分子生物學(xué)研究方法和技術(shù) 醫(yī)學(xué)PPT

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分子生物學(xué)研究方法和技術(shù),本人基本情況,1984年獲湖南農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)學(xué)士學(xué)位。1987年獲中國科學(xué)院遺傳研究所理學(xué)碩士學(xué)位，專業(yè):分子遺傳。1999年11月-200年11月 受國家科技部派遣，在日本農(nóng)林水產(chǎn)省北海道國家農(nóng)業(yè)研究中心博士后特別研究員；主要從事基因定位和功能基因的篩選。年：主要從事水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理研究；水稻分子育種技術(shù)研究。4：主要從事雜交水稻種子純度快速鑒定技術(shù)研究；水稻品種指紋研究；基因定位和分子育種技術(shù)研究。,1、分子生物學(xué)的發(fā)展歷程1871年，首次發(fā)現(xiàn)DNA（鮭精DNA）。1943年，證明DNA為遺傳分子，而不是蛋白（1944，O T Avery）1953年，DNA雙螺旋模型提出（J D Watson（美）和F H C Crick（英），1962年或諾貝爾生理學(xué)、醫(yī)學(xué)獎）。從而為分子生物學(xué)這一學(xué)科奠基。1961年，合成mRNA，破譯第一個遺傳密碼（M W Nirenberg（美），1968年獲諾貝爾生理學(xué)、醫(yī)學(xué)獎）基礎(chǔ)研究的創(chuàng)新，與推動人類文明的進(jìn)步。（以上被稱為理論上的三大發(fā)現(xiàn)）,1970年，分離出第一個限制性內(nèi)切酶（W Arber（瑞士），1978年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎）1970年，Baltimore和Temin發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶長期的基礎(chǔ)研究積累迎來了突飛猛進(jìn)的高潮。1973年，Cohen把質(zhì)粒作為基因工程的載體使用基礎(chǔ)研究向應(yīng)用研究的拓展。（以上被稱為生物工程技術(shù)的的三大發(fā)明）,3個事例：（1）1976年，重組DNA成功（H Boyer和S N Colen，1981年獲諾貝爾化學(xué)獎）勇敢的科學(xué)精神。（2）1982年，美國一制藥公司在2000升發(fā)酵液中提取出100克精制胰島素。相當(dāng)于從1600磅動物胰腺中的提取量效率、成本、質(zhì)量、競爭。（3）荷蘭最早把分子生物學(xué)產(chǎn)品“豬牛痢疾疫苗”投放市場，比以上美國的胰島素早半年后來居上。,人類對生命現(xiàn)象的認(rèn)識,20世紀(jì)個體 染色體 基因 DNA SNP生物與非生物間的界限消失了！21世紀(jì) 基因克隆，拼結(jié) 組裝植物、動物、嬰兒！,數(shù)、理、化相關(guān)學(xué)科,生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),滲透 交叉,近代生物學(xué),個性,共性,宏觀生物學(xué)（生態(tài)學(xué)為核心）,微觀生物學(xué)（分子生物學(xué)為核心）,細(xì)胞水平,分子水平,結(jié)構(gòu)生物學(xué)，發(fā)育生物學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)等新興學(xué)科發(fā)展,生物多樣性研究,資源保護(hù)與利用,人類生態(tài)環(huán)境的保護(hù)工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)持續(xù)發(fā)展,現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展,分子生物學(xué),分子生物學(xué)的延伸,2 分 子 生物 學(xué) 的 概 念,2.1 分子生物學(xué)的定義2.2 分子生物學(xué)的三大原則2.3 分子生物學(xué)研究的三大主要領(lǐng)域2.4 分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科,2.1 分子生物學(xué)的定義,Molecular biology is the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA replication, recombination and translocation. 分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)，是人類從分子水平上真正揭示生物世界的奧秘，由被動地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向主動地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。,分子生物學(xué)與生物化學(xué)之間的關(guān)系與區(qū)別,分子生物學(xué)研究生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及信息傳遞過程，從分子水平研究生命現(xiàn)象。,生物化學(xué)生物體內(nèi)的化學(xué)運(yùn)動，包括化學(xué)組成、變化、結(jié)構(gòu)與功能，生物分子間的物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)換過程。