脫,(b)內(nèi)梯度洗脫,（三）流量控制器 高壓的流動相流經(jīng)色譜柱時，與固定相產(chǎn)生相互作用，固定相會形成一個與流動相流動方向相反的作用力，即構(gòu)成一個與流向相反的壓力，稱之為柱反壓，它將阻礙流動相的正常流動。流量控制器是為消除色譜柱反壓過高對分離造成的不良影響而設(shè)計的。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,二、進(jìn)樣系統(tǒng) 高效液相色譜儀的進(jìn)樣系統(tǒng)，要求能將樣品有效地注入到系統(tǒng)里去，而不破壞在色譜柱和檢測器里所建立的流量平衡。理想的進(jìn)樣系統(tǒng)應(yīng)能給系統(tǒng)帶來最低限度的死體積。否則，柱效率將受到損失。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,進(jìn)樣裝置有注射器和多通進(jìn)樣閥。為適應(yīng)高

43、壓條件下進(jìn)樣，進(jìn)樣方式又有停流動相和不停流動相進(jìn)樣兩種方式。（一）注射器進(jìn)樣 高效液相色譜儀進(jìn)樣量一般都比較小，因而注射器進(jìn)樣常采用微量注射器。可分為直接注射器進(jìn)樣與隔斷式注射器進(jìn)樣兩種。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,直接注射器進(jìn)樣與氣相色譜儀相類似。進(jìn)樣時注射器直接插入色譜柱上端的進(jìn)樣器隔膜，將樣品注入到色譜柱中固定相的頂端。其結(jié)構(gòu)簡單，使用方便，可在不停流情況下進(jìn)樣。但對隔膜、彈性墊片要求耐壓高，一般在壓力低于14.71MPa時可以使用。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,為了使注射器進(jìn)樣適應(yīng)更高壓力，可采用隔斷式進(jìn)樣器。它在不進(jìn)樣時用隔斷器將進(jìn)樣系統(tǒng)與流

44、動相隔斷開。進(jìn)樣時將隔斷器提起，讓進(jìn)樣系統(tǒng)與流動相連通，同樣將注射器針頭插到色譜柱頂端進(jìn)樣，流動相帶著樣品進(jìn)入色譜柱，進(jìn)樣完畢馬上關(guān)閉隔斷器。工作壓力可達(dá)34.32MPa。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,（二）高壓進(jìn)樣閥（多通進(jìn)樣閥） 高壓進(jìn)樣閥的結(jié)構(gòu)與氣相色譜儀所用進(jìn)樣閥完全一樣。有四通、六通閥等。常用的也是旋轉(zhuǎn)式六通閥。但由于在高效液相色譜儀中是在高壓的條件下進(jìn)樣，因而對其承受高壓的能力和密封性要求更嚴(yán)格。它的工作壓力可達(dá)到19.61MPa。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,圖5-21 自動進(jìn)樣器,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,以上兩種方法均是在流動相保持流動的情況下進(jìn)樣，稱為不停流進(jìn)

45、樣。 為適應(yīng)更高的工作高壓，可采用停流進(jìn)樣，即在進(jìn)樣瞬間停止流動相流動，進(jìn)樣完畢后立即恢復(fù)流動相的流動。但要求進(jìn)樣器盡量保持原壓力，以利于進(jìn)樣完后壓力的迅速恢復(fù)。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,三、分離系統(tǒng)和溫度控制系統(tǒng) 分離系統(tǒng)包括色譜柱、填料（固定相）。它承擔(dān)著樣品的分離，是色譜儀最重要的部件之一。色譜柱的高效率是現(xiàn)代高效液相色譜儀的一個顯著特點。為達(dá)到好的分離效果，色譜柱的選擇尤為重要。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,（一）柱材料、幾何形狀和尺寸1.材料 色譜柱管的材料有不銹鋼、厚壁玻璃和石英。工作壓力超過3.92MPa時，必須用不銹鋼管柱。2.形狀 柱管的形狀有直管柱和螺旋柱?，F(xiàn)在基本

46、上都采用直管柱。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,3.尺寸 柱長和內(nèi)徑是由實際需要的分離度、壓力降、分析時間以及樣品量的大小綜合決定的。 要求柱管內(nèi)壁經(jīng)拋光處理，內(nèi)徑上下一致，以免引起流量變化。裝柱時將柱內(nèi)固定相上、下面與密封過濾片接觸面頂緊，以免出現(xiàn)柱頭下陷，影響柱效。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

