大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌感染斑馬魚研究本科生畢業(yè)論文

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1、 本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 論 文 題 目：大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌 感染斑馬魚研究 姓 名： 院 系： 生命科學(xué)學(xué)院 專 業(yè)： 生物技術(shù) 年 級(jí)、班 組： 06級(jí)3（1）班 指 導(dǎo) 教 師： 畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)書 設(shè)計(jì)（論文）題目 細(xì)菌感染斑馬魚研究 專業(yè)、班級(jí) 生物技術(shù)06生31 學(xué)生姓名 指導(dǎo)教

2、師姓名、職稱 下發(fā)日期 2009年12月1日 （任務(wù)起止日期：2009 年 12 月 1 日至 2010 年 5 月 30 日） 設(shè)計(jì)（論文）的主要內(nèi)容與要求及其主要技術(shù)指標(biāo)： 主要內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚為研究對(duì)象，用細(xì)菌感染斑馬，連續(xù)觀察一個(gè)星期，統(tǒng)計(jì)致死率。 主要技術(shù)指標(biāo)：1.靜水式試驗(yàn) 2.細(xì)菌對(duì)斑馬魚致病性癥狀的觀察及記錄 3.獲得一星期的LC50 進(jìn) 度 安 排 序號(hào) 畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）工作進(jìn)度 日期（起止周數(shù)） % 1 收集有關(guān)實(shí)驗(yàn)資料，材

3、料及實(shí)驗(yàn)方法摸索 4月14日－19日 5 3 細(xì)菌對(duì)斑馬魚致病性的預(yù)實(shí)驗(yàn) 4月27日—30日 10 4 細(xì)菌對(duì)斑馬魚致病性的預(yù)實(shí)驗(yàn) 5月3日－9日 10 5 細(xì)菌對(duì)斑馬魚致病性的預(yù)實(shí)驗(yàn) 5月11日—13日 10 6 細(xì)菌對(duì)斑馬魚致病性的預(yù)實(shí)驗(yàn) 5月14日—15日 10 7 細(xì)菌對(duì)斑馬魚致病性的預(yù)實(shí)驗(yàn) 5月16日—17日 20 8 細(xì)菌對(duì)斑馬魚致病性的正式實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 5月18日 5 9 細(xì)菌對(duì)斑馬魚致病性的正式實(shí)驗(yàn) 5月18—20日 5 10 完成實(shí)驗(yàn)總結(jié)和畢業(yè)論文 5月 15

4、 同組設(shè)計(jì)（論文）者： 系意見： 簽字： 年 月 日 學(xué)院負(fù)責(zé)人意見： 簽字： 年 月 日 注：1.此任務(wù)書由指導(dǎo)教師填寫。2.此任務(wù)書最遲必須在第七學(xué)期16周之前下達(dá)給學(xué)生。3.此表由院收集存檔，以備教務(wù)處檢查。 本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 開 題 報(bào) 告 書 論 文 題 目：大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌 感染斑馬魚研究 姓 名： 院

5、 系： 生命科學(xué)學(xué)院 專 業(yè)： 生物技術(shù) 年級(jí)、 班組： 06級(jí)31班 指 導(dǎo) 教 師： 畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）開題報(bào)告表 課題題目 大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌感染斑馬魚研究 指導(dǎo)教師 職稱 副教授 課題組成員 畢業(yè)生年級(jí) 06生31 完成時(shí)間 2010年4月14日 立 題 依 據(jù) 1． 研究的目的和意義 目的：檢測(cè)弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌，對(duì)斑馬魚的致病性，并獲得致死溫度和致死劑量

6、。 意義：斑馬魚是一種亞熱帶觀賞魚類，具有個(gè)體小，產(chǎn)卵周期小，產(chǎn)卵量高，體外受精與發(fā)育等特點(diǎn)，同時(shí)由于其與人類基因組具有較高相似性，也具有較完整的獲得性和天然細(xì)胞免疫系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚為模式動(dòng)物，分析大腸桿菌的的致病性。 2． 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展及分析 大腸桿菌（Escherichia coli） 革蘭氏陰性短桿菌，大小0.51～3微米。周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢。大腸桿菌是細(xì)菌，屬于原核生物；具有由肽聚糖組成的細(xì)胞壁，只含有核糖體簡(jiǎn)單的細(xì)胞器，沒有細(xì)胞核有擬核；細(xì)胞質(zhì)中的質(zhì)粒常用作基因工程中的運(yùn)載體。培養(yǎng)基中加入伊紅美藍(lán)遇大腸桿菌，菌落呈深紫色，并有金屬光澤，可鑒別大腸桿菌是否

