電子顯微鏡的發(fā)展歷程

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“科學(xué)之眼“越來越亮 ——電子顯微鏡的發(fā)展歷程 摘要：Ruska和Knowll在1932年（有說是1931年和1933年的）研制成功第一臺電子顯微鏡。經(jīng)過半個多世紀(jì)的發(fā)展，已廣泛應(yīng)用到自然科學(xué)的許多學(xué)科中，并且極大推動了這些學(xué)科的發(fā)展。在七十年代電子顯微鏡終于實現(xiàn)了人們直接觀察原子的長期愿望，電子顯微鏡成了“科學(xué)之眼”。一門新興的電子顯微學(xué)因此而誕生。而Ruska也因此而獲得1986年諾貝爾物理獎。在生命科學(xué)，由于電子顯微鏡技術(shù)的迅速發(fā)展和應(yīng)用，改變了細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)、病毒學(xué)、分類學(xué)和分子生物學(xué)等的面貌，促使生物學(xué)從細(xì)胞水平進入到分子水平；它也成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)林等學(xué)科研究工作中極為重要的手段。近年來，我國擁有越來越多的電子顯微鏡，應(yīng)用也越廣泛，不少高等院校都相繼開設(shè)相關(guān)的課程。“科學(xué)之眼”不僅在外國，在我國也會越來越亮，開花結(jié)果，前途光明。 關(guān)鍵詞：電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡 透射電子顯微鏡 掃描透射顯微鏡 正文：電子顯微鏡問世已有半個多世紀(jì)了，但其應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)，尤其是細(xì)胞學(xué)的研究方面才只有二十余年的歷史。我國學(xué)者在六十年代初期開始這方面的工作。下面我們來看一下電子顯微鏡的總體發(fā)展歷程。 一．電子顯微鏡的總體發(fā)展歷程 人類對于生物微觀世界的認(rèn)識過程，有著一段漫長的歷史。荷蘭人列文虎克(Leeuwenhoek)在300年前創(chuàng)制成功世界上第一架顯微鏡，發(fā)現(xiàn)了當(dāng)時人們還不知道的微生物世界。這是顯微鏡第一次顯示其巨大作用。 早在一百年以前，樸率克(Plucker)就曾在蓋斯雷管的陰極近管壁上發(fā)現(xiàn)過一種黃綠色的光輝，但他當(dāng)時對這一現(xiàn)象并無認(rèn)識，未予重視。自從1924年德布羅意提出了電子與光一樣，具有波動性的假說和1926年Busch發(fā)現(xiàn)了旋轉(zhuǎn)對稱、不均勻的磁場可作為一個用于聚焦電子束的透鏡，就為后來的電子顯微鏡的問世奠定了理論基礎(chǔ)，這就打開了電子光學(xué)的大門。經(jīng)六年后，到1932年克諾露(Knoll)及魯斯卡(Ruska)等人首次發(fā)表了關(guān)于電子顯微鏡的實驗和理論研究，并試制成功第一臺電磁式電子顯微鏡。為了獲得較大的放大能力，人們又研究制造了短焦距的電磁透鏡，它除了會聚透鏡外，再利用兩個透鏡作連續(xù)兩次的造像。到1934年魯斯卡和馬頓(Marton)分別制成了新型復(fù)式電子顯微鏡。近代的電磁式電子顯微鏡在具體結(jié)構(gòu)上已經(jīng)有了很大改進。 Ruska和Knowll在1932年（有說是1931年和1933年的）研制成功第一臺電子顯微鏡。經(jīng)過半個多世紀(jì)的發(fā)展，已廣泛應(yīng)用到自然科學(xué)的許多學(xué)科中，并且極大推動了這些學(xué)科的發(fā)展。在七十年代電子顯微鏡終于實現(xiàn)了人們直接觀察原子的長期愿望，電子顯微鏡成了“科學(xué)之眼”。