細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-細(xì)胞融合.ppt

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細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn),liuzhe5@,概念促融合劑與融合技術(shù)應(yīng)用與意義,重點(diǎn),一定義：Cellfusion,細(xì)胞融合：(Cellfusion)又稱體細(xì)胞雜交（somatichybridization）是指將不同來(lái)源的原生質(zhì)體(除去細(xì)胞壁的細(xì)胞)相融合，將兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,人心肌細(xì)胞,人肝臟細(xì)胞,,,,,,,,,,種內(nèi)雜交細(xì)胞,,,,,,人細(xì)胞,鼠細(xì)胞,,,,,,,,,,種間雜交細(xì)胞,在適當(dāng)?shù)臈l件下，細(xì)胞融合在一起，產(chǎn)生具有原來(lái)兩個(gè)細(xì)胞基因信息的單個(gè)核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞（hybridcell）。種內(nèi)雜交細(xì)胞（intraspecifichybridcell）:同種細(xì)胞融合而成的細(xì)胞種間雜交細(xì)胞（interspecifichybridcell）:不同種的細(xì)胞融合而成的細(xì)胞,非對(duì)稱細(xì)胞融合（asymmetricfusion）：利用物理或化學(xué)方法使某親本細(xì)胞的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合。,細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的有物理和化學(xué)方法：1.物理方法，如X射線、r射線等，它們能使細(xì)胞核失活；2.化學(xué)方法，核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質(zhì)失活－羅丹明（R－6－G，它是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過(guò)程而達(dá)到失活作用。,動(dòng)物克隆,上海第二醫(yī)科大學(xué)陳瑩博士,2003年，她將一5歲男孩的包皮細(xì)胞與一只已去除細(xì)胞核的新西蘭兔卵母細(xì)胞融合，獲得了人類早期胚胎。,二細(xì)胞融合的原理,,,熒光標(biāo)記的小鼠細(xì)胞和人細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn),將小鼠的抗體與發(fā)綠色熒光的熒光素(fluorescin)結(jié)合,人的抗體與發(fā)紅色熒光的羅丹明(rhodamine)結(jié)合；,顯微鏡下的細(xì)胞融合過(guò)程,細(xì)胞融合的過(guò)程,細(xì)胞互相靠近,細(xì)胞膜融合,細(xì)胞橋形成,細(xì)胞質(zhì)融合,細(xì)胞核融合,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,細(xì)胞融合主要經(jīng)過(guò)了兩原生質(zhì)體或細(xì)胞互相靠近、細(xì)胞橋形成、胞質(zhì)滲透、細(xì)胞核融合主要步驟。細(xì)胞橋的形成是細(xì)胞融合最關(guān)鍵的一步，融合過(guò)程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋。,細(xì)胞融合過(guò)程中兩個(gè)細(xì)胞膜的變化,形成細(xì)胞橋的具體變化,細(xì)胞融合分為兩種：1.自發(fā)細(xì)胞融合2.人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合,（1）自發(fā)細(xì)胞融合,自發(fā)細(xì)胞融合（spontaneouscellfusion）是在未施加任何誘導(dǎo)條件的情況下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象。,自發(fā)細(xì)胞融合現(xiàn)象在自然界中并不多見(jiàn)，常見(jiàn)的主要有以下幾種情況：1.精子和卵子受精2.肌管的形成3.胚胎著床4.巨細(xì)胞的形成5.破骨細(xì)胞的形成6.腫瘤細(xì)胞融合,,（2）誘導(dǎo)細(xì)胞融合,人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合是在人為條件下發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象,常用的誘導(dǎo)方法有三種：1.生物法（病毒誘導(dǎo)法等）2.化學(xué)法（PEG誘導(dǎo)法、Ca2+誘導(dǎo)法、溶血卵磷脂誘導(dǎo)法等）3.物理法（電誘導(dǎo)法等）,1.病毒誘導(dǎo)法,常用的病毒：仙臺(tái)病毒（Sendalvirus),又稱日本血凝病毒（HemagglutinatingvirusofJapan,HVJ）屬于副粘液病毒科，RNA病毒，圓球形1962年，日本仙臺(tái)東北大學(xué)學(xué)者岡田發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒可誘導(dǎo)細(xì)胞融合。,病毒促使細(xì)胞融合兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近，使兩個(gè)細(xì)胞膜、胞質(zhì)間互相滲透--------細(xì)胞核互相融合，進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，雜種子細(xì)胞。