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用羥基磷灰石薄膜給予水凝膠細胞黏附力
摘要：為了給予多水凝膠(PVA-H)良好細胞黏附力作為人工關(guān)節(jié)軟骨, 通過關(guān)于PVA-H的脈沖激光沉積技術(shù), 300納米厚的羥基磷灰石薄膜沉積在它的表面, 其中幾乎沒有細胞粘附. 細胞培養(yǎng)法用于研究羥基磷灰石沉積在PVA-H上后鼠纖維細胞之間的粘附的效果. 用非晶磷灰石膜包覆的水分含量33%PVA-H的細胞粘附最高可達采用常用的組織培養(yǎng)皿的水平. 這項技術(shù)還有效地改善細胞的附著力,即使在含水量較高(53%)的PVA-H. 這是一個嶄新的技術(shù),以改善附著PVA-H的基本骨和天然軟骨之間的生物相容性.
主題詞: 水凝膠; 細胞黏附力; 磷灰石; 薄膜; 激光處理; 生物材料
1. 簡介
在許多關(guān)節(jié)疾病如股骨頭缺血性股骨頭壞死中, 該病局限于一個病變的關(guān)節(jié)軟骨，單純手術(shù)切除周圍組織將足以彌補. 但是,目前的治療做法往往利用人工髖關(guān)節(jié)置換手術(shù), 其中良性骨組成一個龐大的聯(lián)合也刪掉了. 要解決這個問題使病變只限于關(guān)節(jié)面, 我們研制人造軟骨制成的PVA-H,一種高水含量的高分子材料。PVA-H顯示幾乎沒有蛋白質(zhì)吸附,不寄生在生物活組織界面. 這些都是關(guān)節(jié)面人造軟骨非常重要的特點，原因是吸附的任何蛋白會抑制潤滑轉(zhuǎn)嫁PVA-H關(guān)節(jié)面從而損害潤滑功能. 不過相反地, 安裝人工軟骨組織需要在PVA-H和周圍組織以及軟骨的界面有強有力的粘附。
本文提出了一種方法,將帶來更好的粘附只是在PVA-H表面的某些區(qū)域. 即薄膜磷灰石(磷灰石)則用來沉積在與周圍組織接觸的區(qū)域而不是相應的PVA-H關(guān)節(jié)面上. 為了用磷灰石沉積在PVA-H的指定地區(qū)，利用候補浸水過程或仿生過程的方法不能適用; 因為這些化學方法需要在解決過程中浸透整個PVA-H標本. 通常用于金屬植入物磷灰石涂層的等離子噴涂技術(shù)是一種方法，在這種方法中的磷灰石在高溫下溶化然后噴灑; 這種方法對PVA-H來說是不適用,因為這些都是低熔點材料.
因此,我們嘗試采用激光脈沖沉積(PLD)技術(shù),允許非熱，薄膜沉積的磷灰石基體,以及選擇性涂層基板面有一個理想的形狀, 而其中原料的化學成分和薄膜基本上是一致的 。我們先前的證據(jù)證明，高晶磷灰石膜可以在PLD薄膜的形成和樣品的隨后退火中得到。由于PVA-H不能被加熱到退火溫度，在目前的研究中,我們試圖利用非晶磷灰石薄膜(HAam). 研究是否HAam沉積提高PVA-H表面的生物相容性或細胞粘附，對通常用于細胞粘附的鼠纖維進行試驗養(yǎng)殖.
2. 實驗
2.1. PVA-H的準備
用在實驗中的PVA-H由一種低溫冷結(jié)晶法產(chǎn)生. 具有1700聚合度的聚(乙烯醇)粉溶于二甲基亞砜溶劑, 倒入一個長方形模子,在-20℃結(jié)晶. 然后這種材料浸在酒精以消除PVA膠體中的DMSO。之后對PVA-H進行130攝氏度真空中的24小時熱處理.然后材料被浸于蒸餾水48小時，比較水化前后的重量進行含水量計算.
在試驗中采用的水合狀態(tài)的PVA-H的尺寸是15.6毫米,直徑1.5毫米厚. 為了調(diào)查細胞粘附中含水量的影響,對24張低含水量PVA-H (wc33, 含水量33%)及高含水量PVA-H (wc53,含水量53%)分別編寫.
2.2. 磷灰石沉積
用通用PLD技術(shù)和表1所示大部分參數(shù),計量的磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2——seikagaku公司,日本)沉積到12張wc33和wc53樣本的表面，形成一個約為300nm的厚度. 在PVA-H表面，HAam薄膜的X光衍射圖案證實該薄膜是非晶態(tài).
2.3. 細胞培養(yǎng)試驗程序
這些PVA-H樣品被用作培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠纖維細胞; 在L929小鼠纖維中產(chǎn)生肉瘤細胞系(NCTC 克隆 929; 奚住友制藥公司,日本). 鍍PVA-H媒介的HAam以下簡稱為wc33+HAam和wc53+HAam,而沒有鍍PVA-H的HAam簡稱為wc33non和wc53non.
在以前的實驗中, PVA-H樣品用環(huán)氧乙烷氣體滅菌. 一種常用的組織培養(yǎng)器皿(中藥,朝日玻璃技術(shù)公司,日本)也被用于控制組. 培養(yǎng)液中使用的是鷹 附加10%的牛胎牛血清. 纖維細胞中的一萬個細胞接種于PVA-H培養(yǎng)基， 培養(yǎng)分別保持在攝氏37度的孵化器中，用5%二氧化碳維持，保持99%的相對濕度. 每次培養(yǎng)條件下的實驗次數(shù)定為n=3， 該細胞從開始后的24,78, 120和168小時后用0.25%胰蛋白從媒介中剝離. 錐蟲藍被添加到懸浮細胞中，其中含有被剝離的細胞以挑選出死亡的,而活細胞數(shù)量用血米來計算.
