掃描電鏡及其制樣技術(shù).ppt

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掃描電鏡技術(shù)TechniquesofScanningElectronMicroscope,一、掃描電鏡的基本結(jié)構(gòu)與成像原理二、掃描電鏡的特點(diǎn)三、掃描電鏡的生物樣品制備技術(shù)（一）樣品的常規(guī)制備方法（二）特殊樣品的制備方法,掃描電鏡技術(shù),掃描電鏡（ScanningElectronMicroscope，SEM）是繼光鏡和透射電鏡之后發(fā)展起來(lái)的一種電鏡，用于觀察物質(zhì)表面及斷面的三維形貌結(jié)構(gòu)和進(jìn)行微區(qū)成分分析。,一、掃描電鏡的基本結(jié)構(gòu)與成像原理,,1、SEM基本結(jié)構(gòu)及其作用,（１）電子光學(xué)系統(tǒng)電子槍：陰極、陽(yáng)極、柵極。陰極—通電加熱后產(chǎn)生電子束。陽(yáng)極—加速電子束。柵極—控制和會(huì)聚電子束流。電磁透鏡：會(huì)聚電子束，形成直徑5~10納米的電子束（即電子探針），照射于樣品上。,圖1-1掃描電鏡工作原理圖,（２）檢測(cè)系統(tǒng),①二次電子的來(lái)源及作用在樣品表面以下幾納米到幾十納米的區(qū)域，被入射電子（初級(jí)電子、一次電子）所激發(fā)出來(lái)的樣品原子中的外層電子，稱謂二次電子（次級(jí)電子）。SEM通常是由二次電子所形成的圖象來(lái)顯示生物樣品的表面形貌。,（２）檢測(cè)系統(tǒng),②二次電子檢測(cè)系統(tǒng)的組成及作用組成：檢測(cè)器（二次電子探頭）、光電倍增管、視頻放大器。作用：對(duì)二次電子進(jìn)行收集、放大和處理，以調(diào)制顯像管柵極電壓并成象。,圖1-1掃描電鏡工作原理圖,（３）電子偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)（掃描系統(tǒng)）,組成：掃描發(fā)生器、掃描線圈。作用：使鏡筒和顯像管內(nèi)的電子束分別進(jìn)行同步光柵狀掃描，最后在顯像管的熒光屏上顯示出完整圖象。,圖1-1掃描電鏡工作原理圖,2、影響圖象形成的因素,（1）傾斜角效應(yīng)——二次電子成像原理∵二次電子產(chǎn)率主要取決于電子束的入射角，而入射角又主要取決于樣品的傾斜程度。∴樣品的傾斜角效應(yīng)是影響圖象反差的主要因素?！郤EM圖象的反差主要是由樣品表面的凹凸?fàn)顟B(tài)決定的，越是凸出的部位產(chǎn)生二次電子的數(shù)量越多，圖象越明亮，反之則較暗。,圖1-2樣品傾斜對(duì)二次電子產(chǎn)率的影響,2、影響圖象形成的因素,（2）原子序數(shù)效應(yīng)原子序數(shù)效應(yīng)：樣品內(nèi)原子序數(shù)不同的元素，在圖象上也會(huì)形成一定的亮度差異，這種現(xiàn)象稱為原子序數(shù)效應(yīng)。對(duì)策：觀察生物樣品時(shí)，在樣品表面噴鍍一層原子序數(shù)高的金屬膜，可提高圖象質(zhì)量。,2、影響圖象形成的因素,（3）充放電效應(yīng)充電：當(dāng)初級(jí)電子轟擊干燥的生物樣品表面時(shí)，會(huì)因其導(dǎo)電性能差而發(fā)生電荷積累的充電現(xiàn)象，并對(duì)隨后到來(lái)的初級(jí)電子產(chǎn)生排斥，使電子散開(kāi)，且導(dǎo)致二次電子發(fā)射軌跡偏斜或雜亂。放電：轟擊區(qū)內(nèi)電子堆積，與鄰近區(qū)域間產(chǎn)生電位差，則可產(chǎn)生放電打火現(xiàn)象。