,,2化學(xué)法（聚乙二醇）,PEG:聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）分子式：HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH性狀：白色蠟狀固體，具有強(qiáng)烈的凝集、沉淀蛋白質(zhì)的作用分子量〉1000-6000u，可作誘融劑。,20世紀(jì)70年代，華裔科學(xué)家高國(guó)南發(fā)現(xiàn)聚乙二醇能誘導(dǎo)細(xì)胞融合,,分子量小的PEG，融合效應(yīng)差，又有毒性，分子量過(guò)大，則粘性太大，不易操作。pH偏堿時(shí)融合效應(yīng)最高。用作細(xì)胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4000者，常用濃度為50％，pH8.0~pH8.2,聚乙二醇,普遍認(rèn)為聚乙二醇分子能改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細(xì)胞發(fā)生融合,基本原理,聚乙二醇(PEG)是一種多聚化合物，商品名卡波蠟(Carbowax)。,聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的細(xì)胞融合,原理：PEG帶有大量的負(fù)電荷,和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷在鈣離子的連接下，形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著和結(jié)合，在高pH,高鈣離子的溶液的作用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的正負(fù)電荷連接起來(lái)，進(jìn)而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。,,融合過(guò)程中應(yīng)注意①事先要做好兩種原生質(zhì)體的識(shí)別標(biāo)記，如色素、缺陷型、抗性標(biāo)記等。②原生質(zhì)體的密度應(yīng)在105個(gè)／mL左右，兩種原生質(zhì)體按1：1等量混合。③常用PEG的分子量通常為4000~6000，加熱熔化與Eagle溶液配成50％(W／V)濃度(小分子質(zhì)量的PEG配成55％濃度)。加入PEG后，24℃培育10~20min注意時(shí)間宜短不宜長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)，使原生質(zhì)體周?chē)粚幽ば纬赡w，會(huì)降低融合率)，緩緩加入高pH、高鈣離子溶液15min后用沖洗液清洗，離心收集原生質(zhì)體。,3.物理法一電融合誘導(dǎo)法,1981年，Scheurich和Zimmermann發(fā)明了電誘導(dǎo)細(xì)胞融合。,電融合槽,在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開(kāi)始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。,細(xì)胞電融合,原理：懸于大小不同的兩平行電極間的低導(dǎo)電率溶液中的細(xì)胞，在1—100MHz和100—1000V/cm的交流電場(chǎng)中，會(huì)向小電極移動(dòng)，并極化成偶極子，而沿電場(chǎng)方向發(fā)生雙向電泳，此時(shí)再加上適當(dāng)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的高壓電脈沖，即可使相鄰細(xì)胞膜的接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電降解，從而觸發(fā)細(xì)胞融合。,,,+,--,,+,-,,+,-,,,,+,,,--,,,-,+,,偶極子,電誘導(dǎo)法原理,,,,+,--,,,-,+,,,,雙向電泳：在交流電場(chǎng)的作用下（1MHz，150V/cm）細(xì)胞膜上正負(fù)電荷分離，產(chǎn)生偶極，兩個(gè)極化的細(xì)胞會(huì)發(fā)生相互的緊密接觸。,,,,,,原生質(zhì)體電融合過(guò)程,1）在高頻電流電場(chǎng)下的相互接觸。2）脈沖刺激后30s3)50秒后4）1.5分鐘后5）6分鐘后6）15分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。,注意事項(xiàng),1）對(duì)介質(zhì)要求高，一般用高純度的蒸餾水并選用適當(dāng)?shù)姆请娊橘|(zhì)溶液，如甘露醇等配制等滲性介質(zhì)。2）注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓的強(qiáng)度和時(shí)間，以防止細(xì)胞連接成串或發(fā)生可逆性降解。,優(yōu)點(diǎn)：,融合率高，達(dá)70％－80％，甚至100％可在顯微鏡下定向誘導(dǎo)細(xì)胞融合可直接挑選雜種細(xì)胞重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)原生質(zhì)體傷害??；裝置精巧、方便簡(jiǎn)單；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程、誘導(dǎo)過(guò)程可控制性強(qiáng)等。