實用電子顯微鏡技術(shù).ppt

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實用電子顯微鏡技術(shù) 測試中心陳義芳2010年 緒論電子顯微鏡技術(shù)發(fā)展簡史 第一節(jié)電子顯微鏡發(fā)展簡史第二節(jié)電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用第三節(jié)其他顯微技術(shù)的發(fā)展 第一節(jié)電子顯微鏡發(fā)展簡史 電子顯微鏡通常分為透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡兩種類型 利用電子顯微鏡可對樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)及樣品表面形貌進行超微結(jié)構(gòu)的觀察與研究 表1 1顯微鏡發(fā)展簡史 電子顯微鏡之父E Ruska世界上第一臺電子顯微鏡 儀器名稱 透射電子顯微鏡生產(chǎn)廠家 荷蘭Philips公司儀器型號 Tecnai12主要附件 Gatan792CCD性能指標(biāo) 最大放大倍數(shù) 65萬倍點分辨率 0 24nm線分辨率 0 14nm最高加速電壓 120KV 一 國外電子顯微鏡生產(chǎn)簡況1932年德國物理學(xué)家Knoll和Ruska研制成功第一臺透射電子顯微鏡 20世紀80年代末 商品透射電子顯微鏡普遍進入市場 電鏡廠家 日本日立 Hitachi 公司日本電子光學(xué)實驗室 JEOL 荷蘭菲利浦公司 Philips 即美國FEI公司 德國蔡司 Zeiss 公司捷克英國劍橋 二 國內(nèi)電子顯微鏡生產(chǎn)簡況1959中國科學(xué)院長春光學(xué)精密機械與物理研究所研制成功第一臺透射電子顯微鏡10萬倍100kv重大科學(xué)技術(shù)成果1975中國科學(xué)院北京科學(xué)儀器廠研制成功第一臺掃描電子顯微鏡電鏡廠家 中國科學(xué)院北京科學(xué)儀器廠研制中心上海電子光學(xué)技術(shù)研究所南京光學(xué)儀器廠三 電子顯微鏡的發(fā)展分辨率進一步提高 點分辨率優(yōu)于0 3nm 晶格分辨率0 1 0 2nm放大倍數(shù)從十幾倍提高到幾十萬甚至百萬倍種類不斷增加 功能不斷擴展 TEM SEM STEM 分析電子顯微鏡 高壓透射電子顯微鏡 低溫透射電子顯微鏡等 計算機技術(shù)開始用于電子顯微鏡 一 電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展第一臺電子顯微鏡問世后 面臨的首要問題是如何將電子顯微鏡技術(shù)應(yīng)用于生物學(xué)及其他學(xué)科研究 電子顯微鏡結(jié)構(gòu)的改進和功能的改善 樣品制備技術(shù)的改進 使電子顯微鏡技術(shù)在生命科學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用 第二節(jié)電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用 表1 2電子顯微鏡技術(shù)發(fā)展簡史 二 電子顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用 樣品制備方法主要包括 超薄切片 負染色 金屬投影 冷凍復(fù)型 快速冷凍深度蝕刻技術(shù) 免疫電子顯微鏡術(shù) 掃描電鏡常規(guī)樣品制備及掃描電鏡冷凍斷裂技術(shù)等 利用多種樣品制備方法和高性能的電子顯微鏡 在生命科學(xué)領(lǐng)域可以觀察到細胞中各種細胞器的超微結(jié)構(gòu) 并以此進一步研究細胞結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 深入探索細胞通訊與運輸 分裂與分化 增殖與調(diào)控等生命活動的規(guī)律 在農(nóng)林科學(xué)方面 電鏡技術(shù)對植物各種疾病病因診斷與防治的研究越來越重要 利用電鏡技術(shù)觀察高分子 表面活性劑 碳納米管及納米粒子等結(jié)構(gòu)形態(tài) 為化學(xué)及材料科學(xué)研究提供了有力的技術(shù)手段 掃描隧道顯微技術(shù) STM 原子力顯微技術(shù) AFM 激光掃描共焦顯微技術(shù) 第三節(jié)其他顯微技術(shù)的發(fā)展 掃描隧道顯微技術(shù) STM 原子力顯微技術(shù) AFM 激光掃描共焦顯微技術(shù) 利用量子力學(xué)中隧道效應(yīng)產(chǎn)生隧道電流信號 獲得反映樣品表面原子形態(tài)結(jié)構(gòu)和原子排列圖象 具有原子尺度的高分辨率 可以觀察單原子層的實時結(jié)構(gòu)圖象 并能在大氣 真空甚至液體環(huán)境中觀察自然狀態(tài)下的樣品表面結(jié)構(gòu) 因而在半導(dǎo)體 金屬 無機材料及生物學(xué)研究等方面有廣闊的應(yīng)用前景 掃描隧道顯微技術(shù) STM 原子力顯微技術(shù) AFM 激光掃描共焦顯微技術(shù) 通過微懸臂上的針尖在樣品表面掃描 使針尖與凹凸不平的樣品表面的頂端原子相互摩擦產(chǎn)生原子力 在掃描過程中 微懸臂的上下起伏與等位面的樣品形貌相互對應(yīng) 所以可通過針尖與微懸臂之間的隧道電流變化 得到樣品表面形貌信息 其分辨率可與透射電鏡相比擬 AFM不但能通過探測原子間作用力觀察絕緣體 還可在生物環(huán)境中直接觀察生物樣品表面結(jié)構(gòu) 掃描隧道顯微技術(shù) STM 原子力顯微技術(shù) AFM 激光掃描共焦顯微技術(shù) 利用共焦光路及激光掃描 在觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)或直接觀察細胞時 可使所選定的不同層面每一焦點面影象清晰 從而得到細胞不同切面上的一系列圖象 經(jīng)計算機系統(tǒng)快速分析處理 即可重組出樣品三維立體圖象 展現(xiàn)細胞瞬間變化的形態(tài)結(jié)構(gòu) 第一章超薄切片技術(shù)透射電鏡的生物樣品制備的常用方法包括超薄切片 冷凍復(fù)型 負染色等 透射電鏡靠電子束穿透樣品成像 對樣品厚度有很高要求 超薄切片方法得到的樣品切片厚度為60 100nm 冷凍復(fù)型膜厚度約為30nm 復(fù)型膜制備和樣品負染色的實驗過程簡單 易于操作 而制備超薄切片的過程則比較繁雜 它分為普通超薄切片技術(shù)和冷凍超薄切片技術(shù)兩大類 第一節(jié)普通超薄切片技術(shù) 普通超薄切片技術(shù) 不需要特殊的冷凍條件的常規(guī)包埋切片技術(shù) 包括 取材 固定 清洗 脫水 浸透 包埋 聚合 切片及染色等步驟 每一步都關(guān)系到實驗成功與否 需步步謹慎認真 具體步驟 取材 醛類固定液前固定幾小時或更長時間 0 1MPBS清洗數(shù)次 1 鋨酸后固定2h或過夜 0 1MPBS清洗數(shù)次 梯度乙醇或丙酮脫水 30 50 70 80 90 95 100 100 