充放電效應(yīng)：上述充、放電狀況造成圖象忽明忽暗或模糊不清等現(xiàn)象，稱為充放電效應(yīng)。對(duì)策：采用金屬鍍膜、導(dǎo)電膠粘貼樣品等導(dǎo)電處理，可減少充放電效應(yīng)的影響。,圖1-4血細(xì)胞充放電效應(yīng)圖例,二、掃描電鏡的特點(diǎn),,,（一）圖譜,（二）掃描電鏡的特點(diǎn),觀察表面形貌。圖象景深大，富有立體感。放大范圍廣，分辨率較高：放大倍數(shù)為數(shù)10倍~數(shù)10萬(wàn)倍；分辨率取決于電子探針的直徑，一般為5~10nm?？捎^察塊狀樣品：0.5~10cm3。樣品制備簡(jiǎn)單?？山Y(jié)合元素分析。,三、掃描電鏡生物樣品制備技術(shù),,（一）樣品的常規(guī)制備方法,取材→清洗→固定→清洗→脫水→干燥→金屬鍍膜→SEM觀察,,1、取樣取樣部位要準(zhǔn)確。取樣大小要適當(dāng)：常為≤1cm3。取樣操作要輕巧快捷：取樣要快，嚴(yán)防對(duì)樣品的擠壓損傷，以使樣品更近于活體狀態(tài)。樣品的基底部應(yīng)切割平整（以便于樣品粘貼），觀察面應(yīng)作好識(shí)別標(biāo)記。,,2、清洗（1）清洗的目的：充分暴露樣品觀察面的表面特征。（2）清洗液的選擇常規(guī)洗液——生理鹽水、PBS等緩沖液；特殊洗液——低濃度的蛋白水解酶或乙醇等，用于表面覆蓋著大量蛋白或脂類黏液的樣品（如胃、腸黏膜及乳腺組織等）的初級(jí)清洗。（3）清洗的方法浸泡清洗。震蕩清洗：一些粘著雜質(zhì)多而緊密的樣品（如胃、腸黏膜等），可利用震蕩器進(jìn)行震蕩清洗。離心清洗：游離細(xì)胞、微生物及其它微小生物樣品的清洗。（4）清洗的要求樣品要清洗干凈：換液數(shù)次，可在解剖鏡下檢查，直至干凈，以充分暴露表面特征。,3、固定（1）固定的目的保留樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)和外部形貌，使其更近于生活狀態(tài)。使組織硬化，以增強(qiáng)樣品在隨后的干燥過(guò)程中耐受表面張力變化的能力。提高樣品對(duì)鏡筒內(nèi)高真空和電子束轟擊的耐受力。（2）常用的固定劑戊二醛：常用濃度為1~4%。鋨酸：一般用1~2%濃度。（3）固定的方法先用戊二醛固定1至幾小時(shí)或更長(zhǎng)，經(jīng)緩沖液充分清洗后，再用鋨酸固定30~60分鐘。,,4、脫水（1）脫水的目的用低表面張力且易揮發(fā)的有機(jī)溶劑（乙醇、丙酮等）取代組織細(xì)胞中的游離水，使樣品在后續(xù)干燥處理時(shí)的表面張力減少。表1幾種液體的表面張力單位：達(dá)因/cm,,（2）脫水的方法PBS清洗3次，5~10min/次→乙醇梯度脫水到純乙醇，5~30min/級(jí)。（3）脫水的要求脫水要徹底；嚴(yán)防發(fā)生空氣干燥：在換液過(guò)程中，要始終保持樣品潤(rùn)濕，以免因表面張力變化而造成樣品的皺縮、塌陷或變形。,,5、干燥（1）干燥的目的徹底去除樣品中的脫水劑，使樣品干燥，以保護(hù)鏡筒高真空和樣品不變形。,（2）干燥的方法,1）空氣干燥法2）真空干燥法3）冷凍干燥法4）臨界點(diǎn)干燥法,,（2）干燥的方法1）空氣干燥法方法：把樣品放在空氣中，讓其中的脫水劑自然揮發(fā)掉，以達(dá)到干燥的目的。特點(diǎn)：脫水劑存在的低表面張力，仍使許多樣品發(fā)生變形或收縮，故本法是在缺乏其他條件下不得已采用的干燥方法。,,（2）干燥的方法2）真空干燥法方法：在真空的條件下使樣品中的脫水劑揮發(fā)掉。特點(diǎn)：效果與空氣干燥時(shí)相同，僅是干燥的速度較快。