,融合指數(shù)（fusionindex）:反映細(xì)胞融合的效率有兩種計(jì)算方法：1.FI=（對(duì)照組細(xì)胞數(shù)-試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)）/試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)2.FI=多核細(xì)胞中的細(xì)胞核數(shù)/所有細(xì)胞中的細(xì)胞核數(shù),,不同細(xì)胞融合的條件及其主要應(yīng)用,來(lái)源前處理融合的方法主要應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞不需仙臺(tái)病毒,PEG，電融合生產(chǎn)單克隆抗體植物細(xì)胞脫壁PEG,電融合創(chuàng)造植物新品種微生物細(xì)胞脫壁PEG,高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌種,,,,,,A,,,A,,,,,B,B,,,,A,,A,,,,,B,B,,,,,,,,B,A,,,,A,,,,B,同核體,同核體,異核體（雜交細(xì)胞）,未融合,未融合,,,加入融合劑,融合細(xì)胞的類型,,同核體：由同一親本細(xì)胞融合而來(lái)異核體：（heterokaryon）有不同親本細(xì)胞融合而來(lái)異核體其細(xì)胞膜融合在一起，而融合的細(xì)胞含有兩個(gè)不同的細(xì)胞核。,動(dòng)物細(xì)胞融合影響因素,動(dòng)物細(xì)胞融合中，除促融劑外，其他如細(xì)胞性質(zhì)、溫度、pH、離子強(qiáng)度及離子種類等均全影響細(xì)胞融合效率。①親本細(xì)胞表面性質(zhì)影響較大②細(xì)胞種類不同，融合效果也不同，如腹水癌及株化細(xì)胞較易融合，而淋巴細(xì)胞或血球細(xì)胞幾乎不融合。③細(xì)胞融合時(shí)需要適宜溫度和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。如仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)-腹水癌細(xì)胞融合時(shí)，于37℃振搖時(shí)易于融合，且融合效率與病毒量呈正比。但在34℃振搖則融合率下降。在37℃時(shí)不振搖則-不融合。,,④細(xì)胞融合過(guò)程中，通常耗氧量較大，缺氧時(shí)經(jīng)常不融合?？諝庵泻趿看笥?0％時(shí)有一定融合率，但有些細(xì)胞在無(wú)氧條件也可融合。⑤有些細(xì)胞融合時(shí)需要Ca2+，否則不融合，細(xì)胞蛋白質(zhì)亦發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等離子可代替Ca2+，但有效濃度較Ca2+大的多。融合時(shí)最適合的離子強(qiáng)度一般為0.1mol/L。⑥最適合的pH為7.4-7.8之間，在此范圍之外，融合率均較低。,比較常用的雜種細(xì)胞篩選方法,1遺傳互補(bǔ)篩選法：2營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選：3溫度敏感篩選法,1）遺傳互補(bǔ)篩選法：利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。親本A：HGPRT-/TK+親本B：HGPRT+/TK-雜交細(xì)胞：HGPRT+/TK+在HAT培養(yǎng)基中雜交細(xì)胞存活，A、B死亡,2）營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)：細(xì)胞在缺乏一種或幾種營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，不能生長(zhǎng)繁殖即營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)作用原理可以篩選雜種細(xì)胞。親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細(xì)胞均會(huì)死亡。,3）溫度敏感突變型雜種細(xì)胞的篩選：一般的培養(yǎng)細(xì)胞能在32度到40度的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，但溫度敏感突變型的細(xì)胞能在高溫或低溫下生長(zhǎng)。由此篩選雜種細(xì)胞。親本一：低溫敏感突變型，可在低溫下生長(zhǎng)，在高溫下死亡。親本二：高溫敏感突變型，可在高溫下生長(zhǎng)，在低溫下死亡。雜種細(xì)胞能在高溫和低溫下生長(zhǎng)。,細(xì)胞融合的應(yīng)用,1.用于基因定位2.用于生產(chǎn)樹(shù)突狀細(xì)胞抗腫瘤疫苗2.用于動(dòng)物育種3.用于細(xì)胞治療4.用于生產(chǎn)單克隆抗體5.用于研究核質(zhì)關(guān)系和腫瘤發(fā)生機(jī)制,細(xì)胞融合應(yīng)用,一.單克隆抗體1975年英國(guó)科學(xué)家Milstein和Kohler將產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞融合，成功建立了單克隆抗體技術(shù)，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。,TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984"forthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies",,GeorgesJ.F.KoehlerFederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunologyBasel,Switzerlandb.1946d.1995,CarMilsteinArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdomb.1927(inBahiaBlanca,Argentina)d.2002,科萊爾,米爾斯坦,,單克隆抗體的概念,單:單個(gè)細(xì)胞克隆:無(wú)性繁殖抗體:化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng),親本細(xì)胞的準(zhǔn)備,細(xì)胞融合,雜交瘤細(xì)胞的篩選,可分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的篩選,雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng),單克隆抗體的生產(chǎn)和純化,,,,,,,,,,,,生產(chǎn)過(guò)程,單克隆抗體的大量制備過(guò)程,一細(xì)胞融合前準(zhǔn)備(一)動(dòng)物免疫與免疫脾細(xì)胞懸液的制備在腹腔免疫1－2次后的2－4周，于融合前3—4天加強(qiáng)免疫一次，這樣可以使抗原最近激活的B淋巴細(xì)胞定位于脾臟，也使記憶細(xì)胞處在激活與分裂狀態(tài)。許多資料結(jié)果表明，脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤的最佳時(shí)間，是在抗體形成高峰之前，而不是在抗體形成高峰期?？扇苄钥乖拿庖吡砍?0-100ug，經(jīng)皮下或腹腔注射免疫1-2次（間隔2-3周），3周后50-500ug抗原加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫一定要靜脈注射或腹腔內(nèi)注射，確?？乖竭_(dá)脾臟。細(xì)胞抗原常用2107用細(xì)胞腹腔注射，不需佐劑。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液。,,淋巴細(xì)胞：經(jīng)過(guò)免疫處理的淋巴細(xì)胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：體內(nèi)法或體外法。體內(nèi)法：對(duì)細(xì)胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動(dòng)物體內(nèi)。3－4天后，在無(wú)菌條件下可以取出脾或淋巴結(jié)制成懸液，存活率在95％以上的可以用于融合。體外法：直接提取大、小鼠淋巴細(xì)胞，調(diào)整為107個(gè)/ml，加適當(dāng)濃度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴細(xì)胞。,,小牛血清的選擇①供血的新生小牛必須是健康牛的產(chǎn)仔，并在產(chǎn)后24小時(shí)內(nèi)抽血，此期間不得吸取母乳。②以無(wú)菌操作自頸動(dòng)脈放血，并在無(wú)菌條件下分離血清及濾菌，全過(guò)程在36小時(shí)內(nèi)完成。經(jīng)濾菌的血清置－20℃保存。③血清使用前需做細(xì)菌、支原體培養(yǎng)及內(nèi)毒素測(cè)定，在確實(shí)無(wú)污染的情況下方可使用。④每批小牛血清測(cè)定總蛋白含量并分別配成10％、20％、25％于基礎(chǔ)培養(yǎng)基和HAT培養(yǎng)基中，對(duì)骨髓瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察小牛血清對(duì)瘤細(xì)胞和融合細(xì)胞的細(xì)胞毒性。⑤輕微溶血的血清，而無(wú)細(xì)胞毒性者仍可應(yīng)用。⑥在用血清做細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行，培養(yǎng)期間隨時(shí)可放于倒置顯微鏡下觀察，可避免由于肉眼觀察的疏忽。,,,B淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備,紅細(xì)胞,,將紅細(xì)胞注入小鼠皮下或腹腔,,取出脾臟,,B淋巴細(xì)胞,,親本細(xì)胞的準(zhǔn)備,(二)骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng),骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一晶系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAB。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可利用一般的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液。小牛血清的濃度一般在10％—20％，細(xì)胞的最大密度不得超106個(gè)／ml，一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1：10稀釋傳代，每3-5天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為16-20h。,親本細(xì)胞的準(zhǔn)備,骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備,骨髓瘤細(xì)胞：是癌變的漿細(xì)胞，可以分泌免疫球蛋白，所以必須選擇不分泌免疫球蛋白的缺陷型骨髓瘤細(xì)胞，多用BALB/C小鼠的骨髓瘤細(xì)胞。,,細(xì)胞融合,,,加入PEG作融合劑,B淋巴細(xì)胞,骨髓瘤細(xì)胞,雜交瘤細(xì)胞,,1,2,3,4,二細(xì)胞融合,融合條件除了融合劑以外，還包括溫度、培養(yǎng)基和培養(yǎng)板等。