電子顯微鏡使用方法.doc

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五、電鏡標(biāo)本制作方法 電鏡標(biāo)本用于觀察組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。掃描電鏡用于細(xì)胞表面的觀察，透射電鏡用于細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察?，F(xiàn)以透射電鏡標(biāo)本的制作為例作簡要介紹： (一)取材 標(biāo)本的新鮮程度要求高于光鏡標(biāo)本，組織塊小于lmm3。 (二)固定 常用的固定液有2．5％戊二醛磷酸緩沖液和1％鋨酸。這些液體穿透力較強(qiáng)，能穩(wěn)定和保存細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)。固定溫度應(yīng)控制在0～4℃，固定時(shí)間1~2小時(shí)。 (三)沖洗 沖洗液由0．2mol／L磷酸緩沖液(pH7.2)與雙蒸水等量混合配成。沖洗組織塊2次．間隔15分鐘。 (四)脫水 脫水劑多采用濃度遞增的酒精和丙酮，從50％ 70％ 90％酒精 1/2 90％酒精+1/2 90％丙酮混合液 90％丙酮(以上步驟均在0~4℃冰箱中進(jìn)行) 100％丙酮，間隔10~15分鐘。 (五)包埋 包埋劑為環(huán)氧樹脂618或812和固化劑十二碳烯基丁二酸酐(簡稱DD-SA)，加入適量增塑劑苯甲酸二丁酯(簡稱DDP)。為了使反應(yīng)速度增快，可加入加速劑2，4，6-三[(二甲氨基)甲基]苯酚(簡稱DMP-30)。 包埋劑配方： 環(huán)氧樹脂618或812 60％ DDSA 40％ DBP 3％ DMP-30 1％ 上述試劑依次加入，邊加邊攪拌，全部加完后再充分?jǐn)嚢?0～15分鐘，靜置于35~40℃溫箱內(nèi)排出氣泡。包埋前組織塊必須浸透，入無水丙酮加等體積包埋劑室溫3小時(shí)，純包埋劑37℃ 2小時(shí)。包埋時(shí)先將純包埋劑倒入膠囊或含硅膠的包埋槽內(nèi)，置入組織塊。包埋后在60C溫箱中烘2～3天后硬化成塊，即可剝?nèi)ツz囊或包埋槽。 (六)將組織塊修成塔形，尖端面積為0.2mm0.3mm左右，用超薄切片機(jī)切成50mm厚的超薄切片，再置于銅網(wǎng)上。 (七)染色 常用的染液有1~2％醋酸鈾和枸櫞酸鉛。醋酸鈾染色是在組織塊進(jìn)行脫水過程中進(jìn)行的，而枸櫞酸鉛染色則多用于片染。最后，將載有切片的銅網(wǎng)置于透射電鏡內(nèi)觀察和攝影。 由于電鏡電子束穿透能力的限制，必須把標(biāo)本切成厚度小于0.1um以下的薄片才適用，這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。 在透射電鏡的樣品制備方法中，超薄切片技術(shù)是最基本、最常用的制備技術(shù)。超薄切片的制作過程基本上和石蠟切片相似，需要經(jīng)過取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。 一 取材的基本要求 組織從生物活體取下以后，如果不立即進(jìn)行適當(dāng)處理，會由于細(xì)胞內(nèi)部各種酶的作用，出現(xiàn)細(xì)胞自溶現(xiàn)象。此外，還可能由于污染，微生物在組織內(nèi)繁殖使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)遭受破壞。因此，為了使細(xì)胞結(jié)構(gòu)盡可能保持生前狀態(tài)，必須做到快、小、準(zhǔn)、冷： (1)．動(dòng)作迅速，組織從活體取下后應(yīng)在最短時(shí)間內(nèi) (爭取在1分鐘內(nèi)) 投入2.5%戊二醛固定液。 (2)．所取組織的體積要小，一般不超過1mm1mm1mm。也可將組織修成1mm1mm2mm大小長條形。因?yàn)楣潭▌┑臐B透能力較弱，組織塊如果太大，塊的內(nèi)部將不能得到良好的固定。 (3)．機(jī)械損傷要小，解剖器械應(yīng)鋒利，操作宜輕，避免牽拉、挫傷與擠壓。 (4)．操作最好在低溫(0℃～4℃)下進(jìn)行，以降低酶的活性，防止細(xì)胞自溶。 (5)．取材部位要準(zhǔn)確。 取材方法：將取出的組織放在潔凈的蠟版上，滴一滴預(yù)冷的固定液，用兩片新的、鋒利的刀片成“拉鋸式”將組織切下并修小，然后用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果組織帶有較多的血液和組織液，應(yīng)先用固定液洗幾遍，然后再切成小塊固定。 透射電鏡工作原理： 利用電子射線（或稱電子束也稱電子波）穿透樣品，而后經(jīng)多級電子放大后成像于熒光屏。 主要優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，可用來觀察組織和細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)以及微生物和生物大分子的全貌。 