負(fù)染技術(shù)、掃描電鏡樣品制備技術(shù).ppt

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負(fù)染技術(shù)陰性反差染色 染色劑不被樣品吸收而是沉淀到樣品四周 用于細(xì)菌 病毒 噬菌體 亞細(xì)胞成份的檢測 一 染色液的特點1 不和樣品發(fā)生反應(yīng)2 可保護(hù)樣品結(jié)構(gòu)3 可提供足夠高的反差4 本身顆粒體積很小2 4 磷鎢酸 pH6 4 7 0 2 3 醋酸鈾 pH4 2 二 操作方法待檢生物組織懸液滴于載網(wǎng) 靜置5 10min用濾紙吸去載網(wǎng)邊緣多余液體載網(wǎng)未完全干滴染色液 染色3 5min用濾紙吸去載網(wǎng)邊緣多余液體 自然干燥 鏡檢 三 影響因素1 被檢樣品純度和濃度2 染色液pH3 操作技巧 掃描電鏡生物樣品制備技術(shù)含水量少的組織 骨骼 牙齒 毛發(fā)等 預(yù)處理 導(dǎo)電含水量多的組織 大多數(shù)組織 預(yù)處理 干燥 導(dǎo)電一樣品預(yù)處理 一 常規(guī)樣品1 取材5 8mm 保護(hù)觀察面2 清洗漂洗 沖洗 擦洗 快 3 固定 脫水同超薄切片 二 游離細(xì)胞收集所需細(xì)胞適量0 1 多聚賴氨酸PBS洗滌 1000rpm5min 棄上清4 6mm玻片 室溫5 10min滴入2 4ml0 5 戊二醛 4oC0 5h吸去多余液體 成膜PBS洗滌 1000rpm5min 棄上清 制成懸液細(xì)胞懸液滴于玻片 5 30min濾紙吸去多余液體1 戊二醛 4oC1hPBS漂洗 1 OsO4 4oC1h 梯度酒精脫水 膜未干 三 欲看剖面的結(jié)構(gòu) 實質(zhì)性臟器的斷面或細(xì)胞內(nèi)部用 割斷法 暴露觀察部位1 常用的割斷法二甲基亞砜 DMSO 割斷法環(huán)氧樹脂割斷法2 冷凍割斷的操作TF 1冷凍割斷儀簡易割斷器注入液氮固化包埋割斷溶化沖洗 3 標(biāo)本制作法取材 1 1 5mm 前固定 1 OsO4 4oC1h 浸洗 0 1MPBS 10min 3次 DMSO浸泡 12 5 25 50 各30min 冷凍割斷后固定 0 1 OsO4 4oC30min 雙蒸水洗滌30min 2 單寧酸15min 2次 雙蒸水洗滌30min1 OsO4 4oC30min 雙蒸水洗滌30min梯度酒精脫水 二生物樣品的干燥除去脫水劑使組織真正干燥 克服表面張力的影響 保存樣品表面微細(xì)結(jié)構(gòu)1 自然干燥法無法避免表面張力的影響 僅用于含水較少的樣品2 冷凍干燥法樣品以液氮快速冷凍移至真空冰升華為汽費時低溫?fù)p傷 3 坎烯干燥法升華介質(zhì) 坎烯45oC以下為固態(tài) 室溫中可升華標(biāo)本預(yù)處理1 1環(huán)氧丙烷 坎烯混合液15min純坎烯45oC20min室溫 坎烯變?yōu)楣腆w 放入真空 升華4 乙腈干燥法標(biāo)本預(yù)處理50 70 80 90 100 乙腈溶液各20min 用乙醇配制 立即置入真空 乙腈及樣品凍結(jié) 升華 5 臨界點干燥法干燥效果最好 應(yīng)用最廣泛 原理物質(zhì)三相 固 液 氣 相互轉(zhuǎn)化 可單相存在 也可復(fù)相存在 臨界狀態(tài) 物質(zhì)在特定溫度 臨界溫度 時 表面張力系數(shù)為零 物質(zhì)不以液態(tài)存在 變成氣體 液態(tài)CO2臨界溫度 31 5oC 臨界壓力72 8kg cm2 樣品固定 脫水中間液 醋酸異戊酯 置換樣品置入預(yù)冷的樣品室注入液態(tài)CO2CO2置換臨界處理放氣取樣 方法 三生物樣品的導(dǎo)電 一 目的避免因樣品表面電荷的積累對二次電子成像的影響 二 方法1 金屬噴鍍法在真空噴鍍儀內(nèi)將金屬加熱 蒸發(fā) 噴鍍到樣品表面 100 200 金屬的選擇 顆粒大小不超過SEM分辨率 100 熔點低 易蒸發(fā) 機(jī)械穩(wěn)定性能好 是好的二次電子發(fā)射體金鉑金 鉑合金 2 離子濺射法 離子鍍膜法 優(yōu)點 熱輻射小 顆粒細(xì) 噴濺均勻 金屬消耗少3 導(dǎo)電染色法 組織導(dǎo)電技術(shù) TOT 利用金屬鹽 碘化甲 單寧酸 對生物體蛋白質(zhì) 脂肪的結(jié)合作用 掃描電鏡生物樣品制備的基本程序