7、存在。大腸桿菌的代謝類型是異養(yǎng)兼性厭氧型。人體與大腸桿菌的關(guān)系：在不致病的情況下（正常狀況下），可認(rèn)為是互利共生（一般高中階段認(rèn)為是這種關(guān)系）；在致病的情況下，可認(rèn)為是寄生。 該菌對(duì)熱的抵抗力較其他腸道桿菌強(qiáng)，55℃經(jīng)60分鐘或60℃加熱15分鐘仍有部分細(xì)菌存活。在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在溫度較低的糞便中存活更久。 當(dāng)前大腸桿菌病給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)的損失越來(lái)越大，其難于治愈、死亡率高、極易復(fù)發(fā)等臨床特點(diǎn)，正困擾著基層廣大養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)工作者。 大腸桿菌具有很多毒力因子，包括內(nèi)毒素，莢膜，〣型分泌系統(tǒng)，黏附素和外毒素等。 立 題 依 據(jù) 弗氏檸檬酸桿菌革

8、蘭氏陰性，通常以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。兼性厭氧。有呼吸和發(fā)酵兩種類型的代謝。在普通肉胨瓊脂上的菌落一般直徑2～4mm，光滑、低凸、濕潤(rùn)、半透明或不透明，灰色，表面有光澤，邊緣整齊。偶爾可見粘液或粗糙型。氧化酶陰性。接觸酶陽(yáng)性?；苡袡C(jī)營(yíng)養(yǎng)，能利用檸檬酸鹽作為惟一碳源。硝酸鹽還原到亞硝酸鹽。沒有賴氨酸脫羧酶。不產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶、明膠酶、脂肪酶和DNA酶。不分解藻朊酸鹽和果膠酸鹽。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性 3．主要參考文獻(xiàn) [1]康白.與正常微生物群有關(guān)的新概念.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,1992,4(4):1-5 [2]桂遠(yuǎn)明,何幽峰,吳垠等.生態(tài)制品(Jy10、Jy31復(fù)合制劑)飼料添加劑對(duì)

9、提高鯉抗病力的研究.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,1994,6(6):27-33 [3] Jesse D M, Melody N N. Zebrafish as a model host for streptococcalpathogenesis. Acta Tropica, 2004, 91(1): 53-68 [4]Pressley M E, Phelan III P E,Eckhard W P,et al. Pathogen-esis and inflammatory response toEdwardsiella tardainfec-tion in the zebrafish[J]. Dev

10、elopmental & Comparative Im-munol,2005,29(6):501-513 [5] 陳　陽(yáng),吳　迪,陳雪燕,趙煥燦,扈鴻霞,Cheick A Diakite,方維煥*豬鏈球菌2型分離株對(duì)野生斑馬魚的致病性*動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(6):1-5 [6]濮俊毅，黃新新，陸承平，2007用斑馬魚檢測(cè)豬鏈球菌2 型的致病力，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)40(11):2655-2658 研究?jī)?nèi)容 研究的主要內(nèi)容： 1. 弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌對(duì)斑馬魚毒性的實(shí)驗(yàn) 2. 獲得弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌對(duì)斑馬魚的致死率 3. 實(shí)驗(yàn)期間斑馬魚的觀察及記錄 技術(shù)路線 和實(shí)

11、施方案 1． 購(gòu)買斑馬魚，置于蒸餾水中飼養(yǎng)，同批次斑馬魚馴養(yǎng)一周。 2． 參照參考文獻(xiàn)，分批設(shè)計(jì)不同預(yù)實(shí)驗(yàn)濃度，溫度大腸桿菌。 3． 針對(duì)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的濃度，溫度。保證實(shí)驗(yàn)條件與預(yù)實(shí)驗(yàn)及以下實(shí)驗(yàn)操作時(shí)條件一致。 4． 實(shí)驗(yàn)開始后開始觀察斑馬魚，記錄魚死亡數(shù)目，時(shí)間，并及時(shí)清理死魚。 5． 實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)充氣 預(yù)期結(jié)果 1. 預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得實(shí)驗(yàn)的濃度，溫度。 2. 正式實(shí)驗(yàn)獲得致死劑量。 3. 獲得魚在試驗(yàn)期間各種現(xiàn)象，整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算結(jié)果。 4. 撰寫畢業(yè)論文一篇。 指導(dǎo)教師意見 （簽名） 年 月 日 院系

