高考生物一輪復(fù)習(xí)（基礎(chǔ)知識(shí)整理+重難點(diǎn)聚集）專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課件 新人教版選修1

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1、一、一、DNA的粗提取與鑒定的粗提取與鑒定 1.實(shí)驗(yàn)材料的選擇： 選用DNA含量相對(duì)較高較高的生物組織，如雞血雞血、菜花、洋蔥等。2.提取原理：DNA與雜質(zhì)的溶解度溶解度不同，DNA與雜質(zhì)對(duì)酶、高溫、洗滌劑的耐受性耐受性不同。3.步驟：（1）破碎細(xì)胞：動(dòng)物細(xì)胞（以雞血為例），加入蒸餾水蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液濾液。植物細(xì)胞（以洋蔥為例），加入洗滌劑和食鹽洗滌劑和食鹽 ，充分研磨和攪拌，過(guò)濾后收集研磨液。（2）去除雜質(zhì)：利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中 溶解度溶解度 不同，去除雜質(zhì)。（3）DNA析出：在處理后的濾液中加入 等體積、冷卻的酒等體積、冷卻的酒精精 溶液，析出DNA

2、。（4）DNA的鑒定：加入 二苯胺二苯胺 試劑，沸水浴，出現(xiàn)淺藍(lán)色。二、PCR技術(shù)：全稱是 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。1.PCR原理：利用了DNA的熱變性熱變性原理，通過(guò)控制溫度溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。2.PCR反應(yīng)的條件：緩沖液緩沖液； DNA模板； 兩種引兩種引物物； 四種脫氧核苷酸；Taq DNA聚合酶聚合酶。 3.PCR的反應(yīng)過(guò)程 （1）變性：溫度上升到90以上，雙鏈DNA在熱作用下，氫鍵氫鍵斷裂，形成兩條單鏈兩條單鏈DNA。 （2）復(fù)性：溫度下降到50左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)堿基互補(bǔ)配對(duì)配對(duì)原則與兩條單鏈DNA結(jié)合。 （3）延伸：溫度上升到 72 左右，在 TaqDNA聚合

3、聚合 酶的作用下，以 四種脫氧核糖核苷酸四種脫氧核糖核苷酸 為原料，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，合成DNA新鏈。 4.PCR擴(kuò)增的方向：合成DNA方向是從子鏈的5端向3端延伸。 5. DNA含量的測(cè)定 （1）原理：DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA含量含量有關(guān)。 （2）過(guò)程：稀釋稀釋對(duì)照調(diào)零測(cè)定測(cè)定計(jì)算。 三、血紅蛋白的提取和分離三、血紅蛋白的提取和分離1.凝膠色譜法和電泳的原理(1)凝膠色譜法：不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢較慢；相對(duì)分子量較大相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝

4、膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外移動(dòng)，路程較短較短，移動(dòng)速度較較快快。(2)電泳：利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異帶電性質(zhì)的差異 以及分子本身的 大小大小 、形狀、形狀 不同使帶電分子產(chǎn)生不同的 遷遷移速度移速度 。2.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)操作步驟 （1）樣品處理：紅細(xì)胞的 洗滌洗滌 血紅蛋白血紅蛋白的釋放分離血紅蛋白溶液 透析透析 。 （2） 凝膠色譜操作： 凝膠色譜柱的制作凝膠色譜柱的制作 凝膠色譜柱的裝填樣品的加入和洗脫 SDS聚丙烯酰胺凝膠電聚丙烯酰胺凝膠電泳泳 。DNA的粗提取與鑒定1.基本原理：（1）DNA在NaCl溶液中的溶解度隨氯化鈉溶液濃度的變化而改變，DNA在0.14

5、 molL的NaCl溶液中溶解度最低。（2）DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。（3）DNA不被蛋白酶所水解。2.方法目的：3.兩次加入蒸餾水的目的 第一次目的是使成熟的雞血細(xì)胞漲破釋放出DNA；第二次目的是稀釋NaCl溶液，使DNA從溶液中析出。預(yù)冷的酒精溶液具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：a.抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解； b.降低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出； c.低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少斷裂。PCR技術(shù)1.PCR原理：利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解旋與結(jié)合。2.DNA的合成方向DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模ǔNA的羥基末端稱為3端，而磷

6、酸基團(tuán)的末端稱為5端。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸。3.PCR的反應(yīng)過(guò)程PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。4.細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制和PCR比較5.PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用 P

7、CR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。這項(xiàng)技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問(wèn)題，被廣泛地應(yīng)用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定等各方面。 6.擴(kuò)增DNA含量的測(cè)定方法（1）稀釋：2L PCR反應(yīng)液加入98L蒸餾水，將樣品進(jìn)行50倍稀釋。（2）對(duì)照調(diào)零：以蒸餾水作對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。（3）測(cè)定：取DNA稀釋液100L至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值。（4）計(jì)算：DNA含量（g/mL）=50（260nm的讀數(shù)）稀釋倍數(shù) a.理

8、論上DNA擴(kuò)增呈指數(shù)增長(zhǎng)，即一條DNA片段循環(huán)n次后數(shù)目為2n。b.PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在20儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。c.通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚和結(jié)合，現(xiàn)在的PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺(tái)能夠自動(dòng)控制溫度的儀器。 血紅蛋白的提取和分離1.凝膠色譜法凝膠色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成的，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快；相

9、對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量較小的分子后流出。2.電泳電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物大分子，如多肽、蛋白質(zhì)、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電；在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。3.如何測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量 使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電

10、泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測(cè)定未知蛋白質(zhì)的分子量。DNA在氯化鈉溶液中溶解度有二重性，隨著氯化鈉溶液濃度的變化而變化。（1）請(qǐng)?jiān)谙铝新然c溶液中選出能使DNA析出最徹底的一種 和溶解度最高的一種 。 A.0.14 mol/LB.2 mol/LC.0.15 mol/LD.0.3 mol/L（2）DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些物質(zhì)卻可以溶于酒精溶液，利用這一原理可以，可以推測(cè)溶于酒精中的物質(zhì)可能有。（3）利用DNA與變藍(lán)色的特性，將該物質(zhì)作為鑒定的試劑。其實(shí)驗(yàn)過(guò)程要點(diǎn)是向放有的試管中加入4mL的?；旌暇鶆蚝?，將試管置于5 min，待試管，觀察試管中溶液顏色的變化，這個(gè)實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明DNA耐溫。DNA分子能溶于NaCl溶液，在較高濃度和較低濃度時(shí)都可以溶解，而在0.14 mol/L濃度下，溶解度最低，故可在該濃度時(shí)使DNA分子析出而得以粗提取。DNA分子不溶于冷酒精，利用該特性，可以去除其中的雜質(zhì)，以進(jìn)一步純化DNA。DNA溶液中加入二苯胺，在水浴加熱時(shí)，會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色的顏色反應(yīng)，所以可用該方法鑒定DNA分子。 （1）AB（2）除去雜質(zhì)某些脂類、蛋白質(zhì)、糖類或其他大分子物質(zhì) （3）二苯胺DNADNA二苯胺試劑沸水中水浴加熱冷卻后高