,分子生物學(xué)生物化學(xué), 構(gòu)成生物大分子的單體是相同的, 生物遺傳信息的表達(dá)的中心法則相同,高級結(jié)構(gòu),生物大分子之間的互作,2.2 分子生物學(xué)的三大原則,共同的核酸語言 共同的蛋白質(zhì), 生物大分子單體的排列（核苷酸，氨基酸）,結(jié)構(gòu)生物學(xué),基因分子生物學(xué),生物技術(shù)理論論與應(yīng)用,2.3 分子生物學(xué)研究的三大主要領(lǐng)域,狹義的分子生物學(xué)分子遺傳學(xué),2.4 分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科,1839-1847年 Matthias Schleiden & Theodor Schwann,細(xì)胞的化學(xué)組成，細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞骨架，生物大分子在細(xì)胞中的定位及功能,分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科之一,Gregor Mendel 1864 年,Genetics,Molecular Genetics,Gene structure Gene duplication Gene expression Gene recombination Gene mutation,分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科之二,遺傳因子假說,Genetics,Biochemistry,Nucleic Acid Chemistry,Protein Chemistry,Enzymatic nature of crystalline （晶體） Protein,Biochemistry,3 21 世 紀(jì) 分 子 生 物 學(xué) 展 望,3.1 自然科學(xué)歷史舞臺角色的重大變化3.2 未來生物學(xué)形成的新熱點(diǎn)及領(lǐng)域3.3 應(yīng)用生物學(xué)發(fā)展3.4 21世紀(jì) 生命科學(xué)的世紀(jì),引導(dǎo)自然科學(xué)向物質(zhì)運(yùn)動最高層次突破的帶頭學(xué)科,3.2 未來生物學(xué)形成的新熱點(diǎn)及領(lǐng)域,生物大分子的高級三維結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一,生物大分子之間的互作,個體,細(xì)胞,分子,整體論,細(xì)胞中的定位,細(xì)胞分化,神經(jīng)基質(zhì)神經(jīng)通道信息傳遞,計算機(jī)語言,分辨，提取，分析， 比較， 預(yù)測生物信息,生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能信息,基因的識別與鑒定,基因功能信息的提取與證實(shí),基因表達(dá)譜的繪制 (microarray),蛋白質(zhì)水平上基因互作的探測,3.3 應(yīng)用生物學(xué)發(fā)展,生物技術(shù),診斷試劑 治療藥物植物品種 環(huán)境工程食品加工 生物塑料廢物處理 再生能源,3.4 21世紀(jì) 生命科學(xué)的世紀(jì),二十一世紀(jì) 生命科學(xué)的世紀(jì),學(xué)習(xí)分子生物學(xué)的意義,第一章 RNA的分離純化,主要內(nèi)容,前言一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性（二）防止核酸的生物降解二、分離提取核酸的主要步驟（一）細(xì)胞的破碎（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除（三）核酸的沉淀 (四）核酸的濃度測定（五）核酸的保存,核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。 無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進(jìn)行分離和純化。 核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。,前 言,一、核酸分離、純化原則,（一）保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性 1 意義 遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。 2 分離核酸原則： 1）溫度不要過高； 2）控制一定的pH值范圍(pH值5-9); 3）保持一定的離子強(qiáng)度; 4）減少物理因素對核酸降解的機(jī)械剪切力.,（二）防止核酸的生物降解,細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。 所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。,1. DNA酶抑制劑,1） 金屬離子螯合劑： DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉；2） 陰離于型表面活性劑： 如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。,2. RNA酶（RNAase)抑制劑,RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用機(jī)制：皂土帶負(fù)電荷，能吸附RNase，使其失活。,(2) DEPC(二乙基焦碳酸鹽) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。 作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。 