一門新興的電子顯微學(xué)因此而誕生。而Ruska也因此而獲得1986年諾貝爾物理獎。在生命科學(xué)，由于電子顯微鏡技術(shù)的迅速發(fā)展和應(yīng)用，改變了細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)、病毒學(xué)、分類學(xué)和分子生物學(xué)等的面貌，促使生物學(xué)從細(xì)胞水平進入到分子水平；它也成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)林等學(xué)科研究工作中極為重要的手段。近年來，我國擁有越來越多的電子顯微鏡，應(yīng)用也越廣泛，不少高等院校都相繼開設(shè)相關(guān)的課程。“科學(xué)之眼”不僅在外國，在我國也會越來越亮，開花結(jié)果，前途光明。 如果說，光學(xué)顯微鏡是人類對微觀世界的認(rèn)識有了第一次飛躍，那么可以說，電子顯微鏡是人類對微觀世界的認(rèn)識有了第二次飛躍。的確，光學(xué)顯微鏡使人類看到了肉眼看不到的細(xì)菌和細(xì)胞，揭開了許多生物界的“謎”，但是因為光學(xué)顯微鏡的分辨率受光波波長的限制，使更多的“謎”仍無法解開。而電子顯微鏡是以電子束作為光源的，電子束的波長比可見光的波長短得多，使電子顯微鏡的分辨率大幅度提高。從此，人類用電子顯微鏡揭示了細(xì)菌、噬菌體、類病毒、DNA和蛋白質(zhì)大分子等，甚至獲取了“原子核和電子云”的原子像。 總體歷程了解后，下面我們來關(guān)注一下透射電子顯微鏡的發(fā)展歷程： 二．透射電子顯微鏡的發(fā)展歷程 1924年，德國科學(xué)家德布羅意(De Broglie)指出，任何一種接近光速運動的粒子都具有波動本質(zhì)。1926---1927年，Davisson和Germer以及Thompson Reid用電子衍射現(xiàn)象驗證了電子的波動性，發(fā)現(xiàn)電子波長比X光還要短，從而聯(lián)想到可用電子射線代替可見光照明樣品來制作電子顯微鏡，以克服光波長在分辨率上的局限性。1926年德國學(xué)者Busch指出“具有軸對稱的磁場對電子束起著透鏡的作用，有可能使電子束聚焦成像”，為電子顯微鏡的制作提供了理論依據(jù)。 1931年，德國學(xué)者諾爾(Knoll)和魯斯卡(Ruska)獲得了放大12～17倍的電子光學(xué)系統(tǒng)中的光闌的像，證明可用電子束和電磁透鏡得到電子像，但是這一裝置還不是真正的電子顯微鏡，因為它沒有樣品臺。1931—1933年間，魯斯卡等對以上裝置進行了改進，做出了世界上第一臺透射電子顯微鏡（簡稱透射電鏡）。1934年，電子顯微鏡的分辨率已達到500，魯斯卡也因此獲得了1986年的諾貝爾物理學(xué)獎。 1939年德國西門子公司造出了世界第一臺商品透射電子顯微鏡，分辨率優(yōu)于100.1954年又產(chǎn)生了著名的西門子ElmiskopⅠ型電子顯微鏡，分辨率優(yōu)于10.在英國，透射電子顯微鏡的研究始于1935年，1946年設(shè)計了第一批商業(yè)透射電子顯微鏡，導(dǎo)致了EM型電鏡的系列生產(chǎn)。在荷蘭，1944年研制成第一臺電鏡，后來生產(chǎn)了著名的Philips EM和CM型透射電子顯微鏡。我國的透射電子顯微鏡研制始于20世紀(jì)50年代，1977年已作出了分辨率為3的80萬倍的透射電鏡。 目前世界上生產(chǎn)透射電鏡的主要是這三家電鏡制造商：日本的日本電子(JEOL)和日立(Hitachi)以及美國的FEI（這家公司把荷蘭的菲利浦電鏡公司收購了）。他們生產(chǎn)的透射電鏡大致可分為三類。 （1） 常規(guī)的TEM：加速電壓為100～200kV。