浸透 1 1 1 2 純包埋劑 包埋 聚合 37 12h 60 48h 超薄切片 染色 雙重染色 對超薄切片的基本要求為了獲得清晰的電鏡圖像 超薄切片應(yīng)達到以下幾點要求 1 細胞的超微結(jié)構(gòu)得到良好的保存 沒有人工假象 2 切片厚度一般為50 70nm左右 較薄的切片分辨率較高 但反差較弱 而較厚的切片反差雖好 但分辨率則稍差 3 切片的包埋介質(zhì)不變形 不分解 不升華 可耐受電子束的照射 4 切片平展均勻 沒有刀痕 皺褶 震顫及染色劑的沉淀污染 5 切片染色后 具有良好的反差并可獲得清晰的圖像 第二節(jié)制樣前的準(zhǔn)備工作 一實驗設(shè)計的準(zhǔn)備二實驗器具和實驗試劑的準(zhǔn)備三實驗材料的準(zhǔn)備 一 實驗設(shè)計的準(zhǔn)備 應(yīng)充分考慮電鏡技術(shù)的復(fù)雜性和高消耗性等特點 在沒有周全的實驗設(shè)計之前不要輕易的動手進行實驗 應(yīng)考慮實驗是進行一般的超微結(jié)構(gòu)觀察還是進行細胞化學(xué)或免疫電鏡觀察 實驗涉及的是哪些組織和器官 對取材的組織和器官的部位都要考慮周密 根據(jù)實驗?zāi)康牟捎煤线m的緩沖液 固定液和固定方法 如在細胞化學(xué)工作中 一般要求選用二甲砷酸鹽緩沖液 一些特定的離子細胞化學(xué)技術(shù)需要特定的緩沖液 包埋介質(zhì)有時也需要考慮 如在免疫電鏡時需要低溫包埋劑 這樣抗原性可以保存得更好 二實驗器具和實驗試劑的準(zhǔn)備 要考慮到各個環(huán)節(jié)所需要的玻璃器皿 實驗器材以及實驗試劑等 三 實驗材料的準(zhǔn)備應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的實驗材料在實驗時不僅要有正常組 還需設(shè)立與實驗組相同條件的對照組 第三節(jié)取材與固定 一取材取材是超薄切片制樣的第一步 也是非常關(guān)鍵的一步 定義 從動植物機體上或從細胞及微生物的培養(yǎng)物中取得所需材料的操作過程 所需溶液主要有緩沖液 戊二醛等 所需器材有吸管 封口膜 稱量瓶 燒杯 雙面刀片和醫(yī)用剪刀 鑷子 牙簽 解剖鏡等 快 不管是從麻醉或處死動物身上取材 還是臨床手術(shù)取材 都應(yīng)注意保持樣品的微細結(jié)構(gòu) 使其最大限度的近于生活狀態(tài) 一定要目標(biāo)明確 操作迅速 而且使樣品必須在離體半分鐘或最多2分鐘內(nèi)浸入固定液 以免時間過長 出現(xiàn)細胞自溶 尤其在暑熱情況下 還會出現(xiàn)微生物繁殖導(dǎo)致樣品腐敗 細胞的精細結(jié)構(gòu)當(dāng)然會全部破壞 準(zhǔn) 取材的部位一定要準(zhǔn)確可靠 同時還應(yīng)注意材料的方向性 例如選取肌組織時 就要考慮肌原纖維在將來切片時是縱斷還是橫斷 其它組織當(dāng)然也要考慮到定位和定向的問題 輕 所謂 輕 是指一切操作都應(yīng)始終貫徹動作輕柔 不僅要避免對組織的擠壓及鉗拉 還要注意器械的鋒利 否則將引起組織結(jié)構(gòu)的人工損傷性變化 小 固定液的穿透能力都比較弱 所以為了保持樣品近于生活狀態(tài)的微細結(jié)構(gòu) 取材大小當(dāng)然要與固定液的穿透速率相適應(yīng) 一般以1mm3為宜 樣品過大時內(nèi)部固定不良 過小時觀察的目標(biāo)又會受到局限 低 低溫操作 4 所用試劑 器具均需預(yù)冷 取材方法 1 動物 將動物麻醉或急性處死 在1 2分鐘內(nèi)解剖出所需要的組織器官 用鋒利的解剖刀取小塊材料 迅速投入冷的戊二醛固定液中 然后取出放在滴有預(yù)冷的戊二醛載玻片上 用新的鋒利刀片把材料切成1mm3的小方塊 再投入盛有冷的固定液的小瓶中 置4 條件下進行低溫固定 對于某些特殊材料 如神經(jīng)組織等 應(yīng)先進行原位固定或灌流固定 待組織適度硬化后再取材 2 植物 植物組織的取材較容易 離體后的變化不象動物材料那樣迅速 但同樣要求盡快投入冷的固定液 一般植物葉片常切成寬1mm 長3 4mm的小條 莖和根可切成小條 也可切成1mm3的小方塊 表面有毛刺的植物材料 需先用酶處理使之軟化 表面有蠟質(zhì)的葉片在50 乙醇溶液中浸泡幾秒至幾十秒進行脫蠟 取出后用雙蒸水清洗數(shù)次 再切取 3 體外培養(yǎng)細胞的取材 先倒去培養(yǎng)液 然后倒入適量的戊二醛固定液 在冰浴條件下放置5 10min 彎頭滴管吹打或用刀輕輕刮下貼壁的細胞 將含有細胞的固定液轉(zhuǎn)移到離心管中 低速離心10 20分鐘 使細胞聚成團塊 用擦鏡紙包好細胞團塊 置于新鮮的固定液中固定 4 野外取材 冰壺內(nèi)放一瓶冷的戊二醛固定液 先切取比標(biāo)準(zhǔn)要求稍大的組織塊 放入冰壺內(nèi)保存的固定液中 帶回實驗室后 按要求切成標(biāo)準(zhǔn)小塊或小條進行固定 對于田間植物材料 還可以采集植株保濕帶回實驗室 再進行取材 5 骨組織取材 除某些魚類骨組織可不脫鈣 大部分骨組織均需脫鈣 用鋒利鋸條將骨組織鋸成約3mm碎骨片 放入固定液中固定過夜或更長時間 緩沖液漂洗后放入脫鈣液中脫鈣約3周后再切成小塊 二固定定義 用化學(xué)或物理法迅速殺死細胞 使所取材料各種細胞或大分子盡可能保持生活狀態(tài)的結(jié)構(gòu) 盡可能地減少細胞的死后變化 使細胞及其細胞器的精細結(jié)構(gòu)完好無損地得以保存 固定的目的 防止組織細胞的離體后變化 防止自溶 以保持組織細胞的成分和結(jié)構(gòu)與其生活狀態(tài)盡量一致在固定以后的漂洗 脫水和包埋等樣品處理過程中 保護樣品使其物質(zhì)不致溶解和流失為以后樣品的處理 包括染色和經(jīng)受電子束轟擊 作準(zhǔn)備 并使組織適當(dāng)?shù)赜不?一 固定方法 物理固定法是指用冷 熱或微波等物理方法對生物組織進行固定 在超微結(jié)構(gòu)研究中 冷凍固定和微波固定是較為常用的物理固定方法 化學(xué)固定法是采用一定的化學(xué)試劑對組織或細胞進行固定 這種化學(xué)試劑稱 固定劑 它能和細胞內(nèi)的大分子物質(zhì) 主要是蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)結(jié)合形成交聯(lián) 使蛋白成分得以凝固穩(wěn)定 與此同時也能保存糖類和脂肪 使其保持生活時的狀態(tài)和位置 從而達到把細胞的精細形態(tài)結(jié)構(gòu)保存下來的目的 理想的固定劑 應(yīng)具備以下條件 能迅速而均勻地滲入組織細胞內(nèi)部 穩(wěn)定細胞內(nèi)各種成分 能即刻將細胞 殺死 盡可能保持細胞微細結(jié)構(gòu) 減少死后變化 對細胞不產(chǎn)生收縮及膨脹作用 不產(chǎn)生人工假象及變形 可保存一定的酶的活性 以利于細胞化學(xué)測定工作的進行 在化學(xué)固定過程中 組織微細結(jié)構(gòu)保存的質(zhì)量不僅受到固定液特性的影響 而且還受到固定組織所使用方法的影響 1 浸泡固定是最常用的固定方法 組織塊切小后 立即浸到大量固定液中 使用青霉素小瓶 每瓶放10塊左右組織 固定液2 4ml 4 固定2 4小時或更長時間 適用于各種實質(zhì)性器官 如心 肝 腎 肌肉等 2 原位固定是指在保持實驗動物血流不斷的情況下 進行固定滲透 避免因為缺氧和死后的組織自溶引起微細結(jié)構(gòu)的變化 將動物麻醉后暴露出所需器官的表面 剝開包膜 將冷的固定液滴加到被取器官上 直至組織達到適當(dāng)?shù)挠捕?