溶液成膜（顆?！?000埃： 細(xì)胞碎片，病毒，生物大分子）藍(lán)耳病毒45-70納米 1 取材與固定 [目的] 將所取樣本盡可能固定在生活狀態(tài)下 固定劑： ? 戊二醛（醛基和氨基反應(yīng)） ? 四氧化鋨（鋨與雙鍵螯合） ? 多聚甲醛（醛基和氨基反應(yīng)） 0.1M磷酸緩沖液（PB） 固定劑濃度： 戊二醛（GA）：3%（ 0.1M PB ） 四氧化鋨(鋨酸):1%（ 0.1M PB ） 多聚甲醛（FA）:4% （ 0.1M PB ） 2.5%戊二醛+2%多聚甲醛（ 0.1M PB ） 1%戊二醛+1%四氧化鋨（ 0.08M PB ） 固定方法（迅速）： ? 將動(dòng)物麻醉或急性處死，暴露所需器官 ? 剪取小塊組織，放在預(yù)先冷卻的固定液中 ? 在潔凈紙片上滴一滴冷卻的固定液，取出組織塊初步修塊（細(xì)長條：L：2-3mm,W：1mm） ? 轉(zhuǎn)移回冷卻的固定液中 常規(guī)（兩步固定法） ? GA固定液中4C 1~2h(中間0.5-1h可取出修塊) ? 轉(zhuǎn)移到?jīng)_洗液中（0.18M蔗糖in0.1MPB） 4C 1~2h(原則上與固定時(shí)間相等)，中間換液2次 ? 鋨酸固定液中4C或 R.T.1h ? dd水中沖洗 ? *在沖洗液中可存放1~2周，但每周至少換一次液（在固定液中長放易脆） ? *經(jīng)GA固定后膜還有一定的滲透作用，在經(jīng)鋨酸固定后就沒有了 ? *清洗要充分（GA與鋨酸會產(chǎn)生微細(xì)沉淀，一般兩個(gè)固定液間更換兩次沖洗液后第三次過夜；鋨酸與乙醇會產(chǎn)生微細(xì)沉淀） 2 脫水 ? 脫水劑：乙醇或丙酮（梯度脫水） 50% 70% (80%) 90% 100% 100% 10-15m 10-15m 10-15m 10-15m 45m 45m 4C 4C 4C 4C或 R.T. R.T. R.T. ? *低濃度時(shí)對組織有提取作用，時(shí)間不可長 ? *低溫可降低提取作用，但100%低溫會吸水 ? *可停在90%過夜，不能在100%，脆時(shí)常搖動(dòng) ? *100%加干燥劑保存在干燥器中 3 浸透與包埋 包埋劑： （幾類物質(zhì)的混合物） ? 環(huán)氧樹脂（基本成分） ? 氨類物質(zhì)（催化劑） ? 酸酐（交聯(lián)）固化劑 ? 臨苯二甲酸二丁酯（增塑劑） 包埋劑的基本要求 脫水劑+包埋劑1：1 包埋劑 包埋劑 包埋劑 1h 過夜 12~48h 24h 37C或 R.T. 37C 45C 60C 膠囊中 膠囊中 膠囊中 不要加蓋 *R.T.下干燥器中可保存相當(dāng)長時(shí)間 4 修塊與切片 0.1*0.1mm，90度，梯形 ? 玻璃刀（現(xiàn)做現(xiàn)用，20-30片） ? 鉆石刀 ? 切片機(jī)的工作原理： 金屬膨脹桿 ? 切片厚度與顏色 ? 〈500A ? 600-900A ? 900-1500A ? 1500-1900A ? 1900-2400 ? 2400-2800A ? 灰色 ? 銀灰色 ? 金黃色 ? 紫色 ? 藍(lán)色 ? 綠色 支持網(wǎng)與支持膜 ? 銅網(wǎng) ? 不銹鋼網(wǎng) 3mm 目數(shù) ? 鎳網(wǎng) ? 金網(wǎng) ? 聚乙烯醇縮甲醛膜（Formvar）（0.2-0.5% in 氯仿） ? 聚乙烯醇縮丁醛膜 ? 火棉膠膜（1－4％in醋酸戊酯） ? 碳膜 *切片保存 5 染色 [目的]將重金屬原子結(jié)合到細(xì)胞結(jié)構(gòu)上使造成圖像反差 重金屬：鉛鹽（Pb,82）蛋白質(zhì)，糖元，脂類（膜看得清楚） 鈾鹽（U,92） 大多數(shù)細(xì)胞成分均可，特易于核酸 復(fù)染 ? 醋酸鈾（黃色有毒晶體，見光分解） ? 50-70%乙醇飽和溶液，放置過夜，取上清 ? 避光（棕色光口瓶，黑紙罩上） ? 檸檬酸鉛（有毒） ? {1.33g硝酸鉛+1.76檸檬酸鈉（2水）}in 50ml dd水+濃NaOH數(shù)滴 ? 避CO2（水去CO2，口吹， NaOH 顆粒） ? 醋酸鈾30m，漂洗 ? 檸檬酸鉛3~7m（不宜過長），漂洗 ? 0.02N NaOH分色，漂洗 ? *染液配好后可使用半年左右，放置較久的染液離心一下效果好 ? 半薄切片 ? [對于不均勻的組織重要] ? 厚度0.5微米（介于光與超薄之間） ? 載玻片水滴上70-80 C展開，烤干 ? 相差顯微鏡觀察 ? 經(jīng)甲苯胺蘭（1%）染色后觀察，可用無水乙醇分色 ? ξ2 溶液成膜 ? [對象]分散顆?！?000埃： ? 細(xì)胞碎片，病毒，生物大分子 ? 適當(dāng)溶液濃度 ? 懸滴法，噴霧法 ? 負(fù)染或投影（增加反差） ? 磷鎢酸鈉或鉀（1~2%水溶液） ? 甲型流感病毒，多形態(tài)性（園，橢圓，絲狀體），外膜有放射狀排列的纖突 ? ξ3復(fù)型薄膜