代表性產(chǎn)品有日本電子的JEM-2010，日立的H-8000，菲利浦的CM200，F(xiàn)EI的TECNAI20.200kV透射電鏡的分辨率可達1.9. （2） 中壓TEM：加速電壓為300～400kV。代表性產(chǎn)品有日本電子的JEM-3010、JEM-4000，日立的H-9500，F(xiàn)EI的TECNAI F30。300kV透射電鏡的分辨率可達1.7，400kV透射電鏡的分辨率可達1.63. （3） 高壓TEM：加速電壓為1000kV。代表性產(chǎn)品有JEM-1000，日立公司還制造了世界上最大的3000kV的透射電鏡。目前1000kV的透射電鏡最高分辨率可達1. 目前用的最多的透射電鏡是200kV和300kV的電鏡，高壓電鏡由于價格昂貴，體積龐大，用得很少。 1949年以前，由于很難制備出能讓電子束穿過的薄金屬樣品，開始用透射電鏡直接觀察試樣。隨后，荷蘭的Bollnan和英國劍橋大學(xué)的赫什(Peter B.Hirsch)研究組進一步發(fā)展這一技術(shù)。特別是Hirsch研究組，發(fā)展了電子衍襯理論，可以解悉電子束穿過試樣形成的電子衍襯像，開創(chuàng)了用透射電鏡直接觀察試樣的時代，為電子顯微鏡在材料學(xué)的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。 20世紀(jì)70年代，美國亞利桑那州立大學(xué)的考利(John Cowley)和澳大利亞墨爾本大學(xué)的穆迪(Alex Moodie)建立了高分辨電子顯微想的理論與技術(shù)，發(fā)展了高分辨電子顯微學(xué)。20世紀(jì)80年代，發(fā)展了高空間分辨分析電子顯微學(xué)，人們可采用高分辨技術(shù)、微衍射、電子能量損失譜、電子能譜儀等對很小范圍內(nèi)（約1nm）的區(qū)域進行電子像、晶體結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分的研究，將電子顯微分析技術(shù)在材料學(xué)中的研究大大地拓展了。20世紀(jì)90年代，由于納米科技的飛速發(fā)展，對電子顯微分析技術(shù)的要求越來越高，進一步推動了電子顯微學(xué)的發(fā)展。目前，透射電鏡已發(fā)展到了球差校正透射電鏡的階段。 早在1935年，Knoll在設(shè)計透射電子顯微鏡的同時，就提出了掃描電子顯微鏡的原理及設(shè)計思想。下面我們來關(guān)注一下掃描電子顯微鏡的發(fā)展歷程。 三．掃描電子顯微鏡的發(fā)展歷程 如果說光學(xué)顯微鏡處于“老年”、透射電鏡處于“壯年”時代的話，那么掃描電鏡是剛進入“青少年”的時代。 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,簡稱掃描電鏡/SEM)的基本組成是透鏡系統(tǒng)、電子槍系統(tǒng)、電子收集系統(tǒng)和觀察記錄系統(tǒng)，以及相關(guān)的電子系統(tǒng)。現(xiàn)在工人掃描電鏡的概念最早是由德國的Knoll在1935年提出來的，1938年Von Ardenne在透射電鏡上加了個掃描線圈做出了掃描透射顯微鏡（STEM）。第一臺能觀察厚樣品的掃描電鏡是Zworykin制作的，它的分辨率為50nm左右。英國劍橋大學(xué)的Oatley和他的學(xué)生McMullan也制作了他們的第一臺掃描電鏡，到1952年他們的掃描電鏡的分辨率達到了50nm。到1955年掃描電鏡的研究才取得較顯著的突破，成像質(zhì)量有明顯提高，并在1959年制成了第一臺分辨率為10nm的掃描電鏡。第一臺商業(yè)制造的掃描電鏡是Cambridge Scientific Instruments公司在1965年制造的MarkⅠ“Steroscan”。Crewe將場發(fā)射電子槍用于掃描電鏡，使得分辨率大大提高。