12、意見 （簽名） 年 月 日 大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌感染斑馬魚研究 摘要：以野生斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，分別采用大腸桿菌（Escherichia coli）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii），以細(xì)菌濃度108-1010cfu之間，在25℃、28℃飼養(yǎng)條件下進(jìn)行感染試驗(yàn)。結(jié)果表明，斑馬魚在25℃時(shí)，大腸桿菌濃度4.0108的感染致死率為66.7%，半致死時(shí)間（LT50）為48h；濃度為4.0109致死率為66.7%，LT50為20h；濃度1.61010致死率為100%，LT50為7min；在28℃，

13、大腸桿菌濃度為4.0109致死率為66.7%，LT50為15h；濃度為8.0109致死率為66.7%，LT50為9h。弗氏檸檬酸桿菌濃度4.01010時(shí)25℃致死率為66.7%，LT50為27h；濃度2.01010時(shí)，28℃致死率為66.7%，LT50為20h。以上結(jié)果表明大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌可以感染斑馬魚，并與飼養(yǎng)溫度，菌液濃度有關(guān)。 關(guān)鍵詞：大腸桿菌；弗氏檸檬酸桿菌；斑馬魚；致死率 Escherichia coli andcitrobacter freundii infection of the zebrafish Experimental Study Abstrac

14、t: Wild zebrafish as experimental animal models were used to E. coli (Escherichia coli), Citrobacter freundii (Citrobacter freundii), to between 108-1010cfu bacterial concentration, in 25 ℃, 28 ℃ keeping infection under the conditions of test. The results show that zebra fish at 25 ℃, the concentrat

15、ion of 4.0 108 E. coli infection death rate was 66.7%, median lethal time (LT50) is 48h; concentration of 4.0 109 death rate was 66.7%, LT50 was 20h; concentration of 1.6 1010 death rate was 100%, LT50 was 7min; at 28 ℃, E. coli concentration of 4.0 109 death rate was 66.7%, LT50 was 15h; concen

16、tration of 8.0 109 death rate was 66.7%, LT50 was 9h. Citrobacter freundii concentration of 4.0 1010 when the death rate of 25 ℃ 66.7%, LT50 was 27h; concentration of 2.0 1010 hours, 28 ℃ death rate was 66.7%, LT50 to 20h. These results suggest that E. coli, Citrobacter freundii can infect zebra

17、fish, and with raising the temperature, bacteria concentration. Key words: Escherichia coli; citrobacter freundii;zebrafish;Infection;Fatality rate; 目錄 引言 1 1材料與方法 2 1.1主要試劑 2 1.2菌株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2 1.3斑馬魚浸泡試驗(yàn) 2 1.3.1平板計(jì)數(shù) 2 1.3.2 OD值的測(cè)定 2 1.3.3斑馬魚創(chuàng)傷處

18、理 2 1.3.4浸泡斑馬魚 3 1.4 細(xì)菌分離與鑒定 3 2結(jié)果與分析 3 2.1平板計(jì)數(shù) 3 2.2菌液OD值 3 2.3 致死情況 4 2.4 斑馬魚的臨床及病理變化 6 3.討論 7 致謝 8 參考文獻(xiàn) 8 引言 本實(shí)驗(yàn)中所使用的大腸桿菌來(lái)自于健康禽類的腸道，腸道菌群的組成是多種多樣的，而且每種細(xì)菌的數(shù)量及分布各不相同。腸道內(nèi)的細(xì)菌根據(jù)所起作用可以分為原籍菌群(Autocht honous flora)和外籍菌群(Allocht honous flora)，或分為固有菌群和非固有菌群等[1]。弗氏檸檬酸桿菌來(lái)

