微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度測(cè)定 umu法征求意見(jiàn)稿編制說(shuō)明

《微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度測(cè)定 umu法征求意見(jiàn)稿編制說(shuō)明》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度測(cè)定 umu法征求意見(jiàn)稿編制說(shuō)明（13頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度測(cè)定 umu 法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明（征求意見(jiàn)稿）一、 任務(wù)來(lái)源本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì) 2017 年第三批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃，項(xiàng)目編號(hào)“20171811-T-424 ”。該標(biāo)準(zhǔn)由由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，由 清華大學(xué)等單位承擔(dān)該標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)。二、目的和意義基于 SOS 響應(yīng)系統(tǒng)國(guó)內(nèi)外開(kāi)發(fā)了多種環(huán)境毒性物質(zhì)和致癌物質(zhì)的快速定量檢測(cè)方法。這些方法的原理是致癌物質(zhì)通常會(huì)引起 DNA 損傷，而細(xì)胞在發(fā)生 DNA 損傷時(shí)會(huì)誘導(dǎo) SOS 系統(tǒng)響應(yīng)。DNA 損傷程度越高，SOS 響應(yīng)越強(qiáng)。將 SOS 系統(tǒng)調(diào)控基因與指示基因相融合，通過(guò)檢測(cè)指示基因編碼蛋白活性或信號(hào)強(qiáng)度，即可得到 SOS 基因的表達(dá)強(qiáng)度，表征 DNA 損傷強(qiáng)度和環(huán)境致癌物質(zhì)濃度。具體方法有 SOS chromotest, ADP1_recA_lux, umu-test 等。其中 umu-test 因準(zhǔn)確度高被廣泛采用。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn) ISO 13829-2000 用 umu-test 測(cè)定水及廢水的遺傳毒性。國(guó)內(nèi)還沒(méi)有類似標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)?；谝陨戏N種情況，我們建立了一種快速、可靠的 DNA 損傷檢測(cè)方法同時(shí)確立了一種類似標(biāo)準(zhǔn)。三、標(biāo)準(zhǔn)制訂原則1、標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)遵循 GB1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則的有關(guān)要求。2、標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)內(nèi)容參考的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，包括：GB/T 20001.4-2015 標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則 第 4 部分GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法；YY/T 0588-2005 流式細(xì)胞儀ISO 13829-2000 水質(zhì) 用 UMU 試驗(yàn)法測(cè)定水和廢水的遺傳毒性3、法律、法規(guī)及文件中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化法中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化法實(shí)施條例2國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化體系建設(shè)發(fā)展規(guī)劃（20162020 年） 深化標(biāo)準(zhǔn)化工作改革方案四、標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)方法屬于生物技術(shù)范疇，主要用于微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度測(cè)定，采用方法是 umu-test 和 FACS-umu-test 法?