,,（2）干燥的方法3）冷凍干燥法特點(diǎn)：在干燥過(guò)程中由于不形成液-氣界面，所以由表面張力引起的樣品變形和損傷大為減少，因此干燥效果較好。缺點(diǎn)：冷凍過(guò)程有可能形成冰晶損傷。,圖3-1冷凍干燥法技術(shù)流程,,（2）干燥的方法4）臨界點(diǎn)干燥法①臨界點(diǎn)干燥的原理（圖3-2）,圖3-2臨界點(diǎn)干燥原理圖,,臨界點(diǎn)干燥的原理之小結(jié)臨界狀態(tài)的條件：密閉容器中的液體加熱達(dá)到一定的溫度（臨界溫度）。臨界狀態(tài)的特性：氣、液密度相等，相界消失；液體變成氣體，液體的表面張力消失為零；無(wú)論施加多大的壓力，氣體不會(huì)變成液體。臨界點(diǎn)干燥：利用臨界狀態(tài)下液體表面張力被消除的特性，使樣品中的液體氣化而最后完全干燥。,,②臨界干燥液的選擇——置換液與中間液置換液：在臨界點(diǎn)干燥器內(nèi)起臨界干燥作用的液體稱為置換液(表2)。表2某些液體的臨界特性中間液：醋酸異戊酯,,③臨界點(diǎn)干燥器的主要結(jié)構(gòu)（圖3-3）,圖3-3HCP-2型臨界點(diǎn)干燥器,,④臨界點(diǎn)干燥的操作程序,取樣,,固定,脫水,,,醋酸異戊酯,樣品入室,,注入液體CO2,,置換,,氣化,,放氣取樣,(15~30min或過(guò)夜）,,,,,(0~10℃),(0~10℃),(15~20℃)(35~40℃)(35~40℃)(10~20min)(5~10min)(30min),圖3-4臨界點(diǎn)干燥過(guò)程,,6、粘樣（樣品的粘貼）（1）目的：將樣品粘牢在樣品臺(tái)上。（2）粘樣材料雙面膠帶：用于粘貼基底部平整或顆粒狀的樣品。導(dǎo)電膠：是銀粉拌在低電阻樹脂內(nèi)制成的糊狀物，用于粘貼基底部不平整的樣品。,,7、金屬鍍膜在樣品表面噴鍍一層厚約3~30nm的金屬薄膜。（1）鍍膜的目的①提高樣品表面的導(dǎo)電性。②提高二次電子發(fā)射率。③減少電子束對(duì)樣品的損傷。（2）鍍膜材料的選擇金、鉑、金/鉑合金、鉑/鈀合金。（3）鍍膜的方法目前常用離子濺射法鍍膜。,,7、金屬鍍膜1）離子濺射法①離子濺射儀的主要結(jié)構(gòu)②離子濺射鍍膜的原理輝光放電→離子濺射→漫散射鍍膜③鍍膜厚度的控制：濺射時(shí)間的選擇8、電鏡觀察,圖3-6離子濺射儀及原理圖,（二）特殊樣品的常規(guī)制備方法,1、游離細(xì)胞的制樣方法（1）將蓋玻片洗凈滅菌，樣品面做標(biāo)記；（2）將蓋玻片垂直浸入熱溶的2~5%明膠后即刻垂直取出，用濾紙吸去邊緣多余的明膠；（3）將蓋玻片的樣品面朝上平放在濾紙上，于37℃干燥箱烘干后備用；（4）在蓋玻片樣品面上滴1~2滴細(xì)胞懸浮液，靜置20min左右，用濾紙吸去表面殘存的懸浮液。（5）用2%戊二醛固定30min，PBS清洗3次。（6）常規(guī)方法脫水、臨界點(diǎn)干燥、粘樣和鍍膜。,SEM樣品的常規(guī)制備方法小結(jié),,,1、SEM樣品的常規(guī)制備步驟取材→清洗→固定→清洗→脫水→中間液替代脫水劑→臨界點(diǎn)干燥→粘樣→（金屬）鍍膜→SEM觀察2、SEM樣品制備的基本要求與原則（1）樣品觀察面要處理干凈，以充分暴露表面特征；（2）保護(hù)樣品觀察面，以保持原狀不變形；（3）樣品要徹底干燥，以保護(hù)鏡筒的高真空和樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)；（4）樣品要作導(dǎo)電處理，以減少充放電效應(yīng)和提高二次電子發(fā)射率。,復(fù)習(xí)題,1、掃描電鏡的特點(diǎn)2、臨界點(diǎn)干燥的原理3、金屬鍍膜的目的4、SEM樣品的常規(guī)制備步驟5、SEM樣品制備的基本要求與原則,