1978年做出了第一臺具有可變氣壓的商業(yè)制造的掃描電鏡，到1987年樣品腔的氣壓已可達到2700 Pa(20 Torr)。目前掃描電鏡的發(fā)展方向是采用場發(fā)射槍的高分辨掃描電鏡和可變氣壓的環(huán)境掃描電鏡（也稱可變壓掃描電鏡）。目前的高分辨掃描電鏡可以達到1～2 nm，目前，最好的高分辨掃描電鏡可在氣壓為4000 Pa（30 Torr）時仍保持2 nm的分辨率。 由于掃描電鏡的景深遠比光學(xué)顯微鏡大，可以用它進行顯微斷口分析，且樣品不必復(fù)制，可直接觀察，非常方便。另外，掃描電鏡的樣品室的空間很大，可以裝入很多探測器。因此，目前的掃描電鏡已不僅僅是只用于形貌觀察，它可以與許多其他分析儀器組合在一起，是人們能在一臺儀器中進行形貌、微區(qū)成分和晶體結(jié)構(gòu)等多種微觀組織結(jié)構(gòu)信息的同時分析，如果再采用可變氣壓樣品腔，還可以在掃描電鏡下做加熱、冷卻、加氣、加液等各種實驗，掃描電鏡的功能大大擴展。這也是為什么掃描電鏡得到如此普遍應(yīng)用的原因之一。 下面我們來對比一下掃描電鏡與光學(xué)顯微鏡和透射電鏡的特點：看是什么優(yōu)點使掃描電子顯微鏡應(yīng)用如此廣泛： （1） 景深大、圖像富有立體感。掃描電鏡的景深較光學(xué)顯微鏡大幾百倍，比透射電鏡大幾十倍。由于掃描電鏡是利用電子束轟擊樣品后所悉放的二次電子成象，它的有效景深不受樣品的大小與厚度的影響；而透射電鏡是利用穿透電子成象，它的有效景深直接受樣品厚度的限制。 （2） 圖像的放大范圍大、分辨率也比較高。光學(xué)顯微鏡的有效放大倍數(shù)為一千倍左右，透射電鏡的放大倍數(shù)為幾百倍到一百萬倍，掃描電鏡可放大十幾倍到幾十萬倍，它基本上包括了從放大鏡、光學(xué)顯微鏡直到透射電鏡的放大范圍。掃描電鏡的分辨率介于光學(xué)顯微鏡（2000）與透射電鏡（2—3）之間，可達60（有的可達30），而且，一旦聚焦好了之后，可以任意改變放大倍數(shù)而不需要重新聚焦。 （3） 樣品制備過程簡單，不需進行超薄切片，有的甚至不需要進行任何處理就可以直接觀察。 （4） 觀察樣品的尺寸可大至1208050毫米，而透射電鏡的樣品只能裝在直徑2毫米或3毫米的銅網(wǎng)上。 （5） 樣品可以在樣品室中做三度空間的平移和旋轉(zhuǎn)，因此，可以從各種角度對樣品進行觀察，有的甚至可以在觀察過程中對樣品進行顯微解剖。 （6） 電子束對樣品的損傷與污染程度很少。掃描電鏡中打在樣品上的電子束流很小，電子束的直徑為50至幾百，束的能量較?。铀匐妷嚎尚≈?千伏），電子束不是固定照射在樣品的某一區(qū)域而是以點的形式在樣品表面做光柵狀掃描，因此，由電子書照射所引起的樣品的損失與污染也較小。 （7） 在觀察形貌的同時，還可利用從樣品發(fā)出的其他信號作微區(qū)成分分析或進行晶體學(xué)分析。 （8） 掃描電鏡顯示的圖像有立體感，使人似如親臨微觀世界的現(xiàn)場。 （9） 安裝X射線能譜儀（EDS、WDS）到掃描電鏡上面可以同時快速、有效獲取同一區(qū)域上的形貌、晶型和組成信息。 由于掃描電鏡具有上述這些特點，因此，它不僅在許多重要學(xué)科的科學(xué)研究中而且在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)部門也得到廣泛的應(yīng)用。 掃描電子顯微鏡了解完后，我們看一下由透射電子顯微鏡與掃描電子顯微鏡結(jié)合產(chǎn)生的掃描透射電子顯微鏡（STEM）的發(fā)展歷程： 四．掃描透射電子顯微鏡（STEM）的發(fā)展歷程： 許多年以來，掃描電子顯微鏡（SEM）就已經(jīng)是生物學(xué)工作者熟悉的一種有價值的工具，它的分辨率比光學(xué)顯微鏡高40多倍，而在高倍時的焦深遠大于光學(xué)顯微鏡（可高達幾千倍）。人們用它已經(jīng)積累起大量的有關(guān)表面精細(xì)結(jié)構(gòu)的有價值的資料。