我們首先分析用PEG作融合劑時(shí)的條件選擇。由于作用時(shí)間不一樣對(duì)細(xì)胞的毒性也不一樣。用于融合的分子量一般在1000－4000，一般作用濃度在35％－50％之間，PEG作用1－2分鐘，以PH8.0－8.2時(shí)融合率最高。,小白鼠脾臟細(xì)胞B與癌細(xì)胞N以PEG進(jìn)行融合，操作在10min內(nèi)完成(如下圖)，隨即把細(xì)胞平均分配在96槽細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)中,,,細(xì)胞融合：1.脾細(xì)胞的準(zhǔn)備；拉頸處死小鼠；無(wú)菌操作取出脾臟；清洗、研磨。2.制備脾細(xì)胞懸液:收集細(xì)胞；離心洗滌；細(xì)胞計(jì)數(shù)。3.準(zhǔn)備骨髓瘤細(xì)胞:收集細(xì)胞；離心洗滌；活細(xì)胞計(jì)數(shù)；調(diào)整細(xì)胞濃度，骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾胞按一定比例混合。4.細(xì)胞融合劑的選擇：病毒，PEG。5.細(xì)胞融合：在聚乙二醇作用下各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。,,將免疫脾細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞以2：1或10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)。1200rpm離心7—10分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細(xì)胞鋪展成薄層。在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%的PEG0.5ml，隨后靜置90秒。再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入5－10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用，再靜置10分鐘。,,融合細(xì)胞的早期觀察及其異常結(jié)果分析：1．融合后的細(xì)胞早期觀察與管理；2．無(wú)分泌特異性抗體雜交瘤原因分析；3．轉(zhuǎn)種與擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；4．不出現(xiàn)雜交瘤的原因分折。,三雜交瘤細(xì)胞的篩選,,融合,,,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng),,HAT,,,1,2,3,4,HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞,細(xì)胞團(tuán)塊分散后，加HAT溶液，稀釋至骨髓瘤細(xì)胞不超過(guò)2105ml，即可加入有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；總量分別為0.2ml和1ml。用HAT選擇性培養(yǎng)時(shí)每隔2－3天半量換液，7天后可以選擇出雜交瘤細(xì)胞。,HAT選擇系統(tǒng),HAT是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。DNA合成途徑有兩種。,雜交瘤技術(shù)中，常選用次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤細(xì)胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細(xì)胞為親本之一。HPRT-細(xì)胞的嘌呤只能由全合成途徑產(chǎn)生；TK-細(xì)胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。含氨基喋呤培養(yǎng)基抑制了細(xì)胞內(nèi)嘌呤和嘧啶的全合成途徑。,淋巴細(xì)胞具有合成DNA的兩條途徑。雜種細(xì)胞通過(guò)互補(bǔ)作用獲得HRPT或TK基因，可應(yīng)用培養(yǎng)基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通過(guò)補(bǔ)救合成途徑合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中，HPRT-或TK-親本細(xì)胞死亡，淋巴細(xì)胞亦逐漸死亡，只有雜種細(xì)胞存活。,四可分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的篩選,,HAT,將培養(yǎng)皿孔內(nèi)的上清液取出，檢測(cè)抗體。常用的方法有：放射免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫熒光測(cè)定。,融合,,五雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng),,,,123456,融合,,HAT,,,雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng),利用單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細(xì)胞系。在培養(yǎng)過(guò)程中，一般要加能釋放某些生長(zhǎng)因子促進(jìn)雜交瘤生長(zhǎng)的飼養(yǎng)細(xì)胞，如小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞或胸腺細(xì)胞等。方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光激活分選儀等。