使用注意： 1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大1001000倍。 2）容易降解，保存在4 或液氮中； 3）提RNA時，0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。 4）劇毒。,（3) 肝素（4）復(fù)合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復(fù)合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC),二 分離提取核酸的主要步驟,（一）細(xì)胞的破碎 1 高速組織搗碎機(jī)搗碎 2 玻璃勻漿器勻漿 3 超聲波處理法 4 液氮研磨法 5 化學(xué)處理法(SDS、吐溫80等） 6 生化法（溶菌酶、纖維素酶等）,（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除 核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。 分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。,常用方法： 1. 加入濃鹽溶液（如NaCl） 核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚； 2. 加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；,3 . 酚/氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯仿：異戊醇=25：24：1）。,1）使用注意 酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。 2）安全操作 酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時應(yīng)戴手套。,使用酚時應(yīng)注意,（三）核酸的沉淀,沉淀是濃縮核酸最常用的方法。 優(yōu)點(diǎn)： 改變核酸的溶解緩沖液； 重新調(diào)整核酸的濃度； 去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。,1. 核酸沉淀的鹽類及濃度,2. 有機(jī)沉淀劑,（1）乙醇優(yōu)點(diǎn)： 對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)： 需要量大，一般要求低溫操作。,（2）異丙醇,優(yōu)點(diǎn)： 需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點(diǎn)： 易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70乙醇漂洗數(shù)次。,（3）聚乙二醇（PEG）,優(yōu)點(diǎn)： 可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用6000相對分子質(zhì)量的PEG進(jìn)行DNA沉淀時，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意： PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。,（4）精胺,精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNA。 原理是： 精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分開，達(dá)到純化DNA的目的。,3. 核酸沉淀的溫度和時間,一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進(jìn)行。低溫長時間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。一般使用0冰水，10-15min， DNA樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。,(四）核酸的濃度測定,1. 紫外分光光度法測定DNA和RNA的含量 前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應(yīng)大于0.25 g/ml 。 結(jié)論：在波長260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/ml；單鏈DNA為37 g/ml；RNA為40 ug/ml。,紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟,a吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中。b分光光度計先用一定量的水校正零點(diǎn)。c測定待測樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。d計算濃度。 雙鏈DNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù) 50； RNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù)40。e分析純度。,A：測DNA： 純的DNA樣品OD260/OD280應(yīng)為1.8，OD260mOD230應(yīng)大于2.0。1) OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。