因為掃描式顯微鏡中，當(dāng)纖細(xì)的聚焦束以光柵方式掃描整個物體時，像便按時間順序逐點的建立，分辨率主要取決于聚焦束的最小尺寸實際上探針電流必須大于10ˉ11A，如果采用平常的加熱式鎢絲源，分辨率被限制在5 nm左右。自從普通的透射電子顯微鏡（TEM）能達到的分辨率比掃描電子顯微鏡搞一個數(shù)量級以來，直至最近還沒怎么打算構(gòu)建掃描透射電子顯微鏡（STEM）。盡管知道用場發(fā)射陰極做電子光源的亮度高一萬到一百萬倍還不久，然而早已就嘗試（大約20年前）（Grewe,Wall和Langmore,1970;Crewe 和Wall,1970）。當(dāng)前市售的STEM商品儀器的分辨率優(yōu)于0.5 nm。 知道掃描透射電子顯微鏡是什么會時候，我們再看一下它在行家眼里的定位和發(fā)展前景： 就STEM儀器的價格昂貴而言，這首先意味著要對一些語言及早期結(jié)果作出評價還為時過早，看來這是一個緩慢的過程。其次，STEM怎么說也不會像TEM或SEM那樣普及。然而，有人預(yù)期STEM將在未來顯微術(shù)的某幾個方面做出相當(dāng)大的貢獻。首要的是在透過生物厚樣品（多至0.5um甚至1um）方面，STEM的分辨率會大大超過有相同加速電壓的TEM。雖然在這方面的性能似不能與1Mev的高壓電子顯微鏡（HVEM）相媲美，但是STEM比HVEM的價格低廉，尺寸較小，而且操作和維護都大大簡易，因此人們實際上會選上它。第二，在超薄切片或單個大分子的高分辨率顯微術(shù)領(lǐng)域中，STEM的極限分辨本領(lǐng)雖不會超過TEM，然而在像的亮度、不受旋轉(zhuǎn)影響、亮場像易于解悉以及儀器和樣品的不穩(wěn)定性對像記錄的影響均較少等諸方面都有優(yōu)越性。第三，STEM的暗場成像方式比TEM有效得多，因此在不染色的生物分子成像時具有較高的反差。第四，易于進行信號處理，這指的是容易采用像Z識別技術(shù)，譬如可見到生物分子中標(biāo)記的單個重金屬原子。第五，STEM還有清潔的超高真空，使污染大為減少，并能縮小輻射損傷，這個優(yōu)點在未來的高分辨率研究生物分子時是一個日益重要的特征。也可能，STEM的最大長處是在于它進行顯微分析的潛力。電子衍射、X射線能量分散顯微分析和電子能量損失光譜學(xué)都能順利的在同一臺儀器上進行。不論哪種型式的STEM，其優(yōu)點都比TEM多。所以，STEM在一般的生物研究中雖然不會使TEM淘汰，然而我們深信，在行家云集之處，STEM將對生物科學(xué)做出較大的貢獻。 下面我們對上述內(nèi)容做一總結(jié)及對電鏡做一個展望： 五．總結(jié)及展望 電子顯微鏡是在1931年，由德國科學(xué)家Enest Ruska 和 Max K –noll 首先發(fā)明的。雖然他們的第一臺用電子束和電磁透鏡組成的顯微鏡只將銅網(wǎng)放大了12倍，但是卻揭開了用電子顯微鏡探索微觀世界的新篇章。1986年，世界上第一臺透射電鏡的發(fā)明者E.Ruska與發(fā)明掃描隧道顯微鏡的科學(xué)家G.Binning和H.Rohrer 一起榮獲諾貝爾物理獎。幾十年來電子顯微鏡技術(shù)不斷發(fā)展的歷程，終于使人們確認(rèn)了第一臺電鏡問世的重要作用，被譽為“本世紀(jì)最主要的發(fā)明之一”。 自世界上第一臺電鏡問世至今，電鏡技術(shù)持續(xù)不斷地發(fā)展了半個多世紀(jì)，無論在深度還是在廣度上都取得了長足的進步。電鏡無愧為“科學(xué)之眼”，為人類發(fā)現(xiàn)微觀世界的奧秘和解悉生命現(xiàn)象的本質(zhì)做出了貢獻，成為發(fā)展現(xiàn)代生命科學(xué)的有利工具之一。 幾十年來，儀器更新的速度十分驚人，例如：第一臺電鏡的放大倍數(shù)只有12倍，而現(xiàn)在電鏡已可以連續(xù)把樣品放大到百萬倍。