47、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,圖5-22 色譜柱 1不銹鋼管柱 2，7螺帽 3，9壓圈 4，8密封圈 5不銹鋼過濾片 接頭 10細(xì)不銹鋼管,（二）固定相和流動相1.液固吸附色譜法 固定相都是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，所用的吸附劑大部分以硅膠為基體。此外也有用氧化鋁、分子篩等的。從結(jié)構(gòu)上看，吸附劑可以分為全多孔型及表面多孔型（或稱薄殼型）兩類。實際都是一些顆粒。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,柱管的填充主要根據(jù)固定相的粒度大小分別采用干裝法和濕裝法。裝填時要注意讓固定相顆粒保持適當(dāng)?shù)乃删o程度。 干裝法適用于

48、粒度20m的固定相顆粒的填充。 顆粒20m用濕裝法（漿裝法或勻漿法）。有等比重、非等比重兩種。常用等比重勻漿法。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,由于可用作流動相的溶劑很多，不同溶劑的性質(zhì)（包括極性、濃度、pH值、粘度等）均有較大的差異。因此，適當(dāng)?shù)剡x擇流動相，就可使樣品各組分在兩相間分配的差異有較大的變化，從而使分離效果得到很大改善。這也是液相色譜法比氣相色譜法優(yōu)越的條件之一。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,正確選擇流動相的基本原則：穩(wěn)定性。主要是指柱效率或柱子的保留性質(zhì)要長期不變。適應(yīng)所采用的檢測器。能溶解待分離樣品。清洗方便。粘度要小一些。 重復(fù)性差是液固吸附色譜法的重大缺陷。,第三節(jié)

49、 高相液相色譜儀,,,,,2.液液分配色譜法 液液分配色譜法與氣液分配色譜法一樣，也是在擔(dān)體（載體）上涂敷一層固定液作為固定相。有可控表面多孔載體、全多孔型擔(dān)體等，如硅藻土、表面蝕刻微球等可作擔(dān)體。有正向分離和反向分離兩種分離形式。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,正向分離是用極性固定液和非極性流動相來分析極性化合物的色譜系統(tǒng)。 反向分離是指用非極性固定液和極性流動相來分析非極性化合物的色譜系統(tǒng)，非極性的樣品與固定液有很好的相互作用，它的保留就比極性強(qiáng)。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,對流動相的要求及選擇：流動相盡可能地與固定相不溶。粘度應(yīng)盡可能小。適應(yīng)所用檢測器的性能。對樣品應(yīng)有選擇性。即

50、樣品中各組分的值（選擇性系數(shù)，兩個組分的相對校正保留時間之比，=tR2/tR1）不能為1。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,（三）溫度控制系統(tǒng) 由于高效液相色譜儀的操作約有70以上可以在室溫的條件下完成，因而對溫度的要求不象氣相色譜儀那樣嚴(yán)格。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,四、高效液相色譜儀用檢測器（一）高效液相色譜檢測器的基本要求和分類 對高效液相色譜儀檢測器的特性要求與氣相色譜基本是一致的，但有兩個問題有必要說明。1.對流動相的適應(yīng)。2.峰擴(kuò)展的問題。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,目前常用的檢測器有兩大類，一類是保持溶質(zhì)在溶劑中，即流動相加已分離組分直接進(jìn)入檢測器檢測，即對洗脫液和組

51、分總體的物性（如折光率、電導(dǎo)率等）進(jìn)行檢測。稱為總體性檢測器。另一類是把從色譜柱流出物的溶質(zhì)和溶劑分開，讓溶質(zhì)單獨進(jìn)入檢測器，稱為溶質(zhì)性檢測器。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,（二）常用檢測器 1.紫外及可見光檢測器 由光源、光路系統(tǒng)、測量池、參比池、光電接收元件及電子線路和記錄儀構(gòu)成。其具體結(jié)構(gòu)基本與紫外-可見分光光度計相同。遵循朗伯-比爾定律。要注意它的樣品池做成細(xì)長的流動型，如Z型、H型。便于動態(tài)實時檢測分離組分。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,圖5-23 紫外檢測器,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,圖5-24 紫外分光檢測器,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,第三節(jié) 高相液相色譜儀,

52、,,,,檢測器可設(shè)計為單波長紫外檢測器與紫外及可見分光檢測器兩類。一般單波長紫外檢測器常采用較易獲得的兩種波長254nm及280nm的單色光。紫外分光檢測器的工作波長可通過調(diào)節(jié)棱鏡或光柵來加以選擇，因而可將檢測器的工作波長選擇在吸收系數(shù)較大波長上，以提高檢測靈敏度。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,檢測器與分光光度計的主要差異有：樣品檢測池體積只有5l8l，不致于影響峰形，并做成流動式。檢測靈敏度達(dá)0.050.01O.D.的滿度值（光度計為1.00.5O.D.）。為提高靈敏度，樣品池做得細(xì)長。對分光后光的單色性、波長精度要求不高，光譜寬度可在10nm，波長精度可以低至2nm。,第三節(jié) 高相液相