2) 小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；3) OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。注： 可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。,測定結(jié)果分析,B：測RNA 純的RNA樣品其OD260OD280應(yīng)介于1.7-2.0之間，OD260/OD230比值應(yīng)大于2.0。1）若RNA樣品OD260/OD280比值太小，說明有蛋白質(zhì)或酚的污染；2）比值大于2.0時，可能被異硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于2.0時表明有小分子及鹽存在。,2. 溴乙錠熒光法測定核酸的含量,如果DNA和RNA的量很少或有較多雜質(zhì)的情況下，其含量可用溴乙錠熒光法測定。原理：DNA、RNA本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對照，可比較出被測DNA溶液濃度。 注意：此法的比較主要基于目測，是估計水平。,（五）核酸的保存,對DNA保存： DNA樣品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存； 長期保存樣品中可加入1滴氯仿。對RNA 保存： RNA樣品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70 保存; 長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70,可保存數(shù)年。,總RNA提取,目 的1了解某一特定組織或細(xì)胞某一特定mRNA轉(zhuǎn)錄量的變化，如PCR、Northern blot等。2了解某一特定組織或細(xì)胞全部mRNA轉(zhuǎn)錄量的變化，如DD-PCR、基因芯片等。3獲得某一特定組織或細(xì)胞全部mRNA，以便建立cDNA庫等。4獲得某一特定組織或細(xì)胞全部RNA。以上工作的前提是制備純凈且完整的RNA。,根據(jù)生物學(xué)“中心法則”原理，基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄與翻譯兩個階段。其中，由DNA到RNA的轉(zhuǎn)錄過程受到各種因素的調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)水平反映出某種或某些特定的因素對相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)能力。RNA主要由rRNA（占總量的80-85），tRNA和核內(nèi)小分子RNA（占總量的10-15）以及mRNA（占總量的1-5）所構(gòu)成。理論上認(rèn)為每克組織（或108個培養(yǎng)細(xì)胞）可提取5-10mg RNA。,提取總RNA的方法有多種，比如：1) 酚/SDS法 2）采用Trizol試劑盒或類似的方法，稱為一步法，方便而快捷。缺點(diǎn)是RNA的獲得量偏低，質(zhì)量不夠純凈。3）超離心方法，可以獲得豐富且質(zhì)量高的RNA。缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)時間比較長，要求離心過夜。4）其它一些試劑盒，主要是利用某些特定的介質(zhì)吸附RNA，洗去其它雜質(zhì)，最后洗脫純凈的RNA?？梢栽诙虝r間內(nèi)獲得純凈的RNA。但是價格比較昂貴。,植物總RNA提取(酚/SDS法 ),材料,液氮研磨緩沖液：0.18mol/LTris 0.09mol/L LiCL 4.5mmol/L EDTA 1%（W/V）SDS 用HCL調(diào)PH至8.2,1mol/L Tris的配法：,在800 雙蒸水中溶解121克Tris堿，用濃鹽酸調(diào)PH值，混勻后加水至1升。,要獲得所需PH值的1M Tris HCL，可通過將一定數(shù)量的10M HCL和1升Tris堿混合，如下表所示:,0.5M EDTA的配制：,在700ML雙蒸水中溶解186.1克Na2EDTA.2H2O，用NaOH調(diào)PH8.0（1000ML 05M EDTA需加入20克NaOH），補(bǔ)加雙蒸水至1升。,TLE緩沖液平衡酚TLE溶液:0.2mol/LTris 0.1mol/L LiCL5mmol/L EDTA用HCL調(diào)PH至8.2，用等體積的PH8.0的TLE溶液抽提，然后再用TLE溶液至少抽提2次,氯仿：異戍醇（24：1）8MOL/L和2MOL/L LICL溶液（DEPC處理，焦碳酸二乙酯）3MOL/L乙酸鈉（DEPC處理），將408克NaAc.3H2O溶于水，用3MOL/L乙酸調(diào)PH5.2，補(bǔ)加水至1升95%乙醇DEPC處理水,試驗(yàn)步驟：,1、 用液氮冷卻研缽，取15g低溫冷凍的植物組織，迅速置于研缽中，不時加入液氮以防止研磨過程中葉片融化，充分研磨后，立即轉(zhuǎn)移到一個盛有150ML研磨緩沖液和50ml TLE緩沖液平衡酚的500ml離心管中。2、 加入50ml氯仿：異戍醇，于50加熱20 min 。18000g, 4，離心20 min。,3、將上層水相轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入50ml TLE緩沖液平衡酚的500ml，混勻，再加入50ml氯仿：異戍醇，18000g, 4，離心20 min。,4、用 TLE緩沖液平衡酚抽提水相，直至兩面相間界面干凈為止，水相再以氯仿抽提。5、 吸取上清液，加1/3體積的8M/L LiCL混合至終濃度為2M/L，4沉淀過夜，然后15000g，4， 離心20 min，沉淀以2-3ml 2M/L LiCL溶液沖洗。6、沉淀以5ml水重溶，加入1/3體積的8M/L LiCL混合至終濃度為2M/L，于 4深沉RNA兩小時以上。