或?qū)⒐潭ㄒ褐苯幼⑸涞剿韫潭ǖ慕M織中或者空腔器官的內(nèi)部 最后將所需的組織取出作常規(guī)浸泡固定 適用于較軟的組織 如腦 眼球等 3 血管灌注固定利用血液循環(huán)的途徑將固定液灌注到所要固定的組織中 其特點是固定迅速 均勻 將固定液注入特制的帶有針頭與皮管的容器中 而后選擇到達要取材器官的最短循環(huán)途徑 將固定液灌注到動物的相應(yīng)部位 待被灌流的組織適度硬化后 再細致解剖取材 并按浸泡固定法操作 適用于解剖關(guān)系比較復(fù)雜的組織器官 如垂體 脊髓 甲狀旁腺等 二 常用固定液的性質(zhì)1 醛類醛類固定劑包括戊二醛 丙烯醛 甲醛 多聚甲醛等 此類固定劑的特點是對樣品的穿透力較強 能固定較大的組織塊 既能很好地固定蛋白質(zhì)和糖元等結(jié)構(gòu) 也不易使酶丟失活性 且長時間固定不會使組織變脆 因此能較好的保存組織的超微結(jié)構(gòu) 1 戊二醛是電鏡樣品制備中 最常用的固定劑之一 它作為超薄切片術(shù)的固定劑是從1963年開始的 至今已得到廣泛使用 戊二醛對細胞的精細結(jié)構(gòu)有很強的親和力 因此是一種良好的固定劑 商品多為25 的戊二醛水溶液 戊二醛作為生物樣品的固定劑 具有以下優(yōu)點 對組織的滲透力比鋨酸大 而且能保存組織內(nèi)某些酶活性 與蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)較快 能較好地保存蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 對細胞內(nèi)的微管及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 線粒體等膜性結(jié)構(gòu)保存較好 可以較好地固定和保存組織里的糖原 用大白鼠的肝臟可證明大約有65 的糖原可被戊二醛保存下來 能夠較好的固定植物組織 戊二醛作為固定劑的主要缺點 沒有電子染色作用 單獨用它固定的生物樣品電子反差不好 脂類及其他一些微細結(jié)構(gòu) 在脫水時易被提取出來 為充分發(fā)揮戊二醛固定效果 使用和儲存過程中應(yīng)注意 pH和溫度中性或堿性均能使戊二醛聚合 失去醛基 PH降至3 5以下時固定效力也將大幅降低 PH為5時在4 或更低溫度可保持穩(wěn)定狀態(tài)幾個月 氧氣和濃度氧氣對戊二醛溶液影響較大 應(yīng)密封保存 濃度大于50 時在室溫下容易聚合成膠狀 低于4 的溶液較為穩(wěn)妥 雜質(zhì)污染可能產(chǎn)生白色沉淀物 應(yīng)確保玻璃器皿及水的潔凈 2 丙烯醛其滲透和反應(yīng)速度均較快 稍大一些組織可用丙烯醛作固定液 丙烯醛和戊二醛混合液可較好保存微管 丙烯醛易燃 是危險化學(xué)品 可由呼吸系統(tǒng)吸入 或通過皮膚吸收 并對皮膚有強烈刺激作用 3 甲醛多用于光學(xué)顯微鏡技術(shù)研究 電鏡樣品固定多用純化的多聚甲醛 為白色粉末 分子較小 滲透組織的能力比強 但不能較好的固定細胞基質(zhì) 脫水后大部分細胞基質(zhì)將丟失 一般與戊二醛混合使用 4 高錳酸鉀一種強氧化劑 主要用于保存細胞的膜性結(jié)構(gòu) 對質(zhì)膜 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及髓鞘等結(jié)構(gòu)保存良好 其他結(jié)構(gòu)則保存很差 只用于研究某些常用固定液難以固定的植物和酵母樣品 戊二醛的配制 2 四氧化鋨 OSO4 鋨酸 四氧化鋨是一種淡黃色 具有強烈刺激味的晶體 它的水溶液呈中性 故 鋨酸 二字實為一種誤稱 強氧化劑 具有強烈的揮發(fā)作用 揮發(fā)的蒸氣具有一定毒性 對皮膚 呼吸道粘膜和角膜等都有固定損傷作用 所以在配制時應(yīng)注意通風(fēng) 最好在毒氣櫥中進行操作 優(yōu)點 能與不飽和脂肪酸反應(yīng) 使脂肪酸得以固定 所以也是唯一能保存脂類的固定劑 能固定脂蛋白 使生物膜結(jié)構(gòu)的主要成分磷脂蛋白穩(wěn)定 還可與變性DNA以及核蛋白起反應(yīng) 當(dāng)經(jīng)OSO4固定后 金屬鋨可被結(jié)合在細胞結(jié)構(gòu)里 因而在電鏡觀察時可以獲得很好的圖像反差 起到電子染色的輔助作用 對緩沖液要求不高 缺點 四氧化鋨對糖類和天然DNA RNA保存作用極差 因此單獨用四氧化鋨固定時 大部分碳水化合物包括糖原皆可被溶掉 其分子較大 滲透能力較弱 在l 1 5小時內(nèi) 僅滲透0 1 0 5mm 因此在取材時更應(yīng)注意其大小 一般不應(yīng)超過0 5 1 0mm3 四氧化鋨還是酶的鈍化劑 因而不適于作細胞化學(xué)的固定 經(jīng)四氧化鋨長時間的固定會造成脂蛋白復(fù)合體的溶解 使組織變脆 給切片帶來困難 所以四氧化鋨固定的時間不宜過長 一般應(yīng)控制在1 4小時內(nèi) 4 四氧化鋨還可與乙醇或醛類等發(fā)生氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生沉淀 故用四氧化鋨固定后的樣品 必須用緩沖液或雙蒸水徹底清洗后 才能進入乙醇溶液中脫水 配好的四氧化鋨儲存液 2 的水溶液 必須貯存于棕色帶磨口塞子的試劑瓶中 用蠟封好 外包黑紙 置4 冰箱中保存待用 存放鋨酸溶液的容器不干凈 或配制時間過久 鋨酸就會被氧化還原為黑色的OSO2 深褐色的OSO4 2H2O和OS OH 總稱為 鋨黑 此時預(yù)先配制的四氧化鋨水溶液逐漸失去原有的固定效力 因此 鋨酸溶液最好在使用前配制 3 四氧化釕與鋨酸性質(zhì)相近 對細胞膜 核膜及胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)固定效果極佳 與蛋白質(zhì) 糖原和單糖反應(yīng)強烈 易分解 在冰箱中也極不穩(wěn)定 其滲透速度比鋨酸還要慢 因此只在樣品需要時使用 綜上所述 各種固定劑均有其各自特點 要使組織達到良好的固定效果 常將兩種固定劑配合使用 最常用的是戊二醛作前固定 鋨酸作后固定 三 常用的緩沖液磷酸鹽緩沖液仿效細胞外液成分配成 優(yōu)點是便宜 無毒性作用 缺點是久放易產(chǎn)生沉淀并易遭到細菌的污染 PH會隨溫度的變化而稍有變化 在7 5以下緩沖能力很強 控制固定液的PH值比較有效 常用于配置戊二醛固定液和多聚甲醛固定液 并適于灌流固定 二甲砷酸鹽緩沖液較穩(wěn)定 能保存 不易被細菌污染 但有一定毒性 配制時要小心 應(yīng)在防護罩內(nèi)進行配制 盡量不與皮膚直接接觸 避免呼吸道吸入 不像磷酸鹽那樣會與鉛試劑起反應(yīng)產(chǎn)生沉淀 因此在細胞化學(xué)中使用普遍 1 磷酸鹽緩沖液 0 2M 儲備液 甲液0 2M磷酸氫二鈉溶液Na2HPO4 