；?umu-test 原理，選擇 -半乳糖苷酶的熒光底物，并以碘化丙啶（PI）作為檢測(cè)死細(xì)胞的熒光染料，結(jié)合流式細(xì)胞儀，構(gòu)建單個(gè)活細(xì)胞水平的胞內(nèi) DNA 損傷強(qiáng)度定量手段。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物誘變育種的術(shù)語(yǔ)和定義、原理、測(cè)試微生物及傳代、儀器設(shè)備及器具、化學(xué)誘變、紫外或等離子體誘變、umu-test 測(cè)試、umu-test 檢測(cè)、umu-test 結(jié)果計(jì)算和表示、umu-test 精確度、umu-test 有效準(zhǔn)則、umu-test 測(cè)試報(bào)告及 FACS-umu-test 測(cè)試程序。五、工作過(guò)程1、成立工作組微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度測(cè)定 umu 法項(xiàng)目組 2016 年接到編制任務(wù)，開(kāi)展資料收集、分析和試驗(yàn)工作。 、2、調(diào)查研究工作首先研究了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 13829-2000 水質(zhì) 用 UMU 試驗(yàn)法測(cè)定水和廢水的遺傳毒性 （英文版） ，了解了國(guó)外 umu 試驗(yàn)的相關(guān)要求。通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)了 FACS-umu-test方法中熒光底物的選擇、流式細(xì)胞儀測(cè)定胞內(nèi)熒光素含量的可行性；通過(guò) FACS-umu-test 測(cè)試了不同誘變方法對(duì)活細(xì)胞的 DNA 損傷強(qiáng)度；比較了 FACS-umu-test 方法和ADP1_RecA_Lux 方法測(cè)定結(jié)果（。3、編寫(xiě)過(guò)程說(shuō)明為了使編制的標(biāo)準(zhǔn)能更好的適用微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度測(cè)定，在2016 年 10 月提出了標(biāo)準(zhǔn)討論提綱，確定了編制原則和主要內(nèi)容。該標(biāo)準(zhǔn)于 2017 年 10月在全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)信息公共服務(wù)平臺(tái)上進(jìn)行公示，于 2019 年 2 月召開(kāi)專家會(huì)，聽(tīng)取專家意見(jiàn)。六、方法驗(yàn)證及結(jié)果方法驗(yàn)證 1：FACS-umu-test 試驗(yàn)方法的建立驗(yàn)證材料：熒光素-2-D-吡喃半乳糖苷溶液，氯化氫，c(HCl)=1mol/l，氫氧化鈉 c(NaOH)=1 mol/l，二甲基亞砜(DMSO)，TGA 培養(yǎng)基，磷酸緩沖液 pH(7.00.2)，3鄰硝基-D-半乳糖苷溶液，碘化丙啶溶液驗(yàn)證過(guò)程：熒光底物的選擇：熒光素 2-D-吡喃半乳糖苷（Fluorescein di-beta-D-galactopyranoside, FDG）本身不具有熒光，其被 -半乳糖苷酶水解后的產(chǎn)物熒光素具有熒光。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 熒光染料，只能進(jìn)入失去細(xì)胞膜選擇通透性的細(xì)胞，即死細(xì)胞中，因此可以用于區(qū)分活死細(xì)胞。通過(guò)在 2 mM 的FDG 中，37 水浴中處理 2 min，使得 FDG 快速、均一的進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的FDG 被 -半乳糖苷酶水解產(chǎn)生熒光素，在一定時(shí)間內(nèi)測(cè)定，熒光素的濃度和 -半乳糖苷酶活性成正比。但是由于流式細(xì)胞儀只能測(cè)定胞內(nèi)的熒光物質(zhì)，因此最主要的問(wèn)題是如何保證產(chǎn)生的熒光素不泄露到胞外。前期研究表明，在 5 下，熒光素的跨膜速率比 37 降低 200 倍以上，而 -半乳糖苷酶的反應(yīng)速率只降低了 10 倍。為驗(yàn)證低溫對(duì)防止熒光素泄露的作用，測(cè)定原始菌株和 ARTP 處理 1 min 的菌株在冰上反應(yīng)和 37 條件下反應(yīng)，產(chǎn)生的熒光素的泄露程度。取反應(yīng)不同時(shí)間兩種溫度條件下的菌液，利用 0.22 m 的過(guò)濾膜過(guò)濾菌體，利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定胞外熒光素濃度。圖 1.