,7、 15000g，4， 離心20 min，沉淀用2ml 2M/L LiCL溶液沖洗，重溶于2ml雙蒸水，加入200ul 3MOL/L乙酸鈉溶液和5.5ml無水乙醇，-20沉淀過夜或在干冰/乙醇中沉淀30 min。8、18000g, 4，離心15min，沉淀用1ml雙蒸水溶解，取10 ul稀釋至1ml測OD260和OD280,Trizol試劑盒方法,原 理本實(shí)驗(yàn)類似于“異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法采用強(qiáng)RNA酶抑制劑異硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白質(zhì)變性。離心后，RNA選擇性地進(jìn)入無DNA和蛋白質(zhì)的水相。之后通過異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌等，便可得到較為完整與純潔的總RNA。,實(shí)驗(yàn)步驟1取50毫克植物細(xì)嫩組織，加入1ml Trizol液，剪碎，快速勻漿。222，靜置5min。3加入氯仿0.2ml，顛倒15s。422，靜置3min。5離心：415000轉(zhuǎn)/分15min。6取上清液0.45ml。7加入0.45ml異丙醇，混勻。,822，靜置10min。9離心：415000轉(zhuǎn)/分10min。10棄上液。11加入1ml 4 75%乙醇。12離心：410000轉(zhuǎn)/分5min。13棄上液，真空干燥5min。14用高壓消毒過的去離子水25ul水冰上溶解，-70保存。15紫外分光光度計測定RNA的含量：,取樣本5ul加入石英比色杯內(nèi)，加入蒸水1ml，充分混勻。與蒸鎦水對照。讀260nm、280nm兩個測得值，記錄。計算：OD260為1時，為40ug RNA，所以計算如下：樣本RNA含量（ug/ul）= OD260*200*40/1000當(dāng)OD值260/28030min;20過夜將有助于增加核酸的沉淀量。,9、 在核酸提取過程中有機(jī)溶劑沉淀后復(fù)溶時可加水因此時離子濃度可能較高，而到高度純化后低溫保存時最好復(fù)溶于TE緩沖液中，因溶于TE的核酸儲藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時要求以高濃度保存，低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解。,10、 核酸提取后可通過PCR 、RTPCR直接擴(kuò)增出目的基因片斷，也可首先構(gòu)建文庫、然后由dd-PCR等差異顯示技術(shù)、AFLP等標(biāo)記技術(shù)、差異雜交或文庫扣除技術(shù)等方法篩選出特異探針，再用此探針從文庫中篩選出完整基因。,11、 在抽提過程中，若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多，可以增加抽提次數(shù).提取RNA請盡量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時間要盡可能的短。,克服多糖污染可采用以下一些辦法1) CTAB多次抽提。2) 在有機(jī)溶劑沉淀時先稀釋樣品濃度（可到10倍左右），對低濃度樣品再進(jìn)行沉淀。3) 在有機(jī)溶劑沉淀時選用異丙醇和5MNaCL作為沉淀溶劑，此時氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體積，異丙醇可用到0.6-1的體積。異丙醇沉淀核酸時，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，從而可達(dá)到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會影響核酸的進(jìn)一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。,針對RNA酶的一些注意事項(xiàng),防止RNA酶污染的措施：1、 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180的高溫下干烤6hr或更長時間。2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。3、 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。,4、 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22m濾膜過濾除菌。5、操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過程中手套要勤換。6、 設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。,7、 DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而 含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理8、 加樣原則是DNA最后加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那么采取的方法是算出總體積后加在一個管子里面，混合均勻之后再分裝到各個管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染。9、 普通實(shí)驗(yàn)室容易污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質(zhì)粒制備提取都在同一個房間里有比較大的關(guān)系，最容易造成高濃度污染的就是產(chǎn)物的開蓋和質(zhì)粒的稀釋。因此要格外注意一些。,謝謝！,Thank you,