53、色譜儀,,,,,紫外及可見光檢測器是目前高效液相色譜儀中最常用的檢測器。它具有靈敏度和檢測精度高、線性范圍寬、受流量和溫度波動的影響小、適用于梯度洗脫及不破壞樣品等特點，是一種選擇性檢測器，只能用于在工作波長范圍內(nèi)有吸收的樣品。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,2.示差折光檢測器（RID） 主要由光源系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、接收、放大、記錄系統(tǒng)構(gòu)成。由于各種物質(zhì)具有不同的折射率，一種混合物的折射率又是各組分折射率的平均值，而溶劑和樣品各組分折射率存在一定差異，所以通過檢測折射率的變化，就可以達(dá)到分析樣品各組分的目的。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,接照作用原理可將示差折光檢測器分為反射式和偏轉(zhuǎn)式兩種

54、。（1）反射式示差折光檢測器： 根據(jù)菲涅爾反射原理，相分界面上反射光的強(qiáng)度取決于入射角和相分界面上兩種介質(zhì)的折射率，折射光的強(qiáng)度同樣也受入射角和相分界面上兩種介質(zhì)的折射率的影響。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,（2）偏轉(zhuǎn)式示差折光檢測器： 根據(jù)折射定律， n1sin1 = n2sin2 （59） 折射角2取決于入射角1和相分界面上兩種介質(zhì)的折射率n1、n2。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,反射式液槽體積小，在35l，線性范圍小，為了避免出現(xiàn)全反射現(xiàn)象，需根據(jù)洗脫液和樣品組分的折射率更換入射方的棱鏡。偏轉(zhuǎn)式的線性

55、范圍較寬，不需換液槽，穩(wěn)定性好，但液槽體積大。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,示差折光檢測器是一種非選擇性檢測器?；旧蠈λ斜粶y對象均有響應(yīng)，且不破壞被測物質(zhì)的性質(zhì)。但靈敏度較低，不適于做痕量分析。也不適于梯度洗脫。因樣品-洗脫液的折射率將隨洗脫液組成變化而變化，從而產(chǎn)生干擾信號。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,3.熒光檢測器 某些物質(zhì)在吸收了一定的光能后，會發(fā)射出頻率較低、波長較長的熒光。熒光檢測器就是用紫外光（稱為激發(fā)光）照射樣品，通過光電倍增管檢測樣品所發(fā)出的熒光（稱為發(fā)射光），記錄出色譜圖的。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,熒光檢測器根據(jù)單色器的不同，分為多波長熒光檢測器（由多

56、個濾光片構(gòu)成單色器）和熒光分光檢測器（由光柵構(gòu)成單色器）。熒光檢測器在選擇性和靈敏度方面優(yōu)于紫外檢測器。但它檢測的樣品必須能夠被激發(fā)出熒光，也是一種選擇性檢測器。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,此外，二極管陣列檢測器、氫火焰離子化檢測器、微量吸附熱檢測器等檢測器也是高效液相色譜儀常用的檢測器。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,圖5-28 二極管陣列檢測器及其譜圖,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,五、操作條件的選擇 操作條件的選擇除前面介紹的色譜柱參數(shù)、流動相及固定相的選擇外，還包括以下幾點。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,1.流動相的流量 提高流量可縮短分析時間，但會降低分離度，增加柱壓。應(yīng)根

57、據(jù)樣品的性質(zhì)、樣品量大小、分離目的、選擇的固定相和流動相以及色譜柱的尺寸等因素綜合考慮。分析時，一般選10ml/min以下。制備時，流量可選大一些。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,2.柱溫 一般在室溫下進(jìn)行。據(jù)統(tǒng)計，約有70以上的分析是在室溫下進(jìn)行的。當(dāng)然提高溫度可提高分析速度，但也會降低分離度。因此在高效液相色譜儀中，一般均通過流動相的選擇而不是柱溫的調(diào)整來提高分離能力。高溫對固定相的影響也應(yīng)充分考慮。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,3.壓力 高效液相色譜儀分析速度提高的原因之一是采用了高壓。一般可在3.4334.32MPa之間選取，最高不能超過49.03MPa。高壓雖可增加分離速度，但

58、會帶來密封、固定相的強(qiáng)度等問題。除高壓技術(shù)外，也可以通過采用高效固定相，縮短柱長的努力來提高分析速度。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,,4.進(jìn)樣量 高效液相色譜儀主要追求的是分析速度及分離能力，常只允許極小的進(jìn)樣量，這將有利于這兩項指標(biāo)。進(jìn)樣量一般在1g25g之間。一般隨著樣品體積的增加，柱效率會降低。,第三節(jié) 高相液相色譜儀,,,,第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),,一、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),二、微機(jī)在色譜儀中的功能,目 錄,一、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 色譜分析的目的是得到混合物中各組分的定性與定量結(jié)果，而數(shù)據(jù)處理的最終目的就是給出這些結(jié)果。最基本的方式是繪出色譜圖。在計算機(jī)介入后，還可提供一些如保留時間、峰高、