在冰上和 37 條件下胞外熒光素的濃度隨反應(yīng)時(shí)間變化（n=3）驗(yàn)證結(jié)果：如圖 1 顯示，冰上反應(yīng)，在反應(yīng)時(shí)間增加到 90 min 時(shí)，胞外的熒光素濃度仍保持在很低水平。而 37 條件下反應(yīng)，胞外熒光素濃度隨反應(yīng)時(shí)間增加而不斷增大，說(shuō)明隨熒光素在胞內(nèi)產(chǎn)生，不斷泄露到胞外。以上結(jié)果說(shuō)明，冰上反應(yīng)能有效的防止熒光素的泄露。方法驗(yàn)證 2：流式細(xì)胞儀測(cè)定胞內(nèi)熒光素含量驗(yàn)證過(guò)程：利用流式細(xì)胞儀測(cè)定胞內(nèi)熒光素含量，首先通過(guò)前向角散射光 FSC 和側(cè)向角散射光 SSC 圈出目標(biāo)菌體。前向角散射光與細(xì)胞相對(duì)大小有關(guān)，前向角散射光4設(shè)為線性，前向角散射光太大，有可能是由于多個(gè)細(xì)胞粘連在一起，前向角散射光過(guò)小，有可能是細(xì)胞碎片或者雜質(zhì)，因此都需要在測(cè)定中去除。設(shè)置 FSC 的閾值為100，以去除雜質(zhì)的影響。通過(guò)畫(huà)門(mén)圈出目標(biāo)細(xì)胞，以去除多細(xì)胞粘連對(duì)結(jié)果的影響，如圖 2 所示。對(duì)圈出細(xì)胞進(jìn)行分析。首先只用 PI 染色，測(cè)定 FL-1 通道和 FL-3 通道的熒光值，在 FL-1 坐標(biāo)軸上圈出 PI 染色細(xì)胞，其 FL-1 通道熒光值較低，作為 FL-1 通道背景值（圖 3a） 。 4圖 2 流式細(xì)胞儀目標(biāo)細(xì)胞的劃定驗(yàn)證結(jié)果：通過(guò)測(cè)定 FDG 染色的細(xì)胞，作為 FL-3 通道的背景值，即 PI 染色陰性細(xì)胞（圖 3b） 。對(duì) FDG 和 PI 染色細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，如圖 4 所示。測(cè)定結(jié)果分為 4 個(gè)區(qū)域，其中 R1 和 R2 為死細(xì)胞，R3 為熒光素?zé)晒獗尘爸?，可能為雜質(zhì)或不具有 -半乳糖苷酶活性的細(xì)胞，予以扣除。R4 為目標(biāo)細(xì)胞群，用于后續(xù)分析。如圖 4 所示，R4中的每一個(gè)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即 FL-1 通道的熒光值，表示單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)，在反應(yīng) 60 min后的相對(duì)熒光素?zé)晒庵?。相?duì)熒光素?zé)晒庵蹬c體內(nèi)的 -半乳糖苷酶活性成正比，- 半乳糖苷酶活性表征了細(xì)胞的 SOS 誘導(dǎo)水平。利用流式細(xì)胞儀的 Cell Quest 分析可以得到突變庫(kù)所有活細(xì)胞的相對(duì)熒光素?zé)晒庵档钠骄担蛔儙?kù)的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)定義為Fi。=/ 其中 Am 為突變庫(kù)中所有活細(xì)胞的平均相對(duì)熒光素?zé)晒庵?，?Amc 為原始細(xì)胞或5陰性對(duì)照的活細(xì)胞的平均相對(duì)熒光素?zé)晒庵?。通過(guò)定義突變庫(kù)的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù) Fi，可以對(duì)不同突變庫(kù)的 SOS 誘導(dǎo)水平進(jìn)行比較。Fi 值越高表示突變庫(kù)的 DNA 損傷強(qiáng)度越大。6圖 3.3 流式細(xì)胞儀 FL1-H 和 FL3-H 陰性細(xì)胞的劃分FL1-HFL3-H圖 4.流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果（R1，R2 ，PI 陽(yáng)性細(xì)胞，為死細(xì)胞；R3，熒光素陰性細(xì)胞，未表達(dá) -半乳糖苷酶活性；R4，目標(biāo)細(xì)胞群，具有 -半乳糖苷酶活性的活細(xì)胞）方法驗(yàn)證 3：FACS-umu-test 定量檢測(cè)不同誘變方法對(duì)活細(xì)胞的 DNA 損傷強(qiáng)度驗(yàn)證材料：熒光素-2-D-吡喃半乳糖苷溶液，氯化氫，c(HCl)=1mol/l，氫氧化鈉c(NaOH)=1 mol/l，二甲基亞砜(DMSO)，TGA 培養(yǎng)基，磷酸緩沖液 pH(7.00.2)，鄰硝基-D- 半乳糖苷溶液，碘化丙啶溶液方法驗(yàn)證 2.1：定量表征 ARTP 對(duì)活細(xì)胞的 DNA 損傷強(qiáng)度7驗(yàn)證過(guò)程：常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）作為一種新興的誘變手段，具有操作快速、簡(jiǎn)單，安全，突變率高等優(yōu)勢(shì)，目前已經(jīng)被成功應(yīng)用于包括細(xì)菌，真菌，藻類在內(nèi)超過(guò) 40 種微生物的誘變育種。