,,克隆化的目的1）是細(xì)胞建株的必經(jīng)過(guò)程，以得到遺傳特征相同的細(xì)胞；2）就雜交瘤而言，可從中篩選出穩(wěn)定而同源的雜種細(xì)胞系，淘汰遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)跑。3）減少非分泌型無(wú)關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)快。注意事項(xiàng)：①待克隆細(xì)胞生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期；②小牛血清的質(zhì)量和濃度；③細(xì)胞計(jì)數(shù)要準(zhǔn)確；④及時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。,,飼養(yǎng)細(xì)胞的種類和作用對(duì)于培養(yǎng)小鼠細(xì)胞來(lái)說(shuō)，主要有下列各種細(xì)胞可供作為其飼養(yǎng)細(xì)胞：①胸腺細(xì)胞,用量為106/0.2ml②正常的脾細(xì)胞；③傳代培養(yǎng)中的大鼠胚胎成纖維細(xì)胞；④腹腔細(xì)胞其用量為2104/0.2ml，腹腔細(xì)胞是使用得最普遍的飼養(yǎng)細(xì)胞。胚胎成纖維細(xì)胞因在細(xì)胞培養(yǎng)條件下有分裂增殖的能力，故只適應(yīng)于軟瓊脂平板法培養(yǎng)中，該細(xì)胞鋪于平板的底層。,,飼養(yǎng)細(xì)胞的作用①提高培養(yǎng)細(xì)胞的密度，使待克隆細(xì)胞容易生存與繁殖。②腹腔細(xì)胞能清除培養(yǎng)中的死亡細(xì)胞，從而促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)。③飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放諸如細(xì)胞生長(zhǎng)因子類物質(zhì)，起到促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖的作用。,1.有限稀釋法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,稀釋,,,,,1）有限稀釋法有限稀釋法原理是從理論上將細(xì)胞稀釋到10個(gè)/ml，然后裝成每小孔(96孔板)0.1ml，使每孔理論上含有單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后即可獲得單個(gè)細(xì)胞形成集落。有限稀釋法舉例：1.取1.0ml5104ml細(xì)胞+4ml培養(yǎng)基稀釋，得1104/ml.2.取0.5ml1104ml細(xì)胞液+4.5ml培養(yǎng)基稀釋，得1103/ml.3.取1.0ml1103ml細(xì)胞液+4.5ml培養(yǎng)基稀釋，得1102/ml.,2.軟瓊脂培養(yǎng)法,在加入飼養(yǎng)細(xì)胞的無(wú)菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5％的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細(xì)胞的0.25％的軟瓊脂。待細(xì)胞長(zhǎng)成集落后，用毛細(xì)管吸出移種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)。,,,,,,,2）軟瓊脂培養(yǎng)法：本法對(duì)于某些抗原，可以把克隆化培養(yǎng)與特異性篩選測(cè)定結(jié)合起來(lái)進(jìn)行，所以它的特點(diǎn)是效率較高，速度較快。但缺點(diǎn)是克隆率不高?；驹硎抢脝蝹€(gè)細(xì)胞在軟瓊脂培養(yǎng)基上的局限化生長(zhǎng)，待細(xì)胞集落長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)后，用巴氏吸管從瓊脂上挑出來(lái)(一般8—10天后)，再移到液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，并檢測(cè)培養(yǎng)上清液的活性。也可以用溶血空斑技術(shù)或圍繞集落形成免疫沉淀的方法來(lái)直接測(cè)它的活性。,,3.顯微鏡操作法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,3）顯微鏡操作法在倒置(或解剖)顯微鏡下，借助于毛細(xì)吸管將單個(gè)細(xì)胞個(gè)別吸出，分別放入已加飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)孔內(nèi)，根據(jù)原理不同，又分為普通法和玫瑰花結(jié)兩種方法。普通顯微鏡操作法：于6cm平皿中，假如約103個(gè)細(xì)胞；CO2培養(yǎng)基箱中靜置1小時(shí)左右無(wú)菌條件；在倒置顯微鏡下去平皿蓋用直角轉(zhuǎn)頭滴管，吸出單個(gè)細(xì)胞移至預(yù)先加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)直至96孔均分裝有細(xì)胞，加蓋；于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)觀察與更換培養(yǎng)方法同有限稀釋法。玫瑰花結(jié)原理：分泌抗體細(xì)胞在其表面含有抗原受體，在—定的條件下常可與特異性抗原致敏的羊紅細(xì)胞形成玫瑰花結(jié)。如果從免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞中除去能形成特異性玫瑰花結(jié)的細(xì)胞則失去對(duì)特異性抗原的反應(yīng)性。