電鏡的進步主要表現(xiàn)在分辨力的提高和功能的增加上，電鏡的最佳晶格分辨力已達0.1 nm，點分辨力已達0.2～0.3 nm。電鏡的種類和功能也不斷的增加，除了能揭示超薄切片和冷凍復(fù)性樣品的超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡外，又相繼出現(xiàn)了能解釋樣品表面超微結(jié)構(gòu)的掃描電鏡；能同時觀察樣品的表面和內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)，甚至能觀察單個原子像的高分辨力（小于0.1nm）的場發(fā)射槍掃描透射電鏡；能對樣品中的某些化學(xué)元素進行綜合分析（定性、定位、半定量和定量，靈敏度達10ˉ25g）的分析電鏡；以及能觀察活細(xì)胞的超高壓（500kV～3000kV）電鏡等。 總之，電子顯微鏡以其高分辨本領(lǐng)和科學(xué)的直觀性顯示出無比的魅力，在眾多領(lǐng)域，如：生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)林、養(yǎng)殖和材料科學(xué)研究方面得到了廣泛的應(yīng)用，發(fā)揮著不可忽視的作用。展望電鏡技術(shù)的未來更是前景廣闊。 電鏡技術(shù)的應(yīng)用與未來前景無比廣闊，有許多新知識等待著人們?nèi)ヌ骄浚性S多方法等待著人們?nèi)?chuàng)造，有許多新問題等待著人們?nèi)ソ鉀Q。長江后浪推前浪，總有一代新人會在電子顯微術(shù)的領(lǐng)域里努力探索，創(chuàng)造出更美好的未來。 參考書目與資料：1.分析電子顯微學(xué)導(dǎo)論／戎詠華編著. -------北京：高等教育出版社，2006.10 ISBN 7-04-01994-4 2.電子顯微分析／章曉中編著.----北京：清華大學(xué)出版社，2006.12（材料科學(xué)與工程系列） ISBN 7-302-14160-6 3.生物電子顯微技術(shù)／張景強 樸英杰 蔡?；I 孔憲揚 等編著----中山大學(xué)出版社，1987.12 ISBN 7-306-00048-9／Q.2 4.現(xiàn)代材料分析方法／張銳主編.----北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.7 高等學(xué)校教材（工程應(yīng)用型） ISBN 978-7-122-00815-2 5.生物學(xué)中的電子顯微鏡技術(shù)/朱麗霞 程乃乾 高信曾 編著----北京大學(xué)出版社出版（北京大學(xué)校內(nèi)）1983.10 統(tǒng)一書號：13209.69 6.淺談電子顯微鏡和亞細(xì)胞技術(shù)/傅湘琦編著----科學(xué)普及出版社出版（北京白石橋紫竹院公園內(nèi)） 1980.8 統(tǒng)一書號：13051.1020 7.掃描電子顯微鏡入門/馬金鑫 朱國凱 編著 責(zé)任編輯 高小琪----科學(xué)出版社出版1985.5 統(tǒng)一書號：13031.2906 8.顯微術(shù)中的分析與定量方法/【英】G.A.米克 H.Y.艾爾德 主編 管汀鷺 譯 責(zé)任編輯趙甘泉----科學(xué)出版社出版 1983.8 統(tǒng)一書號：13031.2327 9.圖解掃描電子顯微鏡----生物樣品制備/【日】田中敬一永谷 隆 編輯 李文鎮(zhèn) 應(yīng)國華 等 譯 張允吉 校 責(zé)任編輯 馬素卿----科學(xué)出版社出版 1984年5月 統(tǒng)一書號：13031.2576 10.生物電子顯微術(shù)教程/陳力編著.----北京：北京師范大學(xué)出版社 1998.6 ISBN 7-303-04436-1 11.余老師課件