19、自于魚類腸道。 魚類對(duì)原籍菌群及外籍菌群的免疫作用是不同的。當(dāng)腸道菌群進(jìn)入斑馬魚腸道中，一些適應(yīng)于腸道環(huán)境的種類(一般為厭氧菌)在腸道內(nèi)成為優(yōu)勢(shì)種群，定植下來(lái)成為原籍群。所以寄主的免疫活性細(xì)胞并不將它視為“非己”，因此并不引起或僅產(chǎn)生低水平的免疫反應(yīng)。相反，魚類對(duì)外籍菌群的免疫反應(yīng)是強(qiáng)烈的。侵入人、動(dòng)物體內(nèi)的外籍菌很容易引起宿主產(chǎn)生抗體和致敏的免疫活性細(xì)胞。鯉進(jìn)食生態(tài)制品后，免疫力增強(qiáng)，其白細(xì)胞吞噬率、白細(xì)胞吞噬指數(shù)、E玫瑰花環(huán)形成率等指標(biāo)明顯高于對(duì)照組[2] 大腸桿菌（Escherichia coli） 革蘭氏陰性短桿菌，大小0.51～3微米。周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢。大腸桿菌是細(xì)菌

20、，屬于原核生物；具有由肽聚糖組成的細(xì)胞壁，只含有核糖體簡(jiǎn)單的細(xì)胞器，沒有細(xì)胞核有擬核；該菌對(duì)熱的抵抗力較其他腸道桿菌強(qiáng)，55℃經(jīng)60分鐘或60℃加熱15分鐘仍有部分細(xì)菌存活。在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在溫度較低的糞便中存活更久。當(dāng)前大腸桿菌病給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)的損失越來(lái)越大，其難于治愈、死亡率高、極易復(fù)發(fā)等臨床特點(diǎn)，正困擾著基層廣大養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)工作者。大腸桿菌具有很多毒力因子，包括內(nèi)毒素，莢膜，〣型分泌系統(tǒng)，黏附素和外毒素等。 弗氏檸檬酸桿菌(citrobacter freundii)革蘭氏陰性，通常以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。兼性厭氧。有呼吸和發(fā)酵兩種類型的代謝。在普通肉胨瓊脂上的菌落一般直徑2～4m

21、m，光滑、低凸、濕潤(rùn)、半透明或不透明，灰色，表面有光澤，邊緣整齊。偶爾可見粘液或粗糙型。氧化酶陰性。接觸酶陽(yáng)性?；苡袡C(jī)營(yíng)養(yǎng)，能利用檸檬酸鹽作為惟一碳源。硝酸鹽還原到亞硝酸鹽。沒有賴氨酸脫羧酶。不產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶、明膠酶、和DNA酶。不分解藻朊酸鹽和果膠酸鹽。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性。弗氏檸檬酸桿菌對(duì)河蟹的病原性、并導(dǎo)致其病理變化，藥物對(duì)該菌的敏感試驗(yàn)及生產(chǎn)中藥物治療效果。從垂死的病蟹肝胰臟中分離得到可疑病菌，經(jīng)人工感染試驗(yàn)證實(shí)此菌導(dǎo)致健康蟹發(fā)病死亡。該菌可導(dǎo)致河蟹的肝胰腺、鰓等發(fā)生病理變化，最終引起敗血癥而死亡[10]。 斑馬魚 (Danio rerio)是一種亞熱帶觀賞魚類，

22、具有個(gè)體小、產(chǎn)卵周期短、產(chǎn)卵量高、體外受精與發(fā)育等特點(diǎn)，同時(shí)由于其與人類基因組具有較高相似性，也具有較完整的獲得性和天然細(xì)胞免疫系統(tǒng)[3]，是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織推薦的五大試驗(yàn)魚種之一，試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)可以在國(guó)際上被認(rèn)可。斑馬魚作為遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)研究的模式生物已經(jīng)得到了較為廣泛的應(yīng)用[4]。斑馬魚亦存在著較為完整的特異性免疫系統(tǒng)[5]，而且體本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為今后可以通過(guò)控制水體的微生物的組成來(lái)提高魚苗的成活率，或人為地添加某些定植力強(qiáng)的有益菌群，令其在魚苗腸道內(nèi)產(chǎn)生一定的定植抗力，從而為達(dá)到提高魚體抗病力的目的提供一定的科學(xué)參考。 1材料與方法 1.1主要試劑 磷酸二氫鈉產(chǎn)自于合