2H2O35 61g 或Na2HPO4 12H2O71 64g 加蒸餾水溶解成1000ml乙液0 2M磷酸二氫鈉溶液NaH2PO4 H2O27 60g 或NaH2PO4 2H2O31 21g 加蒸餾水溶解成1000ml工作液 混合甲 乙二液 即可得到50ml所需pH值的緩沖液 不同pH值0 2M磷酸鹽緩沖液的配制 按上表混合后 若將溶液稀釋到100ml 則可配成0 1M緩沖液 2 二甲砷酸鹽緩沖液 0 2M 儲備液甲液 二甲砷酸鈉4 28mg蒸餾水加至100ml乙液 0 2N鹽酸 不同pH值二甲砷酸鈉緩沖液的配制 按表8 2混合甲 乙液后 再加蒸餾水成200ml 即可得到不同pH的緩沖液 該液穩(wěn)定 可長期在4 下保存 缺點是有臭味 有毒性 應(yīng)在通風(fēng)柜中配制 四 影響固定效果的因素固定液的pH值 滲透壓 固定液的溫度和時間 以及緩沖液的選擇等因素 都會對固定效果產(chǎn)生直接影響 1 固定液的酸堿度 pH值 固定液的酸堿度必須與被固定組織的酸堿度基本一致 大多數(shù)動物組織酸堿度的平均值是7 4 所以固定液的pH值在7 2 7 4之間 才能最好地保存動物組織的精細結(jié)構(gòu) 動物組織適用pH7 4左右的固定液 植物細胞以pH6 8 7 1較好 2 滲透壓及離子組成低滲的固定液易引起組織腫脹 高滲引起收縮 在固定液內(nèi)加入適量的非電解質(zhì)或電解質(zhì)類物質(zhì) 調(diào)節(jié)其滲透壓 使之成為等滲溶液 通常使用的試劑有鉀 鈉 鈣鹽等電解質(zhì)或蔗糖 葡萄糖等非電解物質(zhì) 固定液中加有兩價陽離子 可以減少細胞內(nèi)物質(zhì)的抽提 3 固定液的濃度較低濃度需要較長的固定時間 易引起酶的擴散 細胞物質(zhì)的抽提及組織的腫脹 過高的濃度易毀壞酶的活性及細胞的精細結(jié)構(gòu) 特別是鋨酸和高錳酸鉀 高濃度會造成蛋白質(zhì)分子的斷裂 戊二醛常用濃度為1 6 鋨酸1 2 含水較多的組織 一般需要較高的固定濃度 4 固定的時間 溫度和樣品塊的大小在任何情況下不管使用何種固定劑 都應(yīng)在溫度較低的情況下進行 當(dāng)前采用的標(biāo)準(zhǔn)固定時間是1 4小時 固定溫度為0 4 由于組織樣品是由表及里逐層固定的 存在著固定的梯度 所以樣品的大小 直接關(guān)系到固定的均勻性 小 的樣品是實現(xiàn)均勻固定的最重要的條件 由于大多數(shù)固定劑 其穿透力每小時僅有0 25 0 5mm 所以在固定取材時 0 5 1 0mm3應(yīng)該是較理想的電鏡樣品尺寸 第四節(jié)漂洗與脫水 1 漂洗前后固定之間的漂洗 固定后脫水前的漂洗 對大多數(shù)樣品 通常用與配制固定液相應(yīng)的緩沖液漂洗組織2 3次 時間1h左右 植物或骨組織需要較長時間漂洗 脫水前的漂洗時間可短些 2 脫水脫水是指將組織內(nèi)所含的游離水完全清除的過程 屬于包埋前必經(jīng)步驟 現(xiàn)在常用的包埋劑大都是非水溶性樹脂 因此只有將生物樣品中的游離水驅(qū)除干凈 才能保證包埋劑完全深入生物樣品內(nèi) 如果含有水分的生物樣品進入電鏡的高真空中 樣品就會急驟收縮并放出水蒸氣 這樣就會使電鏡的高真空遭到損壞 并且造成鏡筒的污染 常用的脫水劑為乙醇和丙酮 它們是既能與水相混溶 又能與包埋劑相混溶的有機溶劑 脫水過程宜緩和而有序地進行 原因是在脫水時組織內(nèi)的水分和細胞內(nèi)某些物質(zhì)將被有機溶劑所抽提取代 若脫水急驟 常易引起組織塊中滲透壓等條件的劇烈變化 樣品出現(xiàn)猛烈收縮 會導(dǎo)致樣品結(jié)構(gòu)的破壞 因此 要求脫水時必須逐級提高有機溶劑的濃度 而且每一級脫水的時間不應(yīng)過長 一般以10 15分鐘為宜 具體的脫水程序為 50 乙醇或丙酮10 15分鐘70 乙醇或丙酮10 15分鐘 可置4 冰箱內(nèi)過夜 80 乙醇或丙酮10 15分90 乙醇或丙酮10 15分鐘95 乙醇或丙酮10 15分鐘100 乙醇或丙酮2次 每次30分鐘 游離和培養(yǎng)細胞的脫水時間可適當(dāng)縮短 脫水時的注意事項1 脫水一定要徹底 特別是100 乙醇或丙酮應(yīng)絕對保證無水 為此可事先加入吸水劑 如無水硫酸鈉 無水硫酸銅等 進行吸水處理 2 如果當(dāng)天完不成浸透 包埋操作時 應(yīng)將樣品停留在4 70 脫水劑中保存過夜 因為一般認為70 的濃度時所引起的組織塊體積變化最小 高濃度的脫水劑 尤其100 脫水劑中決不可停留過夜 不僅可引起組織內(nèi)過多物質(zhì)被抽提 而且會使組織塊發(fā)脆造成切片困難 3 脫水操作時 動作要盡量迅速 特別是100 脫水劑時 更要注意樣品塊不要在空氣中停留時間過長 否則會造成樣品干燥 使樣品內(nèi)產(chǎn)生小氣泡致使包埋劑難以浸透 潮濕季節(jié)在空氣中暴露時間過長也會吸水受潮 第五節(jié)浸透與包埋1 浸透 包埋的目的要求經(jīng)過脫水處理后的樣品 即可用包埋劑進行浸透 其目的是用包埋劑逐步取代樣品中的脫水劑 使細胞內(nèi)外所有空隙都被包埋劑所填充 在聚合過程中 包埋劑已由單體聚合成高分子物質(zhì) 使樣品內(nèi)的各種結(jié)構(gòu)得到堅固的支持 可承受超薄切片的切割和耐受電子束的轟擊 包埋塊的硬度和彈性應(yīng)該適中 而且其中不能夾有氣泡 否則切片易于變形 很難得到理想的切片 由此可見 浸透與包埋的好壞 是超薄切片成敗的關(guān)鍵之一 為了確保浸透與包埋的質(zhì)量 選擇好適當(dāng)?shù)陌駝┦鞘直匾?理想的包埋劑應(yīng)該具備以下條件 能與脫水劑 乙醇 丙酮等 完全混溶 粘度低 易操作 而且易于滲入樣品內(nèi)部 聚合后質(zhì)地均勻 體積變化小 能耐受電于束的照射與轟擊 在浸透包埋過程中 對細胞成分抽提少 可保存其微細結(jié)構(gòu) 在電鏡高倍放大下 不顯示包埋劑本身的任何微細結(jié)構(gòu) 包埋后具有良好的切片性能 包括均勻性 可塑性 硬度和彈性等 對人體無毒害作用 且材料來源豐富 操作簡便 價格便宜 2 包埋劑的種類環(huán)氧樹脂類 這是當(dāng)前采用最多的包埋劑 它具有三維交聯(lián)結(jié)構(gòu) 包埋后可保存細胞內(nèi)的微細結(jié)構(gòu) 對組織損傷小 聚合后體積收縮率低 僅有2 左右 耐受電子束轟擊性能好 其缺點是粘度較大 操作不便 切片較為困難 而且反差較弱 包埋塊切片時的難易 與樹脂 固化劑 增塑劑及催化劑之間的比例有關(guān) 而且還取決于聚合的溫度 時間等因素 Epon812 低黏度環(huán)氧樹脂 60 20hour以上 Spurr 低黏度環(huán)氧樹脂 70 8hour 國產(chǎn)618 黏度大 60 48hour 單體Epon812固化劑 或稱硬化劑 有十二烷基琥珀酸酐 簡稱DDSA 六甲酸酐 簡稱MNA 等 它們參與樹脂三維聚合中的交聯(lián)反應(yīng) 并被吸收到樹脂鏈中 增塑劑 不是必需的 鄰苯二甲酸二丁酯 簡稱DBP 其主要作用是提高包埋塊的彈性和韌性 改善其切割性能 催化劑2 4 6 三 二甲氨基甲基苯酚 簡稱為DMP 30 其主要作用是可以催化聚合反應(yīng) 但本身并不加入到樹脂鏈中 