用 FACS-umu-test 方法定量測(cè)定單位活細(xì)胞誘導(dǎo)系數(shù)隨 ARTP 誘變時(shí)間的變化。圖 2.1 ARTP 處理不同時(shí)間構(gòu)建的突變庫(kù)的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)（n=3）驗(yàn)證結(jié)果：不同 ARTP 處理所產(chǎn)生的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示（圖 2.1） ，當(dāng)ARTP 處理時(shí)間在 30 s 到 75 s 范圍內(nèi)，隨著 ARTP 處理時(shí)間的增長(zhǎng)，突變庫(kù)的 SOS 誘導(dǎo)水平增加，即突變庫(kù)中活細(xì)胞的胞內(nèi) DNA 損傷強(qiáng)度增大。當(dāng) ARTP 處理時(shí)間超過(guò)75 s 時(shí)，繼續(xù)增大 ARTP 處理時(shí)間，突變庫(kù)的 SOS 誘導(dǎo)水平增加并不明顯，SOS 誘導(dǎo)系數(shù)的最大值為 2.79 0.15。方法驗(yàn)證：2.2 定量檢測(cè) UV 對(duì)活細(xì)胞的 DNA 損傷強(qiáng)度驗(yàn)證過(guò)程：UV 照射可以造成多種 DNA 損傷，包括 DNA 與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，氧化性 DNA 損傷以及單鏈的 DNA 斷裂損傷。FACS umu test 方法測(cè)定了 UV 照射不同時(shí)間對(duì)活細(xì)胞的 DNA 損傷強(qiáng)度變化，結(jié)果如圖 2.2 所示。8圖 2.2 UV 照射不同時(shí)間的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)（n=3）驗(yàn)證結(jié)果：隨 UV 照射時(shí)間的增加，活細(xì)胞的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)增大，UV 造成的DNA 損傷強(qiáng)度增加。但 UV 構(gòu)成的突變庫(kù)的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)同樣存在最大值。在 UV 照射 13 min 時(shí) SOS 誘導(dǎo)系數(shù)最大，為 1.660.11，明顯低于 ARTP 的最大 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)。超過(guò)該照射時(shí)間，SOS 誘導(dǎo)系數(shù)不再增大，說(shuō)明活細(xì)胞對(duì) UV 造成的 DNA 損傷同樣存在容忍極限。方法驗(yàn)證 2.3：定量檢測(cè) 4-NQO 對(duì)活細(xì)胞的 DNA 損傷強(qiáng)度驗(yàn)證過(guò)程：4-硝基喹啉-1-氧化物（4-Nitroquinoline-N-Oxide，4-NQO）的代謝物為4-乙酰氨基喹啉-1-氧化物，該物質(zhì)可以共價(jià)加合到脫氧鳥(niǎo)苷酸的 C8 位和 N2 位，以及脫氧腺苷酸的 N6 位從而形成 DNA 共價(jià)加合物。另外 4-NQO 同樣能造成 DNA 的氧化損傷，或者造成 DNA 單鏈斷裂。利用基于 FACS unu-test 法定量測(cè)定了不同 4-NQO 處理劑量對(duì) DNA 的損傷強(qiáng)度，如圖 2.3 所示。9圖 2.3 不同 4-NQO 劑量的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)（n=3）驗(yàn)證結(jié)果：不同 4-NQO 處理劑量造成的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)變化趨勢(shì)與 ARTP，UV 相似。在低劑量下，隨劑量增加，SOS 誘導(dǎo)系數(shù)增大，當(dāng) 4-NQO 處理劑量超過(guò) 0.8 g/ml后，隨 4-NQO 濃度增加，SOS 誘導(dǎo)系數(shù)不再增大。4-NQO 的最大誘導(dǎo)系數(shù)為 1.50 0.13。方法驗(yàn)證 2.4：定量檢測(cè) MNNG 對(duì)活細(xì)胞的 DNA 損傷強(qiáng)度驗(yàn)證過(guò)程：N-甲基-N- 硝基-N- 亞硝基胍（N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG）主要造成 DNA 的甲基化損傷，可以使 DNA 上的所有氧原子和大部分的氮原子發(fā)生甲基化。最主要的甲基化產(chǎn)物為 N7 甲基鳥(niǎo)嘌呤，甲基磷酸三酯， O6 甲基鳥(niǎo)嘌呤和 N3 甲基腺嘌呤。