23、肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠，蛋白胨產(chǎn)自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，牛肉浸膏來(lái)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，氯化鈉來(lái)自無(wú)錫市亞盛化工有限公司，磷酸氫二鈉來(lái)自于合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠，瓊脂粉來(lái)自于天津市福晨化學(xué)試劑廠。 1.2菌株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)所用的弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌由徐州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，保存。所用大腸桿菌菌株來(lái)自于禽類。試驗(yàn)所用的斑馬魚為市場(chǎng)銷售的藍(lán)條紋斑馬魚，采用充分曝氣的清水飼養(yǎng),并在水循環(huán)和增氧條件下生活1周以適應(yīng)環(huán)境。 1.3斑馬魚浸泡試驗(yàn) 1.3.1平板計(jì)數(shù) 將弗氏檸檬酸桿菌，大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，吸光度在之間，400

24、0轉(zhuǎn)/min離心10min,收集菌體，PBS洗1次，再離心一次，在原液濃度基礎(chǔ)上稀釋10-1—10-88個(gè)梯度，取最低濃度的菌液涂基本培養(yǎng)基平板，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，計(jì)算平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)即cfu；計(jì)算出菌液濃度。 1.3.2 OD值的測(cè)定 用分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌液的吸光度，即OD值。每種菌共測(cè)定三個(gè)稀釋倍數(shù)，即稀釋2倍，稀釋4倍，稀釋10倍。 1.3.3斑馬魚創(chuàng)傷處理 用刀片在斑馬魚脊椎上輕輕劃一傷口，制造創(chuàng)傷，可增加浸泡時(shí)的感染幾率。

25、 1.3.4浸泡斑馬魚 斑馬魚浸泡實(shí)驗(yàn)分為飼養(yǎng)溫度25℃、28℃兩組，對(duì)照組則浸泡等量0.65%氯化鈉溶液。用菌濃度108—1010 cfu弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌細(xì)菌進(jìn)行感染試驗(yàn)，每組3條，浸泡時(shí)間為10min或15min，各組分開飼養(yǎng)，定

26、時(shí)觀察斑馬魚的發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察5-7d，記錄每條魚的死亡時(shí)間，計(jì)算致死率和半致死時(shí)間(LT50)。重復(fù)兩次實(shí)驗(yàn)，取兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。 1.4 細(xì)菌分離與鑒定 將死亡斑馬魚在70%L酒精中浸泡1min后,無(wú)菌條件下剖開腹部,用接種環(huán)沾取腹腔液接種至基本培養(yǎng)基平板。在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜后,用長(zhǎng)出的菌落與相對(duì)應(yīng)的菌落進(jìn)行比較分析。 2結(jié)果與分析 大腸桿菌菌液稀釋8個(gè)濃度梯度后，菌落數(shù)平均值為4,，即濃度為4109 cfu/ml 弗氏檸檬酸桿菌菌液稀釋8個(gè)濃度梯度后，菌落數(shù)平均值為10即濃度為10109 cfu/ml 2.1平板計(jì)數(shù)

27、 將原大腸桿菌菌液稀釋8個(gè)濃度梯度后涂平板，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h后，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，取平均值后為4，即原菌液濃度為4109 cfu/ml， 同樣弗氏檸檬酸桿菌：平均值10, 即原菌液濃度為10109 cfu/ml。 2.2菌液OD值 表1大腸桿菌在的OD值 Table 1 the bacteria concentration OD 濃度 2.0109 1.0109 2.0108 OD值 1.229 0.698 0.265

28、 大腸桿菌菌液的OD值隨濃度的降低而減小，濃度為2.0109 （稀釋2倍），OD值為1.229,濃度為2.0109（稀釋4倍），OD值為0.698,濃度為2.0108 （稀釋10倍），OD為0.265 表2弗氏檸檬酸桿菌的OD值 Table 2 the bacteria concentration OD 項(xiàng)目 5.0109 2.5109 1.0109 OD值 1.319 0.788 0.355 弗氏檸檬酸桿菌菌液的OD值隨濃度的降低而減小，濃度為5.0109 （稀釋2倍），OD值為1.319,濃度為2.5109（稀釋4倍），OD值為0.788,濃度為1.0109 （稀釋