配方 A液Epon81210mlB液Epon81210mlDDSA16mlMNA8 9ml 水溶性包埋劑 是進行細胞化學(xué)研究較理想的包埋劑 由于這種包埋劑呈水溶性 所以組織標(biāo)本可以在水洗后直接投入包埋劑中 避免因使用乙醇 丙酮等脫水劑對樣品成分的抽提 同時也避免組織內(nèi)酶活性的降低 破壞和人為擴散 另外 水溶性包埋劑可以在較低溫度的紫外線照射下進行聚合 避免了一般包埋劑必須在高溫下聚合而給酶活性帶來的破壞 所以是酶活性定位和定量研究十分優(yōu)良的包埋劑 如乙二醇甲基丙烯酸脂 簡稱GMA K4M等 3 浸透與包埋的技術(shù)操作浸透為了使包埋劑均勻地滲入樣品內(nèi) 脫水后的樣品應(yīng)經(jīng)過逐級浸透的過程 浸透的具體過程為 脫水后樣品迅速移入丙酮 包埋劑等量混合液 30分鐘或數(shù)小時 然后入純包埋劑數(shù)小時或過夜 最后再進行包埋 另外 亦有用環(huán)氧丙烷作過渡溶劑 其浸透程序為 脫水后樣品 丙酮 環(huán)氧丙烷等量混合液 15分鐘 環(huán)氧丙烷 2次 各15分鐘 環(huán)氧丙烷 包埋劑等量混合液 數(shù)小時 純包埋劑 數(shù)小時 包埋 包埋常規(guī)包埋法 一般包埋可在藥用膠囊或特制的錐形薄塑料管內(nèi)進行 近些年來大都采用特制的多孔 錐形 橡膠或硅膠包埋板 常規(guī)包埋的具體做法 在包埋前先將包埋板放入60 干燥箱烘干2小時左右 用吸管吸取配好的包埋劑灌滿膠囊或包埋板 在其一側(cè)放入用硫酸紙寫好的樣品標(biāo)簽小紙條 包括課題號 日期 包埋塊號別等 再用牙簽挑起組織塊 放入上述膠囊中央 靜放數(shù)小時后樣品會自然下落到底部 然后將上述包埋板放入恒溫箱內(nèi)加溫聚合 加溫時先入37 45 24小時 而后60 恒溫箱 24小時 如直接以60 恒溫箱加溫聚合48小時亦可 VHIC 4 包埋時注意事項浸透 包埋用注射器 吸管 燒杯 膠囊 牙簽及其它器皿 均應(yīng)在用前烘干 不能有任何水分 用后要及時清洗盛過包埋劑的容器 否則樹脂固化后難以清洗 清洗時先用廢紙擦凈剩余的包埋劑 而后再用丙酮洗凈 所用藥品均應(yīng)注意防潮 藥品應(yīng)在干燥器中存放或在冰箱里保存 但從冰箱中取出的藥品必須等到恢復(fù)至室溫時才允許打開蓋子 否則水分會進入藥品內(nèi) 包埋時動作要輕巧 避免產(chǎn)生氣泡影響切片 操作時皮膚切勿接觸包埋劑 以防引起皮炎 有的包埋劑有致癌作用 應(yīng)注意防護 制好的包埋塊應(yīng)放在帶蓋的小瓶里 存放在干燥器中 以防止包埋塊吸潮變軟影響切片 第六節(jié)超薄切片超薄切片是將固化的包埋塊在超薄切片機上切為薄片的過程 厚度約為50nm 它是整個制樣程序的中心環(huán)節(jié) 超薄切片的好壞與切片機的性能 切片刀的質(zhì)量 包埋塊的切割性能以及操作者的技術(shù)經(jīng)驗等因素密切相關(guān) 當(dāng)進行超薄切片前 必須做好一切準(zhǔn)備工作 如制備支持膜 制備玻璃刀 修整包埋塊等 開始切片時必須心境平穩(wěn) 精力集中 避免任何干擾 如隨意離位 各種振動 人員往來 塵粒污染等 一 選擇與清洗載網(wǎng)超薄切片的操作過程與石蠟切片基本相似 但承載切片的不是載玻片 而是具有透明支持膜的圓形銅網(wǎng) 特殊切片還需用鎳網(wǎng) 不銹鋼網(wǎng)或銀絲網(wǎng) 銅網(wǎng)大都以電解法制成 直徑3mm 少數(shù)為2mm 網(wǎng)孔的形狀有園形 方形 單孔形 狹縫形等 網(wǎng)孔的數(shù)目有50 400目多種規(guī)格 超薄切片時一般選用200目銅網(wǎng) 網(wǎng)孔大者觀察的有效面積亦大 但其對切片的支持穩(wěn)定性能較差 因此如果觀察分辨率要求高的樣品時 則選用200目以上的銅網(wǎng) 以增強樣品的穩(wěn)定性能 銅網(wǎng)的洗滌處理因新舊而有不同 方法如下 1 新銅網(wǎng)可先用丙酮清洗數(shù)遍 而后再以無水乙醇清洗幾次 待干燥后使用 清洗的目的是去除銅網(wǎng)上的油污 以便支持膜與銅網(wǎng)得以牢固的貼附 2 舊銅網(wǎng)凡使用過的銅網(wǎng) 均可經(jīng)下法清洗以后 重復(fù)使用 1 酸洗法 放入盛有濃硫酸的小燒杯或錐形瓶內(nèi)輕輕搖動 約經(jīng)1 3分鐘后即可清洗干凈 倒出硫酸 水洗數(shù)次后 再用氨水清洗一次 用蒸餾水反復(fù)洗滌數(shù)次 最后在無水乙醇或丙酮內(nèi)清洗兩遍 取出平鋪于濾紙上自然涼干待用 2 超聲清洗法 先將舊銅網(wǎng)放入小燒杯內(nèi) 以醋酸異戊酯或二氯乙烷溶去火棉膠膜和Formavar膜 浸泡時間約半小時 然后再放入盛有95 乙醇或丙酮的小燒杯內(nèi) 將超聲波探頭插入其內(nèi)超聲清洗 時間約5 10分鐘 超聲波頻率8Hz 二 制備支持膜取清洗干凈的銅網(wǎng) 向它的表面制備一層透明而無結(jié)構(gòu)的支持膜 以便承載有關(guān)的切片樣品 此膜宜薄厚適中 過薄時樣品易有漂移或被電子束打破 過厚時則降低圖像的分辨力 一般厚度約為20nm 用做支持膜的原料有Formvar 火棉膠和噴碳等 1 Formvar膜該膜的化學(xué)成分為聚乙烯醇縮甲醛 Polyvinylformal 簡稱PVF 首先制備02 0 5 的氯仿 或二氯乙烯 溶液 然后用洗凈的玻璃片伸入到該溶液中停留片刻 平穩(wěn)取出 自然干燥后玻片上形成一層薄膜 再用刀片沿玻片邊緣將膜劃破 繼將該玻片的一端浸入玻璃平皿的蒸餾水中 待玻片上的薄膜完全漂在水面 把玻片輕輕下壓取出 再將銅網(wǎng)排列在膜上 用濾紙與銅網(wǎng)完全貼附后 用鑷子夾住濾紙的一角輕輕將其取出放于培養(yǎng)皿中 待自然干燥后使用 制膜時玻璃片一定要光潔干凈 否則Formvar膜不能從玻片上脫落飄起 制膜時室內(nèi)濕度不能太大 60 否則易在膜上出現(xiàn)微孔 另外 溶劑中不能混有水分與雜質(zhì) 操作時應(yīng)注意防止 否則膜上會有許多斑點 Formvar膜具有良好的透明度與機械強度 不易被電子束擊破 因此為當(dāng)前電鏡制樣最普遍采用的支持膜 2 火棉膠膜常用1 2 火棉膠醋酸異戊酯溶液 取市售的6 火棉膠溶液 加入等量的醋酸異戊酯 即成3 溶液 制膜時先取直徑9 12cm的培養(yǎng)皿 盛滿雙重蒸餾水 在水面上輕輕滴1 2滴上述溶液 醋酸異戊酯很快揮發(fā)后 即可在水面上形成一層均勻的火棉膠薄膜 此時將洗凈的銅網(wǎng)排列在膜上 然后在銅網(wǎng)上放上一張濾紙 待濾紙浸濕后輕輕提起 將貼有銅網(wǎng)的濾紙取出水面 放于培養(yǎng)皿中 在50 60 溫箱中烘干待用 3 碳膜的機械強度和化學(xué)穩(wěn)定性能均優(yōu)于其它支持膜 因此多用來觀察高分辨樣品 其制作方法如下 取此直徑為3或5mm的兩根碳棒 一根作固定極 將頂端磨平 另一極作推進極 將一端磨成細尖 取上述磨制好的碳棒裝在真空噴鍍儀的電極柱上 使推進極的尖端與固定極的平端相接觸 并調(diào)整碳極噴發(fā)點至樣品的距離12 14cm 將已帶有火棉膠膜或Formvar膜的銅網(wǎng)數(shù)個 放在噴發(fā)點的下方 蓋好真空罩 抽真空至1 10 5托 連接電源使碳極通電 加大電流至20 30A 使兩碳棒接觸點產(chǎn)生弧光放電 碳棒噴發(fā)出極細的顆粒 約噴發(fā)5秒鐘左右即可獲得足夠厚度的碳加強膜 其厚度要求為10nm左右 為了判斷碳膜的噴發(fā)厚度 可在銅網(wǎng)旁邊放一小塊白瓷板作為指標(biāo)板 瓷板上滴一滴真空油 當(dāng)碳噴發(fā)時 若油滴周圍呈現(xiàn)出淡褐色 而油滴表面仍為透明白色 則此時碳膜的厚度正好符合要求 三 包埋塊的修整制作好的包埋塊 應(yīng)將其尖端修成適當(dāng)?shù)男螤詈痛笮?