,4.熒光激活分離法,,熒光激活細(xì)胞分離器法(FluoresemuactivatedCellSortu，F(xiàn)ACS)用本儀器分離單細(xì)胞的原理是將懸液中的細(xì)胞引入一種液流的中央，使其一個(gè)接一個(gè)地通過(guò)聚焦的高能激光束，根據(jù)熒光和光放射的性質(zhì)快速分析和分離細(xì)胞。,,5）蓋片分離法1.用釘錘于潔凈的橡膠上砸干凈蓋片；2.選擇碎塊、大小形態(tài)適用的選出；3.加培養(yǎng)液及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；4.倒置鏡下選細(xì)胞，挑出單細(xì)胞玻片；5.進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)。,,,,大量生產(chǎn)單克隆抗體：,(1)體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體；（2）體nei雜交瘤細(xì)胞制備腹水或血清1)實(shí)體瘤法：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml.腫瘤達(dá)到一定大小后則可采血，從血清獲得單克隆抗體。,2）腹水的制備：,腹腔注射1x106雜交瘤細(xì)胞，按種細(xì)胞7-10天后可產(chǎn)生腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml，可以將腹水中細(xì)胞凍存起來(lái)，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。,,避免夭折的方法可采用：①換液動(dòng)作輕柔、換液量不超過(guò)1/2；②避免反復(fù)取出CO2培養(yǎng)箱，不宜經(jīng)常換液；③不輕易更換新批號(hào)小牛血清。及時(shí)判斷陽(yáng)性孔也是一項(xiàng)重要的工作，可起減少工作量和保證重點(diǎn)雜交細(xì)胞雙重作用，待集落生長(zhǎng)到96孔板孔1/3左右，24孔板1/5左右，就要及時(shí)測(cè)定各孔上清中是否會(huì)有特異性抗體，一旦發(fā)現(xiàn)抗體陽(yáng)性孔，就應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)，再凍存和克隆化，以免被其他細(xì)胞生長(zhǎng)所壓抑或意外丟失。無(wú)分泌特異性抗體雜交瘤原因分析：融合后經(jīng)HAT選擇有細(xì)胞克隆出現(xiàn)，但不能篩選出產(chǎn)生特異抗體的雜交瘤，常見(jiàn)原因是：①抗體檢測(cè)法不夠敏感；②HAT選擇失敗；③染色體丟失和克隆競(jìng)爭(zhēng)；④動(dòng)物免疫不成功。,,,雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體示意圖,單克隆抗體的應(yīng)用,主要用于疾病的診斷、治療和預(yù)防。與常規(guī)抗體相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。如；各種癌癥、肝炎病毒、SARS病毒、細(xì)菌及血吸蟲(chóng)等數(shù)百種疾病的診斷；在疾病治療方面，單克隆抗體猶如人體衛(wèi)士，能識(shí)別“自己”與“異己”，一旦發(fā)現(xiàn)致病因素便與之結(jié)合將其殺死。若在單抗上帶上抗癌藥物制成“生物導(dǎo)彈”，將藥物定向帶到癌細(xì)胞所在部位，既消滅了癌細(xì)胞又不會(huì)傷害健康細(xì)胞,美國(guó)科學(xué)家采用細(xì)胞融合技術(shù)將番茄和馬鈴薯的細(xì)胞融合在一起，培育出稱之為“番茄薯”或“薯番茄”的新型植物。植株地上部結(jié)番茄，地下部生長(zhǎng)根莖，產(chǎn)量高，品質(zhì)好。,,,動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體思考與探究,1.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)有什么不同？提示：植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁，然后再融合；動(dòng)物細(xì)胞融合是兩個(gè)體細(xì)胞直接融合。,2.制備單克隆抗體時(shí)，為什么要選用B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞？,提示：哺乳動(dòng)物感染抗原后，其體內(nèi)會(huì)形成相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動(dòng)物在免疫反應(yīng)的過(guò)程中，每一種B淋巴細(xì)胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細(xì)胞大量增殖。B淋巴細(xì)胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖骨髓瘤細(xì)胞是一種癌細(xì)胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無(wú)限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，它會(huì)兼有兩個(gè)親本細(xì)胞的特性──在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時(shí)能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。