29、10倍），OD為0.355。 2.3 致死情況 表3飼養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，大腸桿菌對(duì)斑馬魚的致死率和時(shí)間 Table 2 Rearing temperature of 25 ℃, the mortality rate and time of immersion in zebrafish for E.coli 濃度 致死率 4.0108 (cfu/ml) 4.0109 (cfu/ml) 1.61010 (cfu/ml) 10min 66.7%（2/3） 66.7%（2/3） 100%(3/3) LT50 49h 20h 7min 大腸

30、桿菌在25℃時(shí)，濃度為4.0108 (cfu/ml)時(shí)，致死率為66.7%，半致死時(shí)間為49h，濃度為4.0109 (cfu/ml)時(shí)，致死率為66.7%，半致死時(shí)間為20h，濃度為1.61010(cfu/ml)時(shí)，致死率為100%，半致死時(shí)間為7min。 表4飼養(yǎng)溫度為28℃時(shí)，大腸桿菌對(duì)斑馬魚的致死率和時(shí)間 Table 3 Rearing temperature of 28 ℃, the mortality rate and time of immersion in zebrafish for E.coli 濃度 致死率 1.6109 (cfu/ml) 8.

31、0109 (cfu/ml) 10min 66.7%(2/3) 33.3（1/3） 15min 66.7%（2/3） 66.7（2/3） LT50 15h 9h 大腸桿菌在28℃時(shí)，浸泡15min，濃度為1.6109 (cfu/ml)時(shí)，致死率為66.7%，半致死時(shí)間為15h，濃度為8.0109 (cfu/ml)時(shí)，致死率為66.7%，半致死時(shí)間為9h。 表5弗氏檸檬酸桿菌的對(duì)斑馬魚的致死率和時(shí)間 Table 5 Rearing temperature, the mortality rate and time of immersion in zebrafish for

32、citrobacter freundii 濃度、溫度 15min 4.01010 (cfu/ml) 25℃ 2.01010(cfu/ml) 28℃ 致死率 66.7（2/3） 66.7（2/3） LT50 27h 20h 弗氏檸檬酸桿菌在25℃時(shí)，濃度為1.01010 (cfu/ml)時(shí),致死率為66.7%，半致死時(shí)間為27h。在28℃時(shí)，濃度為2.01010 (cfu/ml)時(shí)，致死率為66.7%，半致死時(shí)間為20h。 大腸桿菌：當(dāng)飼養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，浸泡時(shí)間為10min,菌液濃度為4108cfu時(shí)，96h內(nèi)致死率為66.7%，半致死

33、時(shí)間49h；當(dāng)濃度為4109cfu時(shí)，96h內(nèi)致死率為66.7%，半致死時(shí)間20h；濃度為1.61010 cfu，10min致死率100%，半致死時(shí)間為7min。在同一溫度下，隨著濃度的增大，半致死時(shí)間縮短；濃度為4108cfu，4109cfu時(shí)，致死率都為66.7%，但當(dāng)濃度增大到1.61010 cfu時(shí)，在浸泡的10min內(nèi)，致死率為100%，致死率增大（見表3,4）。 而當(dāng)飼養(yǎng)溫度上升為28℃時(shí)，浸泡時(shí)間為15min，菌液濃度為4109cfu，浸泡10min，96h內(nèi)致死率為66.7%，，半致死時(shí)間為15h；濃度為8109 cfu，96h內(nèi)致死率100%,半致死時(shí)間為9h。在28℃下，

34、濃度越高，致死率越高，半致死時(shí)間也縮短（見表3,4）。 弗氏檸檬酸桿菌：當(dāng)飼養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，浸泡時(shí)間為15min,菌液濃度為4.01010cfu時(shí)，96h致死率為66.7%，半致死時(shí)間27h；當(dāng)飼養(yǎng)溫度為28℃時(shí),濃度為2.01010 cfu，96h致死率66.7%，半致死時(shí)間20h。25℃時(shí)菌液濃度為28攝氏度時(shí)菌液濃度的2倍，但28℃時(shí)的半致死時(shí)間卻短于25℃時(shí)的。（見表5）。 綜上所述，菌濃度越高，斑馬魚越易被感染，菌濃度為8109cfu，是研究大腸桿菌感染斑馬魚免疫的最佳濃度，菌濃度為2.01010cfu是研究感染弗氏檸檬酸桿菌對(duì)斑馬魚免疫的最佳濃度，且斑馬魚感染后在28℃飼養(yǎng)比