MNNG 不直接造成 DNA 的斷裂損傷，但通過(guò)堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)會(huì)造成 DNA 的鏈斷裂。利用基于 FACS-unu-test 法定量測(cè)定了不同 MNNG誘變劑濃度對(duì)單個(gè)活細(xì)胞的 DNA 損傷強(qiáng)度（圖 2.4） 。10圖 B.4 不同 MNNG 劑量的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)（n=3）驗(yàn)證結(jié)果：如圖 2.4 所示，隨 MNNG 濃度的增加，SOS 誘導(dǎo)系數(shù)呈現(xiàn)了與前三種誘變方法相同的趨勢(shì)。MNNG 造成 DNA 損傷引起的最大 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)值為 1.58 0.07。驗(yàn)證結(jié)果 2.5：不同誘變方法的活細(xì)胞內(nèi) DNA 損傷的比較驗(yàn)證過(guò)程：通過(guò)測(cè)定 ARTP，紫外照射，兩種常用化學(xué)誘變劑 4-NQO 和 MNNG的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)，可以看出不同誘變劑量下引起的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)均存在最大值，達(dá)到該最大值后繼續(xù)增加誘變劑量，SOS 誘導(dǎo)系數(shù)不再增加。對(duì)于不同的誘變方法，SOS誘導(dǎo)系數(shù)的最大值也不同，ARTP 的最大 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)高于其他三種誘變方法(圖 2.5)。11圖 2.5 不同誘變方法的最大 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)（n=3）驗(yàn)證結(jié)果：將對(duì)照樣品的平均胞內(nèi)熒光素相對(duì)熒光強(qiáng)度設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)值，統(tǒng)計(jì)了各種突變方法在最大 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)的誘變劑量下，構(gòu)成的突變庫(kù)中相對(duì)熒光強(qiáng)度高于該標(biāo)準(zhǔn)值的細(xì)胞的比例。ARTP，UV，4-NQO 和 MNNG 四種誘變方法分別為 35%， 26%， 17%，和 16.5%。 方法驗(yàn)證 3.：FACS-umu-test 方法與 ADP1_RecA_Lux 方法測(cè)定結(jié)果的比較驗(yàn)證材料：熒光素-2-D-吡喃半乳糖苷溶液，氯化氫，c(HCl)=1mol/l，氫氧化鈉 c(NaOH)=1 mol/l，二甲基亞砜(DMSO)，TGA 培養(yǎng)基，磷酸緩沖液 pH(7.00.2)，鄰硝基-D-半乳糖苷溶液，碘化丙啶溶液驗(yàn)證過(guò)程：ADP1_RecA_Lux 是一種常用的 DNA 毒性檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法使用Acinetobacterbaylyi ADP1 作為模式菌株，來(lái)自 Photorhabdus luminescens 的生物發(fā)光基因 luxCDABE 作為報(bào)告基因，將其與 SOS 系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)基因 recA 進(jìn)行融合，導(dǎo)入到Acinetobacterbaylyi ADP1 的基因組。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生 DNA 損傷時(shí)，誘導(dǎo) SOS 系統(tǒng)的響應(yīng)，recA 表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度可以通過(guò)生物發(fā)光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度定義為光強(qiáng)度除以細(xì)胞的光密度（OD 600） ，誘導(dǎo)系數(shù) Fi 定義為樣品的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度除以沒(méi)有毒性處理的對(duì)照樣品的相對(duì)生物發(fā)光強(qiáng)度。將 ADP1_RecA_Lux 方法應(yīng)用于檢測(cè) ARTP 對(duì)DNA 的損傷強(qiáng)度。