除去組織周圍多余的包埋介質(zhì) 使包埋于其中的組織露于包埋塊的尖端 才能用于切片 包埋塊的頂端表面形狀 一般修成梯形 長方形或正方形 面積約為1平方mm 包埋塊頂端的四周則修成錐體狀 修整時先將包埋塊夾在專用的夾持器中 先用單面刀片傾斜45 角向外粗修出四個斜面 使包埋塊頂端呈錐體狀 然后在立體顯微鏡下進行細修 此時用雙面刀片將包埋塊頂端修平 使其露出組織 注意不要修及組織 修好的包埋塊 其面最好為梯形 因為梯形既有利于切片脫離刀鋒 避免切片粘附 同時也可連續(xù)成帶 有利于判斷前后順序 修塊定位 粗修 可用刀片完成 細修 玻璃刀或鉆石刀完成 最終形成一個小 扁平 四邊的金字塔保證上下兩條邊互相平行 四 切片刀切片刀的制備與選擇是超薄切片成敗的關(guān)鍵之一 超薄切片時 大都選用玻璃刀 在切比較堅硬的樣品或想獲得較大切片時 可選用鉆石刀 玻璃刀制作簡便 價格低廉 但刀刃脆不耐用 而且不能切割硬質(zhì)材料 鉆石刀質(zhì)地堅硬 經(jīng)久耐用 但價格昂貴 1 玻璃刀制作玻璃刀所用的玻璃 必須為不含雜質(zhì)的硬質(zhì)玻璃 其厚度要求為5 6mm 1 手工制刀法 2 機械制刀法機械制刀大都選用瑞典LKB7800型制刀機或國產(chǎn)型號 其主要部件包括 玻璃劃割器 夾持器 壓緊玻璃用 斷裂旋鈕 產(chǎn)生向上的頂力 與夾持器的壓力相反 使玻璃斷開 導(dǎo)板 選用刀尖角的角度 調(diào)節(jié)盤 調(diào)節(jié)劃割線偏離對角線的程度 Step1 玻璃刀的制作過程 a Step2 玻璃刀的制作過程 b 玻璃刀的檢查 玻璃刀水槽制作示意圖 VHIC 2 鉆石刀鉆石刀又稱金剛刀 它具有以下優(yōu)點 1 其刀口在室溫下不存在氧化和分子重新排列問題 可反復(fù)使用 節(jié)約了制取玻璃刀的大量時間 2 可切割各種軟硬度的樣品 尤其適用于特別硬的材料 3 刀口范圍大 可切割出較大的切片 4 刀鋒不易損傷 故可用于連續(xù)切片 5 刀鋒銳利 一般無刻痕 可得到10 20nm平整滿意的切片 鉆石刀是用沿晶體面裂開的金剛石制成 其刀刃角度為40 60 刀口的寬度為1 5mm 將磨好的鉆石裝在長約10mm 寬約5mm 厚2mm的黃銅條上 再裝在用壓鑄法制得的鋁架上 鋁架的外形與玻璃刀相同 鋁架的上方為一水槽 3 由于鉆石刀價格昂貴 且易碰撞受損 所以使用時務(wù)需注意以下事項 1 缺少熟練使用玻璃刀經(jīng)驗者 不要使用鉆石刀 2 可用玻璃刀切片的樣品 盡量不用或少用鉆石刀 3 鉆石刀的刀刃切勿手摸 安裝時要用特制的刀架 其刀刃不能碰及硬物 4 包埋塊游離端的表面積 不得大于1mm2 5 切硬度較大的樣品時 其切片厚度應(yīng)小于100nm 6 切速選擇一般為1mm 秒 最大不要高于2mm 秒 切速是指刀鋒通過包埋游離端的速率 7 用完后要立即清洗 濾紙吸干后妥善保存 清洗時可用軟木棒或牙簽削成薄片或用特制的軟紙浸上乙醇 在立體顯微鏡下邊觀察邊沿著與刀刃平行的方向小心 輕輕地擦洗刀刃的全長 五 切片一般透射電鏡觀察樣品時 電子束無法穿過0 1 m以上的切片 所以需將樣品切成10 50nm的薄片才能觀察 與光鏡觀察的3 7 m切片對比而言 常將透射電鏡的切片稱為超薄切片 為制取此類切片而設(shè)計的切片機稱超薄切片機 ultrotome 1 超薄切片機目前超薄切片機的生產(chǎn)國和機器型號很多 按其設(shè)計的推進原理 可將超薄切片機分為機械推進式和熱膨脹推進式兩類 不同型號的超薄切片機雖然操作方式各不相同 但其切片原理都基本相同 所有切片機在切片過程中 都是使一個裝有樣品塊的活動臂上下運動并通過刀刃 在活動臂每次下降切片之前均對著刀刃作微小的推進 這樣便使一極薄的切片從樣品塊表面被切割下來 刀上有一裝有液體的小水槽 脫落下來的切片懸浮在小水槽的液面上 2 超薄切片的基本步驟 1 安裝包埋塊將修好的包埋塊夾在樣品夾中 頂端露出約2mm 鎖住樣品臂樣品夾固定在 樣品定向頭 中 2 安放玻璃刀將帶有水槽的玻璃刀放在刀夾中夾緊 并與刀夾旁的標(biāo)尺等高 3 調(diào)好組織塊與玻璃刀的位置用粗 中調(diào)進刀 使刀盡量拉近組織塊的切面 調(diào)節(jié)定向頭的高度 使組織塊的切面下緣與刀口等高 水平移動刀臺 使刀刃平直無缺口處對準(zhǔn)組織塊切面 松開樣品臂固定鎖 一手轉(zhuǎn)動樣品臂升降鈕使樣品臂上下運動 一手調(diào)節(jié)中調(diào)或微調(diào)鈕 在立體顯微鏡觀察下調(diào)至刀刃剛好切到組織為止 4 調(diào)節(jié)水槽液面及燈光位置用注射器向水槽中加入蒸餾水 直至液面略低于刀刃 調(diào)好燈光位置 使刀刃下方的液面上出現(xiàn)較大亮斑 以便看清切片的干涉顏色 5 選定切片速度切片速度是指切片刀的刀鋒通過樣品塊切割面時每秒行走的距離而言 玻璃刀超薄切片的切片速度通常為2 5mm 秒 包埋塊偏軟時應(yīng)選擇較高的切片速度 例如每秒10 20mm 如包埋塊較硬時則應(yīng)選較慢的切速 如0 1 10mm 秒 6 選擇合適的切片厚度 開始切片 3 切片厚度的判斷切片表面的反射光和切片下面的折射光之間 會產(chǎn)生一種光學(xué)干涉的呈色現(xiàn)象 切片厚度呈現(xiàn)的干涉顏色亦因之有別 根據(jù)這一原理就可以判斷切片的大致厚度 一般情況下灰色及暗灰色的切片較薄 其分辨力較高 但反差較弱且易于破裂 金黃色或紫色的切片較厚 其反差較好 但分辨力較低 一般認為 銀白色的切片較符合理想 反差和分辨力均適中 干涉厚度顏色 nm 灰色 60銀色60 90金色90 150紫色150 190藍色190 240綠色240 280黃色280 320 4 撈片飄浮在水槽液面上的切片 需撈于銅網(wǎng)上才適于在電鏡下觀察 因為切片很薄 極易重疊和起皺褶 故在撈片之前先用鑷子夾一塊沾有二甲苯或氯仿的濾紙靠近刀槽液面 借溶劑揮發(fā)的蒸氣將切片稍加軟化 并使切片上的皺褶展平 這一過程叫展片 長時間的展片會損傷樣品的微細結(jié)構(gòu) 故展片時間不能過長 以3 4秒鐘為宜 而且展片時 要防止溶劑距切片過近或接觸切片 展片后用一根睫毛針 將一根睫毛或一小段頭發(fā) 綁在小木棍上制成 在立體顯微鏡下將平展于水面上的切片帶輕輕撥成幾段 再以專用鑷子夾住銅網(wǎng)邊緣 使帶有支持膜的一面對準(zhǔn)切片輕輕沾取 即可將切片沾附于銅網(wǎng)之上 而后 用濾紙角吸掉銅網(wǎng)上多余的水分 放入培養(yǎng)皿的濾紙上等待染色 如進行細胞化學(xué)的研究時 因某些試劑可與銅網(wǎng)產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng) 