,,3已成功的動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)例還有哪些？生物種類細(xì)胞來(lái)源成功年代酵母菌—雞原生質(zhì)體—血紅細(xì)胞1975年人—胡蘿卜腹水癌細(xì)胞—原生質(zhì)體1976年人—小鼠纖維肉瘤細(xì)胞—畸胎瘤細(xì)胞1978年,,,,4.為什么不用兩個(gè)而用多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合？,就目前常用的細(xì)胞融合方法來(lái)看，不管是用物理的、化學(xué)的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個(gè)細(xì)胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細(xì)胞。更重要的是，即使兩個(gè)細(xì)胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者期望得到的細(xì)胞類型。目前動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)最有價(jià)值的應(yīng)用就是單克隆抗體的制備。我們以制備單克隆抗體為例來(lái)說(shuō)明這一問(wèn)題。我們知道，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達(dá)百萬(wàn)種以上，但是每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體，如果僅取一個(gè)脾細(xì)胞（含B淋巴細(xì)胞）和一個(gè)瘤細(xì)胞雜交，我們不能確定該脾細(xì)胞分泌的抗體是否正是我們所需要的；若用大量的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，就可以從融合細(xì)胞中篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。,5.雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測(cè)及克隆化培養(yǎng)？,融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞，通常用“有限稀釋法”來(lái)選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過(guò)一個(gè)，通過(guò)培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔。陽(yáng)性孔中的細(xì)胞還不能保證是來(lái)自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行3～4次，直至確信每個(gè)孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過(guò)程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。,,這樣的人畜細(xì)胞融合會(huì)造成什么后果？4位專家分析指出：首先，某些目前未知的兔子疾病將傳染給人類，就像艾滋病病毒可能是從非洲猩猩而來(lái)。盡管中山醫(yī)科大學(xué)把胚胎用于治療性克隆研究，但萬(wàn)一被居心叵測(cè)者植人人類子宮，就可能產(chǎn)生一個(gè)人兔雜交種。“這完全是對(duì)人類尊嚴(yán)的褻讀?！?精子和卵子受精,,肌管,,,破骨細(xì)胞是由好幾個(gè)細(xì)胞融合,,,巨細(xì)胞,,骨巨細(xì)胞瘤,骨巨細(xì)胞瘤綠色箭頭所指為正在融合的間質(zhì)細(xì)胞,,,附錄：蟾蜍血紅細(xì)胞\雞血紅細(xì)胞,[實(shí)驗(yàn)步驟]1.試劑：(1)Alsver液：葡萄糖2.05g，檸檬酸鈉0.8g，氯化鈉0.42g，加重蒸水至100mL即可。(2)GKN液：氯化鈉8g，氯化鉀0.4g，磷酸氫二鈉1.77g，磷酸二氫鈉0.69g，葡萄糖2g，酚紅0.01g，溶于1000mL重蒸水中。(3)Ringer溶液：二氯化鈉0.25g，氯化鉀0.42g，氯化鈉6.5g(恒溫動(dòng)物9g)溶于1000mL蒸餾水中。(4)50％PEG混合液：稱取少許PEG(Mw4000)放人刻度離心管內(nèi)，在沸水浴中加熱，的等體積的GKN液，混勻。,[實(shí)驗(yàn)步驟],1.細(xì)胞懸液的制備：(1)蟾蜍血紅細(xì)胞懸液制備：注射器吸1mLAlsver液后，從蟾蜍主動(dòng)脈弓取血1mL，再加入2mLAlsver液放入刻度離心管內(nèi)，按照3：1(V／V)加入6mLAlsver液混勻，放入4℃冰箱內(nèi)可保存3--4天。(2)雞血紅細(xì)胞懸液的制備：用注射器吸入1mLAlsver液后從雞翼下靜脈取血2mL，注入刻度離心管內(nèi)，按照3：1(V／V)加入6mLAlsver液混勻。2.取細(xì)胞懸液1mL，移入10mL離心管，加4mL0.85％生理鹽水。1500r／min離心5min。3.棄上清液，加0.85％生理鹽水至5mL，混勻后1500r／min離心5min。重復(fù)再離心洗滌1次。4.收集最后1次離心沉淀的血細(xì)胞，加適量的GKN液或Ringer溶液，按壓積紅細(xì)胞體積配成10％的紅細(xì)胞懸液。5.取懸液1mL到1個(gè)試管中，加入0.5～0.8mL預(yù)熱的50％PEG混勻，置于30℃水浴2min；再加入Ringer或Hanks液5ml以終止PEG的作用;取血細(xì)胞懸液1滴滴于載玻片上，再加入0.2%次甲基藍(lán)溶液1滴,蓋上蓋玻片。6.顯微鏡(高倍)觀察2個(gè)或3個(gè)靠近細(xì)胞融合過(guò)程。7.進(jìn)行多個(gè)視野的測(cè)定，統(tǒng)計(jì)平均融合,