3. 結(jié)果與討論
圖 1列出了wc33+haam樣本表面掃描電子顯微鏡圖像. 在磷灰石沉積過程中,圖的左側(cè)部分用鋁箔覆蓋以防止HAam沉積. 能量色散X-射線光譜的線分析是沿圖. 1中的白線.射線的強度正如圖1所獲得的那樣; 在這里,鈣描繪了HAam區(qū)域. 這些數(shù)字表明，在PVA-H上HAam薄膜通過PLD是可形成的，同時選擇性沉積的表面積也是可能的.
圖 2表明了細胞在wc33和wc53樣本中培養(yǎng)120小時后的實例. 圖 2(一)顯示了wc33對照組,其中幾乎所有的細胞是梭形的, 顯示其粘附于培養(yǎng)基. 在細胞培養(yǎng)試驗中,對照組的情況是典型的最佳狀態(tài)的細胞, 評價是基于實驗組與對照組狀態(tài)的相似程度.
圖 2(b)展示的是wc33+Haam組. 球形細胞分散在梭形細胞中; 表明一些細胞剝離培養(yǎng)基飄散到培養(yǎng)液之中. 圖2(c)展示wc33non組. 因為可以看出有許多球形細胞,wc33non組表現(xiàn)出不佳的細胞粘附. 在圖 2(e)和(F)， 在wc53+HAam和wc53non組的顯微照片中分別可以看出幾個典型的紡錘狀細胞,它們細胞粘附較弱于wc33non組(圖(c)).
圖 3顯示細胞生長曲線以量化圖 2的結(jié)果. 圖 3(a)說明孵育時間和wc33樣本的細胞數(shù)之間的關(guān)系. 細胞數(shù)隨著所用的時間成倍增加.在wc33non組中，細胞數(shù)在168小時后為最高，其次是wc33+haam組和對照組,按順序如此下去. 經(jīng)過168小時培養(yǎng)，觀察到對照組與wc33+HAam組的細胞數(shù)無顯著差異(t-檢驗, p=0.107).
從細胞生長曲線中也可以計算出細胞數(shù)的倍增時間(DT). L929細胞的DT通常在20至25小時; 在這種情況下, wc33non小組的DT是32小時, wc33+HAam組為26小時，對照組為25h。
圖 3(b)展示在wc53樣本中L929的擴散. 相較于圖 3(一),細胞的增殖隨著PVA-H含水量增多而明顯下降. wc53non組的DT為49h, wc53+haam組為31h，對照組為26h. 盡管含水量高,不過通過分別對wc53non和wc53+HAam組比較細胞數(shù)和DT之后，磷灰石沉積的效果是很明顯的.
如上所述, 為了取得更好的與周圍組織和將PVA-h用作表面置換的材料附著力, 除關(guān)節(jié)面外所有PVA-h表面應包覆磷灰石. 但在實踐中, 用化學改性的方法如交替浸泡實現(xiàn)PVA-H表面特意覆蓋磷灰石涂層是不可能.結(jié)構(gòu)水交換也可以發(fā)生在PVA-H上, 用化學改性的方法在溶液中浸泡所做的那樣, 溶液滲透到PVA-H.
PVA-H的優(yōu)勢是它的機械性能,如彈性模量可通過改變水的含量來控制。因此, 從保留PVA-h的力學性能的角度來看，化學改性的方法是不實際. 在另一方面, PLD技術(shù)可使磷灰石涂層剛剛選定PVA-H曲面,而 對PVA-H本身材料的性能并無影響.
這是人所共知的,細胞粘附差的一般性能是由于一個高度的親水媒體使細胞粘附變得不可能. 在實驗中, 細胞增殖率(CPR)的計算是168小時實驗組的細胞數(shù)除以對照組的細胞數(shù); 更小的的實用價值顯示較弱的細胞粘附. wc33non和wc53non組的細胞增殖率分別為0.43和0.11; 顯示了極差細胞粘附. 但是,wc33+haam組的細胞增殖率為0.83, DL也幾乎和對照組相同,著顯示了被haam涂料成功覆蓋的PVA-H使粘附能力幾乎與控制組相等. 具體來說, 被HAam沉積的PVA-H擁有近一倍細胞粘附能力. 相比之下, wc53+HAam組的細胞增殖率為0.41,相當于大約wc33+Haam組一半的細胞粘附. 盡管如此,這個值仍相當于wc53non組的細胞增殖率0.11的 3.7倍，即使在wc53樣本的HAam涂料中也展現(xiàn)了相當?shù)男Ч?
4. 結(jié)論
通過PLD技術(shù)使HAam薄膜沉積在PVA-H表面大大改善了原來PVA-H較弱的細胞粘附. HAam薄膜沉積可以選擇性地適用在PVA-H表面的特定區(qū)域上，這是把PVA-H作為人工關(guān)節(jié)天然骨及軟骨的一種非常有效的手段.
鳴謝
感謝Tomoyo Gotoh 和Takako Osawa為我們提供技術(shù)援助. 這項工作得到了來自日本教育,文化,體育,科技等部門的資助 (編號16500308,2004年).