59、峰面積、成份比率等文字信息。,,,,第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),1.記錄儀 是目前用得比較廣泛的一種裝置。它通過將樣品信號定量轉(zhuǎn)換為電壓信號，推動計錄筆記錄出色譜圖。但保留時間、峰高、峰面積等參數(shù)需要人工的方式來處理。使用不是特別方便，分析結(jié)果也不是很準(zhǔn)確。,,,,第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),,2.積分儀 積分儀主要有兩種：模擬和數(shù)字積分儀。其主要功能是求色譜圖上各峰的峰面積。在色譜分析時，被分析物的濃度和含量通常與峰面積存在線性關(guān)系。積分儀可以更準(zhǔn)確地計算出色譜峰面積，為定量分析打下良好的基礎(chǔ)。,,,,第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),,3.數(shù)據(jù)處理站 微機(jī)的發(fā)展使積分儀已漸被色譜數(shù)據(jù)處理站

60、（chromatographic data system）取代。它包括硬件和軟件兩個部分，硬件部分除普通或?qū)Ｓ玫奈C(jī)外，還通過接口電路將色譜儀與微機(jī)聯(lián)為一體。軟件部分主要有系統(tǒng)、控制、采樣軟件和各種數(shù)據(jù)處理軟件包。除進(jìn)行色譜數(shù)據(jù)處理外，還參與儀器的自動控制。,,,,第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),,圖5-29 色譜界面,,,第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),,,第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),,,,二、微機(jī)在色譜儀中的功能1.分析信息處理 峰檢測方式有：峰處理方式：波形處理、基線校正、不完全分離成分的分離、拖尾峰上峰的分析、線性化； 計算峰高；峰面積積分。 斜率檢測，電平檢測，保留時間測定。,,,第四

61、節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),,2.數(shù)據(jù)演算功能 可以進(jìn)行總和校正、成分比率、移動平均，線性多項式演算等數(shù)據(jù)計算。 3.程序控制功能 可以實現(xiàn)程序升溫、程序變流速、程序變壓、閥門切換、流路切換、衰減程序、大氣壓平衡等一系列程序操作。,,,,第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),,4.存貯器的保存功能 內(nèi)部電池支撐內(nèi)存保存，磁盤的輸入、輸出。 5.操作條件自動控制功能 可以按照預(yù)先的設(shè)定，自動控制色譜工作過程中的操作條件。6.自動標(biāo)定功能 自動標(biāo)定保留時間、死時間、峰高等基本參數(shù)。,,,,第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),,7.異常檢出及顯示功能 可檢測出各種異常工作情況，顯示信息，報警并自動關(guān)閉儀器。 （1）

62、分析器異常：保留時間、基線異常、重復(fù)性不良、不能校準(zhǔn)、校正系數(shù)異常、氫焰滅火、載氣壓力下降、標(biāo)準(zhǔn)氣斷、過壓和溫度過高等。（2）信息處理器自己診斷。（3）濃度上限監(jiān)視。,,,,第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),,8.外部輸出功能（1）記錄器輸出色譜圖、棒圖、趨勢圖等。（2）數(shù)據(jù)計算機(jī)輸出、打印記錄。（3）報警輸出、自動停機(jī)。,,,,第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),,計算機(jī)化的色譜儀有如下優(yōu)點：1.能較長期地連續(xù)運(yùn)行。2.儀器的主要技術(shù)指標(biāo)都會得到提高。3.操作方便。4.能自動進(jìn)行標(biāo)定。5.能自動檢查工作狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)故障，指示故障源和發(fā)出報警信號，停機(jī)。6.自動校正諸如環(huán)境溫度、壓力等變化引起的誤差。,,,第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),,,,根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)膬上嗪推渌僮鲄?shù),多組分混合物樣品在色譜系統(tǒng)中可以實現(xiàn)分析。 氣相色譜儀利用載氣作為流動相，具有高分辨率、高速度、高靈敏度及選擇性好等優(yōu)點，但要求樣品也必須為氣態(tài)。,本章內(nèi)容小結(jié),高效液相色譜儀用溶劑作為流動相，需要的樣品是液態(tài)的，溶劑的選擇范圍也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了載氣，操作基本上可以在室溫的條件下完成，比較適合自然狀態(tài)下大多數(shù)樣品的分析。,本章內(nèi)容小結(jié),,,結(jié)束!,,