可改用金網(wǎng) 鎳網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng) 第七節(jié)染色一 電鏡圖像反差的形成超薄切片需經(jīng)染色后 才能在電鏡下顯示出清晰的結(jié)構(gòu)圖像 超薄切片的染色是一種 電子染色 其目的是增強樣品中各種結(jié)構(gòu)圖像之間的反差 電子束照射到樣品以后 與組成樣品物質(zhì)中的原子及核外電子產(chǎn)生彈性散射與非彈性散射作用 并產(chǎn)生帶有樣品信息的其他各種訊號 彈性散射特別是非彈性散射 為電鏡成像的最重要因素 樣品中質(zhì)量密度高的區(qū)域 可散射較多的電子 其透過的電子量較少 在熒光屏上呈現(xiàn)出電子致密的暗區(qū) 相反 在質(zhì)量密度低的區(qū)域 散射的電子較少透過的電子較多 故可呈現(xiàn)為電子透明的亮區(qū) 這樣 即可形成一個具有明暗反差對比的容易辨認的電鏡圖像 因此 電鏡圖像的反差是由樣品不同部位電子散射力的差異所決定的 也反映了樣品不同部位電子密度的差異 二 切片的電子染色生物組織系由碳 氫 氧 氮等輕元素所組成 由于這些元素的原子序數(shù)較低 散射電子的能力較弱 所以未經(jīng)染色的超薄切片反差很低 在電鏡下幾乎看不清生物組織的微細結(jié)構(gòu) 重金屬化合物有較強的電子散射能力 超薄切片多采用鈾 鉛 鋨 鎢等重金屬鹽類作為染色劑 經(jīng)浸染重金屬化合物的超薄切片 不同結(jié)構(gòu)成分會吸附不同數(shù)量的重金屬原子 吸附重金屬較多的部分有較強的電子散射力 在電鏡圖像中可呈現(xiàn)電子致密的黑色 相反 結(jié)合重金屬較少的部位電子散射力較弱 在電鏡圖像中呈現(xiàn)的顏色較淺 沒有吸附重金屬原子的部分 則透過的電子最多 故在熒光屏電鏡圖像上呈現(xiàn)為無色透明的區(qū)域 所以重金屬鹽染色是一種提高樣品結(jié)構(gòu)反差 增強圖像清晰度的 電子染色 三 常用的電子染色劑1 醋酸鈾醋酸鈾 醋酸雙氧鈾 是廣泛采用的染色劑 它可與細胞內(nèi)大多數(shù)分子結(jié)合 以提高核酸 蛋白質(zhì)和結(jié)締組織纖維成分的反差為主 對膜的染色效果較差 它具有一定放射性及化學(xué)毒性 對光和高溫具有不穩(wěn)定性 所以其配液需貯藏于棕色瓶和4 的冰箱內(nèi) 常用濃度為2 飽和液 切片染色可在室溫或37 環(huán)境里進行 時間為15 30分鐘或更長 2 鉛鹽類染色劑鉛鹽最常使用 有全能染色劑之稱 它可以與細胞內(nèi)的核蛋白及糖元結(jié)合 亦可大大提高細胞膜系統(tǒng)與脂類物質(zhì)的反差 幾乎可以浸染細胞內(nèi)的所有成分 鉛鹽的缺點是具有一定的毒性 極易與空氣中的CO2結(jié)合產(chǎn)生碳酸鉛沉淀而污染切片 后者在電鏡下呈現(xiàn)黑色致密的圓形及不定形顆粒 配制鉛鹽溶夜所使用的雙蒸水 最好先加熱煮沸 以除去水里的CO2 配制好的溶液 可在其表面滴加一層液體石臘或密封于注射器中保存 使之與空氣隔離 染色前最好先將染色劑離心 以除去沉淀部分 染色時要選用小的平皿 或采取其他密封措施 以減少與空氣接觸的機會 染色后用水洗去染液 立即烘干待用 鉛鹽類染色劑包括檸檬酸鉛 醋酸鉛 氫氧化鉛 酒石酸鉛等 以檸檬酸鉛最為常用 四 染色的方法1 塊染法多在脫水之前進行 樣品塊經(jīng)鋨酸固定后 可用醋酸鈾50 乙醇飽和液整塊染色 時間為30分鐘 這樣 不僅可以提高切片的反差 而且還可以增強組織成分的穩(wěn)定性 降低脫水所造成的磷脂丟失 2 切片染色法最常用醋酸鈾 檸檬酸鉛雙染色法 是當(dāng)前增強切片反差的常規(guī)染色技術(shù) 醋酸鈾主要用以顯示細胞核與結(jié)締組織 檸檬酸鉛主要可以提高細胞質(zhì)內(nèi)各種成分的反差 其操作步驟如下 1 醋酸鈾染色將銅載網(wǎng)以適當(dāng)?shù)拈g隔放置于蠟盤上 用毛細滴管吸取醋酸鈾染液 滴加在每一個銅網(wǎng)上 再翻轉(zhuǎn)銅網(wǎng)使其切片面向下 并漂浮于滴液上 為防止氧化和污染 宜蓋好蠟盤 染色30分鐘 2 清洗用切片鑷子將銅網(wǎng)從醋酸鈾染色液中取出 經(jīng)蒸餾水洗滌三次以上 用濾紙吸去水分 自然晾干 3 檸檬酸鉛滴注染色將上述銅網(wǎng)置于另一蠟盤里 蠟盤中放固體氫氧化鈉 吸附盤中的CO2 以防產(chǎn)生碳酸鉛沉淀 用毛細吸管吸取檸檬酸鉛染液 逐一滴加在每一銅網(wǎng)上 再翻轉(zhuǎn)銅網(wǎng) 使其切片面向下并飄浮于滴液之上 蓋好蠟盤 染色時間為15分鐘 而后逐一取出銅網(wǎng) 經(jīng)蒸餾水清洗三次后 用濾紙吸去水分待干燥即可電鏡觀察 第八節(jié)冷凍超薄切片技術(shù) 冷凍超薄切片技術(shù)始于1952年 它的特點是用新鮮的材料直接冷凍固定 無需再進行脫水 滲透 包埋 聚合等一系列繁瑣的程序 但要在冷凍固定之前進行預(yù)固定和冷凍保護處理 然后用冷凍超薄切片機切片 與普通超薄切片比 冷凍切片的樣品更富真實性 它不會因為脫水而損失某些成分 也不會與包埋劑發(fā)生某種化學(xué)反應(yīng) 更不會因為熱聚合而使其超微結(jié)構(gòu)變形 難點是在樣品制備過程中易造成冷凍損傷和干燥損傷等 大大降低樣品的實用價值 為此人們先后研究了多種冷凍保護劑 并提出了用甲基纖維素處理防止干燥損傷的方法 一 冷凍超薄切片機冷凍超薄切片機適用于多種類型的材料 總的包括非生物材料和生物材料兩大類 二 冷凍超薄切片樣品的制備一般冷凍超薄切片樣品的制備包括取材 冷凍保護 冷凍固定 冷凍超薄切片 冷凍干燥 免疫標(biāo)記或染色等技術(shù) 1 冷凍保護的意義冰晶損傷是冷凍樣品制備技術(shù)最容易產(chǎn)生的缺陷 冰晶損傷是由樣品中的游離態(tài)水分凍結(jié)而造成的一種樣品結(jié)構(gòu)的損傷 它主要是由于冷凍速率不足引起的 最佳冷凍效果是冷凍速率足夠高 1000C s 冷凍溫度足夠低 160 使細胞中的游離態(tài)水迅速形成無定形態(tài)冰 玻璃態(tài)冰 而細胞中與蛋白質(zhì)或脂肪結(jié)合的結(jié)合態(tài)水卻不結(jié)冰 防止冰晶損傷 可以使用優(yōu)質(zhì)冷凍保護劑 最佳冷凍裝置 樣品塊不宜過大 另外還可以在冷凍之前對樣品進行冷凍保護處理 2 取材與冷凍保護生物樣品做冷凍超薄切片的取材原則是 快 和 準(zhǔn) 樣品越新鮮越好 一般組織的含水量越高 所需冷凍保護劑的濃度也越高 冷凍保護的原理是用高濃度的冷凍保護劑處理生物樣品后 樣品中所含的游離態(tài)水與冷凍保護劑結(jié)合 使樣品中液體的濃度提高 與此同時就降低了樣品的冷凍點 這與鹽水不易凍結(jié)的道理一樣 其結(jié)果是防止樣品中形成冰晶 有時還可在冷凍保護之前先對樣品進行預(yù)固定 以提高樣品結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性 常用醛類作固定劑 如戊二醛 多聚甲醛 丙烯醛等 為提高冷凍固定的質(zhì)量 可先選用金屬鏡冷凍固定法 使樣品的表面平整 再于低溫條件下 