35、在25℃現(xiàn)象更明顯。 2.4 斑馬魚的臨床及病理變化 弗氏檸檬酸桿菌感染后 正常對(duì)照組 大腸桿菌感染后 感染后死亡的斑馬魚傷口發(fā)紅，腮部泛紅，腹部膨脹，剖檢觀察到，肝臟呈現(xiàn)蒼白色，腹腔內(nèi)有較多積水，而空白對(duì)照組并無(wú)以上現(xiàn)象。 3.討論 本實(shí)驗(yàn)中所使用的大腸桿菌來(lái)自于健康禽類，當(dāng)飼養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，浸泡時(shí)間為10min,菌液濃度為4108cfu時(shí)，致死率為66.7%（2/3），半致死時(shí)間49h，濃度為4109cfu，致死率為66.7%（2/3），半致死時(shí)間20h,濃度為1.61010 cfu，致死率100%（3/3），半致

36、死時(shí)間為7min。當(dāng)飼養(yǎng)溫度為28℃時(shí)，菌液濃度為8109cfu，浸泡10min，致死率為66.7%（2/3），，半致死時(shí)間15h，濃度為4109 cfu，浸泡15min,致死率100%（3/3），半致死時(shí)間為9h。同一溫度下，菌液的濃度越高，半致死時(shí)間越短，致死率總體也是提高的。不同溫度，同一濃度下，28℃的半致死時(shí)間短于25℃時(shí)的。但對(duì)于25℃時(shí)，濃度為1.61010 cfu，在浸泡的10min內(nèi)，實(shí)驗(yàn)魚全部死亡，半致死時(shí)間為7min，這種情況與菌液濃度過(guò)高有關(guān)，由于濃度過(guò)高，魚浸泡在其中，缺少氧氣，最終死亡，這與本實(shí)驗(yàn)中感染死亡不同，此種情況斑馬魚不是由于斑馬魚被細(xì)菌感染而造成的死亡。

37、 本實(shí)驗(yàn)中所使用的弗氏檸檬酸桿菌來(lái)自于魚類，浸泡15min，在25℃時(shí)，濃度為4.01010cfu時(shí)，死亡率為66.7%，半致死時(shí)間為27h，當(dāng)溫度為28℃時(shí)，濃度為2.01010 cfu，死亡率為66.7%，半致死時(shí)間為20h。兩種條件下的致死率雖然相同，但致死時(shí)間卻不同，濃度為4.01010cfu的菌液半致死時(shí)間高于濃度為2.01010 cfu的菌液，因此半致死時(shí)間不僅與濃度有關(guān)，還與溫度有關(guān)，結(jié)合大腸桿菌的數(shù)據(jù)可以得出，28℃更利于菌在魚體內(nèi)的繁殖。 在攻毒方式上,Pressley M E等[7]用遲鈍愛德華氏菌(E. tarda)對(duì)斑馬魚采用了浸泡、皮膚損傷后浸泡和腹腔注射接種等途徑

38、,發(fā)現(xiàn)在皮膚未破損的情況下,浸泡法不能成功攻毒。Novoa B等[8]用病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)采用浸泡法攻毒,效果同樣不理想。本試驗(yàn)同樣嘗試了這3種途徑,最終僅腹腔注射有效,表明SS2一般不能通過(guò)鰓與皮膚途徑直接感染斑馬魚,但某些細(xì)菌可感染受環(huán)境應(yīng)激后的斑馬魚[9]。在飼養(yǎng)條件上,本研究發(fā)現(xiàn)魚群的生活溫度和細(xì)菌毒力密切相關(guān),水溫處于25℃以下時(shí),106cfu的細(xì)菌在腹腔接種攻毒后不能造成斑馬魚死亡,這可能是由于在較低溫度下細(xì)菌在魚體內(nèi)的繁殖緩慢,從而被魚的免疫系統(tǒng)有效清除所致[10]。 Jesse 等[6]探討了斑馬魚背肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射和浸泡等接種途徑對(duì)LD50 的影響。筆者