驗(yàn)證結(jié)果：ADP1_RecA_Lux 方法對(duì) ARTP 不同時(shí)間的 DNA 損傷結(jié)果顯示（圖3.1） ，在 ARTP 處理時(shí)間不高于 90 s 時(shí)，隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，樣品中總細(xì)胞的 SOS12誘導(dǎo)系數(shù)增加，ARTP 對(duì) DNA 損傷強(qiáng)度增大。當(dāng) ARTP 處理時(shí)間增加到 105 s 時(shí)，樣品中總細(xì)胞的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)反而降低，而用流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果顯示，ARTP 處理時(shí)間為 105 s 時(shí)，其對(duì)胞內(nèi) DNA 的損傷程度持續(xù)增高達(dá)到最大值。兩種測(cè)定方法結(jié)果的差異主要是由于采用流式細(xì)胞儀的方法，我們檢測(cè)的是突變庫(kù)中活細(xì)胞的 DNA 損傷，而 ADP1_RecA_Lux 方法我們檢測(cè)的是樣品中總細(xì)胞的DNA 損傷，包括活細(xì)胞和由于 ARTP 處理而造成死亡的細(xì)胞。這些死細(xì)胞在細(xì)胞密度測(cè)量時(shí)同樣有貢獻(xiàn)。當(dāng) ARTP 處理時(shí)間低于 90 s 時(shí)，ARTP 作用劑量較低，對(duì)菌體的致死率低，因此少量的死細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度測(cè)定結(jié)果影響不大。而當(dāng) ARTP 處理時(shí)間達(dá)到 105 s 時(shí)，ARTP 對(duì)細(xì)胞的致死率升高，大量的死細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的光密度測(cè)定影響較大，而死細(xì)胞通常具有較低的發(fā)光強(qiáng)度，因此造成相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的下降，影響 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)的測(cè)定結(jié)果。而基于 unu-test 的流式細(xì)胞儀測(cè)定方法，通過(guò) PI 染色可以排除死細(xì)胞的影響。圖 3.1 ARTP 處理后 3 h 和 6h 用 ADP1_RecA_Lux 方法檢測(cè) ARTP 處理不同時(shí)間的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)（n=3 ）采用 ADP1_RecA_Lux 方法檢測(cè)得到的最大 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)值為 1.49 0.25，低于基于 unu-test 的流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。這主要是由于 ADP1_RecA_Lux 方法中選用 recA作為 SOS 響應(yīng)檢測(cè)基因， recA 編碼的蛋白作為 DNA 同源重組的重要相關(guān)蛋白，其在SOS 未誘導(dǎo)的菌體中具有較高的含量，導(dǎo)致 ADP1_RecA_Lux 測(cè)定方法的背景值較高。而隨著 ARTP 處理時(shí)間的增加，死細(xì)胞的增多導(dǎo)致相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的進(jìn)一步降低，因此造成了采用 ADP1_RecA_Lux 方法測(cè)得的 SOS 誘導(dǎo)系數(shù)較流式細(xì)胞儀方法低。七、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系13本標(biāo)準(zhǔn)符合國(guó)家現(xiàn)行法律、法規(guī)、規(guī)章和強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求。本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施不涉及對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的廢止情況。八、標(biāo)準(zhǔn)屬性的建議本標(biāo)準(zhǔn)為推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。九、貫徹國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施后，建議由標(biāo)準(zhǔn)編制單位組織有關(guān)生產(chǎn)、檢驗(yàn)、設(shè)計(jì)等單位進(jìn)行宣傳貫徹。十、其他應(yīng)予說(shuō)明的事項(xiàng)無(wú)其他事項(xiàng)說(shuō)明。