用預(yù)冷的修塊刀將樣品頭部整修出一個小平原 面積約0 2mm2 然后再進一步冷凍固定 如果樣品需要預(yù)固定 則可以在預(yù)固定的過程中 用鋒利的刀片將樣品的頭部切成方形或梯形 冷凍固定是注意把修好的那面調(diào)節(jié)到切片的位置上 使切片平整且大小適宜 3 冷凍固定冷凍固定的關(guān)鍵是快速優(yōu)質(zhì) 目前常用的有KF80 KF80 MM80金屬鏡和MM80E金屬鏡冷凍固定裝置等 4 冷凍超薄切片的方法完成冷凍固定之后 就能把樣品裝入冷凍超薄切片機進行切片了 在轉(zhuǎn)運樣品的過程中要使其始終浸沒在液氮中 要事先打開冷凍超薄切片機 預(yù)冷到所需溫度 要在切片之前冷卻刀 根據(jù)研究目的的不同選擇切片時樣品的溫度 50 190 一般刀的溫度比樣品的溫度相應(yīng)高10 20 切片速度小于0 5mm s 厚度70 100nm 切片的收集有液滴沾取法 睫毛筆撥取法 漂浮撈取法等 切片的染色要根據(jù)研究目的進行選擇 如 一般研究超微結(jié)構(gòu) 可選負染色法 做免疫電鏡 需要進行免疫標(biāo)記 還有正染色等其它染色方法 第二章負染色技術(shù) 負染色技術(shù)首先由Hall 1955 等人所采用 在后來的生物學(xué)研究中得到了越來越廣泛的應(yīng)用 負染色樣品不需經(jīng)過固定 脫水 包埋和超薄切片等復(fù)雜操作 而是直接對沉降的樣品勻漿懸浮液進行染色 與超薄切片技術(shù)相比 該技術(shù)具有操作簡便 用藥量極少 省時快速及分辨力高等優(yōu)點 現(xiàn)廣泛用于細菌 病毒 大分子結(jié)構(gòu) 亞細胞碎片及分離的細胞器等研究工作 特別是在病毒學(xué)領(lǐng)域 負染色更能發(fā)揮其獨到作用 是一項很重要的實驗技術(shù) 組織超薄切片的染色通常稱為正染色 在正染色時 重金屬離子與大分子反應(yīng)增加了樣品結(jié)構(gòu)的電子密度 使之在電鏡下觀察時呈黑色 但背底未被染色 觀察時呈白色 從而形成樣品圖像反差 負染色又稱陰性反差染色 它是利用高密度的 且在透射電鏡下又不顯示結(jié)構(gòu)的重金屬鹽 如磷鎢酸 醋酸鈾等 把生物標(biāo)本包圍起來 在黑暗的背景上顯示出呈現(xiàn)陰性反差樣品的微細結(jié)構(gòu) 所以負染色所顯示的電鏡圖像 正好與超薄切片正染色相反 其樣品結(jié)構(gòu)為透明淺色 而背底則為無結(jié)構(gòu)的灰色或黑色 對于負染色的機制 目前還不夠清楚 在負染色中 樣品與染液之間不發(fā)生反應(yīng) 只是利用樣品染色劑密度的懸殊對比而將樣品襯托出來 故稱負染色法 凡密度比生物樣品大4倍以上的重金屬鹽類均可作為負染色劑 最常用的有磷鎢酸 PTA 磷鎢酸鉀 KPT 磷鎢酸鈉 NaPT 醋酸鈾 甲酸鈾和鉬酸銨等 當(dāng)使用磷鎢酸或磷鎢酸鹽時 可用蒸餾水配制成1 3 的溶液 染色前應(yīng)用1N的氫氧化鈉或氫氧化鉀將pH值調(diào)到6 0 7 0 可保存在室溫下 相當(dāng)穩(wěn)定 醋酸鈾則用0 5 1 水溶液 pH為4 2 4 5 反差較強 對樣品的破壞作用小 染液在用前新鮮配制 鉬酸銨配制成1 2 的水溶液 使用時用HCL將pH調(diào)至4 0 9 0之間 作為負染色劑的條件 1 具有較高的電子密度和較強的電子散射能力 2 耐受電子束的轟擊 在電子束照射下不升華 3 在電鏡下不呈現(xiàn)染色劑本身的結(jié)構(gòu) 4 化學(xué)穩(wěn)定性好 不析出沉淀 與樣品不發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 易在不規(guī)則樣品表面滲透 第一節(jié)染液種類及其特性 第二節(jié)負染樣品的制備 負染色所用的樣品 全部取自懸浮液 在這種懸浮液中樣品必須達到一定的濃度和純度 這樣才能與染色劑之間產(chǎn)生特異和清晰的結(jié)合反應(yīng) 操作時 將帶有樣品的懸液 滴于帶有支持膜的銅網(wǎng)上 染色處理后即可進行電鏡觀察 一 取樣方式1 直接取樣某些病毒性皰疹 如天花 水痘及皰疹等 可用毛細吸管直接刺入皰疹中取樣 感染病毒的植物組織可采取將葉或莖切開 將液汁直接滴到帶有支持膜載網(wǎng)上 生長在固體培養(yǎng)基上的微生物 可先用鉑金環(huán)將其刮下 然后用緩沖生理鹽水將刮下的微生物稀釋成適當(dāng)濃度的懸液 即可進行滴樣 2 離心提純用于細菌 病毒 噬菌體等微生物或細胞勻漿中線粒體 微管等細胞器的提純 先用低速離心 3000轉(zhuǎn) 分 棄去較大雜質(zhì)和細胞碎片 再用適當(dāng)孔徑的濾膜過濾 其濾液再經(jīng)低溫超速離心 最后取沉淀物制成懸液滴樣染色 3 濃縮取樣若提高電鏡下觀察病毒的效果 除了要求所觀察病毒有較高純度外 還要使其有適當(dāng)濃度 為此 需對病毒樣品進行濃縮 采用方法通常有以下幾種 1 紅細胞吸附法主要用于粘液病毒和副粘液病毒的制備 其操作方法為 將病毒懸液與等量紅細胞混合 放置5分鐘 使病毒吸附于紅細胞表面 而后 以800轉(zhuǎn) 分速度低速離心15分鐘 使吸附有大量病毒的紅細胞沉于管底 最后 棄去上清液 加入少量生理鹽水 于室溫下或冰箱中存放3 4小時 病毒即可從紅細胞表面釋放到上面的溶液里 取溶液滴在銅網(wǎng)載膜上 進行后染色處理 2 低滲釋放法從培養(yǎng)瓶中刮下所培養(yǎng)的腺病毒或皰疹病毒 低速離心 棄上清液 于沉淀物中加入培養(yǎng)液與蒸餾水的混合液 比例為1 4 使細胞因低滲破裂而釋放出病毒 然后快速凍融數(shù)次 再將凍融后的懸液低速離心 取其上清液滴膜染色 3 抗體一病毒凝集沉淀法某些病毒如鼻病毒 風(fēng)疹病毒 小兒腹瀉輪狀病毒及甲 乙型肝炎抗原等 可與相應(yīng)的抗體形成病毒一抗體復(fù)合物 經(jīng)離心沉淀而濃縮 而后取濃縮的沉淀物滴膜染色 可找到較多的病毒 目前這一技術(shù)已廣泛用于病毒疾病的快速診斷 二 支持膜在電鏡下觀察負染色樣品 如需放大倍數(shù)較高 即在高倍下才能觀察到樣品結(jié)構(gòu)時 應(yīng)該用大約5 10nm厚的碳膜或微篩膜 當(dāng)不需要很高倍數(shù)時 也可采用在方華膜上噴碳方法制成支持膜 厚度不應(yīng)超過30nm 第三節(jié)負染色操作方法 一 滴染法將制備好的懸浮液樣品 用毛細吸管吸取 滴于帶有支持膜的銅網(wǎng)上 根據(jù)懸液內(nèi)樣品的濃度 立即或放置數(shù)分鐘后 用濾紙從液珠邊緣吸去多余液體 即可滴上染液 染色時間1 2分鐘 而后即可用濾紙吸去染液 待干燥后即可電鏡觀察 注意事項 1 操作時吸管不能離銅網(wǎng)太近 應(yīng)讓液滴離開吸管后自然滴下 否則液滴易將銅網(wǎng)吸起 2 支持膜應(yīng)完好無損 吸管不能太粗 液滴不能太大 否則都不能形成良好的液珠 3 病毒的邊緣分布較多 操作時不宜用濾紙吸干 而任其自然稍干后再加染液 二 漂浮法先將樣品懸浮液滴在干燥的載玻片上 再把帶有支持膜的銅網(wǎng)放在懸浮液的液珠上漂浮以沾取樣品 然后 用濾紙吸干銅網(wǎng)上的多余懸液 再將銅網(wǎng)在染液滴珠漂浮 時間1 2分鐘 最后再用濾紙