39、發(fā)現(xiàn)，背肌內(nèi)注射難以確保注射劑量，注射液體易回溢；此外拔鱗浸泡雖是魚類免疫常用的途徑，但由于斑馬魚體型較小，應(yīng)激大，影響最終結(jié)果。相比而言，腹腔內(nèi)注射較易操作，且應(yīng)激反應(yīng)較小，注射后8 h 之內(nèi)不出現(xiàn)死亡，是最佳的接種途徑[11]。 斑馬魚在浸泡的10或15min內(nèi)死亡，是由于菌液濃度過(guò)高，魚在浸泡過(guò)程中缺氧而死，并非本實(shí)驗(yàn)所研究的感染而死。因此，如果斑馬魚在浸泡過(guò)程中死亡率過(guò)高，此菌液濃度不能用于大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌對(duì)斑馬魚致病性的實(shí)驗(yàn)研究。 致謝 本論文是在徐州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室完成的。從選題，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，撰寫到成文都是在呂愛軍副教授的精心指導(dǎo)下完成的。呂老師知識(shí)淵博

40、，治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，工作勤奮執(zhí)著，是我學(xué)習(xí)的楷模。衷心感謝他這幾個(gè)月來(lái)對(duì)我實(shí)驗(yàn)上的指導(dǎo)和幫助。 同時(shí)也感謝碩士研究生鄭璐師姐在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予的幫助。 參考文獻(xiàn) [1] 康白.與正常微生物群有關(guān)的新概念.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,1992,4(4):1-5 [2] 桂遠(yuǎn)明,何幽峰,吳垠等.生態(tài)制品(Jy10、Jy31復(fù)合制劑)飼料添加劑對(duì)提高鯉抗病力的研究.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,1994,6(6):27-33 [3] 李華，邢殿樓，白國(guó)福，李向暉 弗氏檸檬酸桿菌對(duì)河蟹致病性的研究，水生生物學(xué)報(bào)，第25卷第3期2 0 01年5月 [4] Abhinanda B,Sarkar G K, Kumar S

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45、、弗氏檸檬酸桿菌感染斑馬魚研究 論 文 內(nèi) 容 提 要 以野生斑馬魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用大腸桿菌（Escherichia coli）、弗氏檸檬酸桿菌（citrobacter freundii）進(jìn)行斑馬魚感染研究。分別以108-1010cfu濃度之間的細(xì)菌，在兩種種溫度（25℃，28℃）下進(jìn)行感染試驗(yàn)。結(jié)果表明，對(duì)于大腸桿菌大腸桿菌，在25℃時(shí)，用菌液濃度為4.0108的感染后，致死率為66.7%，半致死時(shí)間為48h；濃度為4.0109 時(shí)，致死率為66.7%，半致死時(shí)間為20h；1.61010時(shí)，致死率為100%，致死時(shí)間為7min

46、；在28℃，大腸桿菌濃度為4.0109 時(shí)，致死率為66.7%，半致死時(shí)間為15h；濃度為8.0109 時(shí)，斑馬魚的死亡率為66.7%，半致死時(shí)間為9h。而對(duì)于弗氏檸檬酸桿菌，在25℃時(shí)，菌液濃度為4.01010 時(shí)，致死率為66.7%，半致死時(shí)間為27h；濃度為2.01010 時(shí)，致死率為66.7%，半致死時(shí)間為20h。兩種菌對(duì)斑馬魚的致病性與培養(yǎng)溫度，菌液濃度有關(guān)。 指 導(dǎo) 教 師 意 見 評(píng)定成績(jī)： 指導(dǎo)教師 （簽名） 年 月 日 答 辯 小 組 意 見 論文答辯成績(jī)： 答辯組長(zhǎng)： （簽名） 年 月 日 院系意見 綜合評(píng)定成績(jī)： （簽名） 年 月 日 注：答辯小組意見包括答辯中主要問(wèn)題及回答的簡(jiǎn)要情況、投票結(jié)果、論文評(píng)語(yǔ)、論文成績(jī)。