2020年高考生物一輪復習 第十單元 第35講 基因工程講義（含解析）（選修3）.doc

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第35講　基因工程 [考綱明細]　1.基因工程的誕生(Ⅰ)　2.基因工程的原理及技術(含PCR技術)(Ⅱ)　3.基因工程的應用(Ⅱ)　4.蛋白質工程(Ⅰ)　實驗：DNA的粗提取與鑒定 知識自主梳理 一、基因工程的概念及基本工具 1．基因工程概念 2．DNA重組技術的基本工具 (1)限制性核酸內切酶(簡稱：限制酶) ①來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。 ②作用：識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。 ③結果：產生黏性末端或平末端。 例：如下圖所示，EcoRⅠ限制酶識別的堿基序列是—GAATTC—，切割位點在G和A之間；SmaⅠ限制酶識別的堿基序列是—CCCGGG—，切割位點在C和G之間；說明限制酶具有特異性。 ④本質：蛋白質。 [深入思考]　限制酶為何不切割自身DNA? 提示　限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識別一種特定的堿基序列，并在特定的位點上進行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是自身DNA中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。 (2)DNA連接酶 ①作用：將限制酶切割下來的DNA片段拼接成新的DNA分子。恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。 ②類型 ③DNA連接酶和限制酶的關系 (3)載體 ①載體的作用：攜帶外源DNA片段進入受體細胞。 ②常用載體：質粒。其他載體：λ噬菌體衍生物、動植物病毒等。 ③質粒 a．概念：質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA之外，并具有自我復制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。 b．特點：能自我復制；有一個至多個限制酶切割位點；有特殊標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。 二、基因工程的基本操作程序 1．目的基因的獲取 目的基因：主要指編碼蛋白質的基因，也可以是一些具調控作用的因子。 (1)從基因文庫中獲取 ①前提條件：目的基因序列未知。 ②基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，可分為基因組文庫和部分基因文庫(如cDNA文庫)。 ③構建過程 (2)利用PCR技術擴增目的基因 ①PCR含義：是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。 ②PCR原理：DNA雙鏈復制。 ③前提條件：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。 ④要求 模板：目的基因兩條鏈。 原料：四種脫氧核苷酸。 酶：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)。 引物：人工合成的兩條DNA片段(引物1，引物2)。 ⑤PCR反應過程 ⑥方式：指數(shù)形式擴增(2n，n為擴增循環(huán)的次數(shù))。 ⑦結果：短時間內大量擴增目的基因。 (3)人工合成 ①前提條件：核苷酸序列已知，基因比較小。 ②方法 a．反轉錄法：目的基因的mRNA單鏈DNA雙鏈DNA(目的基因) b．化學合成法：蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列目的基因 2．基因表達載體的構建——基因工程的核心 (1)操作目的 使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。 (2)組成 (3)構建過程 [深入思考]　獲取目的基因與切割載體時只能用同一種限制酶嗎？ 提示　不是只能用一種限制酶，也可以用不同的限制酶，只要切割后目的基因和載體的黏性末端相同即可。 3．將目的基因導入受體細胞 (1)將目的基因導入植物細胞 ①農桿菌轉化法：最常用的方法。 a．受體細胞：植物體細胞或受精卵。 b．操作過程：將目的基因插入Ti質粒的TDNA上―→轉入農桿菌―→導入植物細胞―→TDNA上的目的基因整合到受體細胞的染色體DNA上―→目的基因表達。 ②基因槍法：適用于單子葉植物，成本較高。 ③花粉管通道法：將目的基因通過花粉管通道導入受體細胞，十分簡便經濟。 (2)將目的基因導入動物細胞 ①方法：顯微注射技術。 ②受體細胞：動物的受精卵。 ③操作過程：將含有目的基因的表達載體提純―→取卵(受精卵)―→顯微注射―→受精卵經胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動物的輸卵管或子宮內―→獲得具有新性狀的動物。 [深入思考]　獲得轉基因動物時，通常選擇受精卵做受體細胞的原因？ 提示　受精卵全能性高，可使目的基因在相應的組織細胞內表達。 (3)將目的基因導入微生物細胞 ①轉化方法 a．用Ca2＋處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(這種細胞稱為感受態(tài)細胞)。 b．感受態(tài)細胞吸收重組表達載體DNA分子。 ②受體細胞：原核細胞(使用最廣泛的是大腸桿菌)。 ③原核生物的特點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少等。 4．目的基因的檢測與鑒定 (1)不論是復制水平、轉錄水平還是翻譯水平的檢測，都是在體外進行的。 (2)在DNA分子、mRNA分子上檢測目的基因是否插入、目的基因是否轉錄時，用的探針都是用放射性同位素等作標記的含有目的基因的DNA片段。 三、基因工程的應用 1．轉基因植物 植物基因工程技術主要用于提高農作物的抗逆能力(如抗除草劑、抗蟲、抗病、抗干旱和抗鹽堿等)，以及改良農作物的品質和利用植物生產藥物等方面。 2．轉基因動物 動物基因工程在動物品種改良、建立生物反應器、器官移植等方面顯示了廣闊的應用前景。 3．基因工程藥物 (1)來源：轉基因的工程菌。 (2)成果：細胞因子、抗體、疫苗、激素等。 (3)作用：用來預防和治療人類腫瘤、心血管疾病、遺傳病、各種傳染病、糖尿病、類風濕等疾病。 4．基因治療 (1)方法：把正?；驅氩∪梭w內，使該基因的表達產物發(fā)揮功能。 (2)效果：治療遺傳病的最有效的手段。 (3)分類：體內基因治療和體外基因治療。 四、蛋白質工程 1．概念：蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規(guī)律及其與生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類生產和生活的需求。 2．基本途徑：預期蛋白質功能→設計預期蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到對應的脫氧核苷酸序列(基因)。 考點題型突破 考點1　　基因工程的操作工具 題型一 限制性核酸內切酶及DNA連接酶等酶的作用 1．(2016全國卷Ⅲ)圖a中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內切酶的識別序列與切割位點，圖b為某種表達載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。 根據(jù)基因工程的有關知識，回答下列問題： (1)經BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被________酶切后的產物連接，理由是_________________________ _________________________________________________________。 (2)若某人利用圖b所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖c所示。這三種重組子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產物的有________，不能表達的原因是____________ ________________________________________________________。 (3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有____________________和________________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是________________。 答案　(1)Sau3AⅠ　兩種酶切割后產生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙　甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉錄(其他合理答案也可) (3)Ecoli DNA連接酶　T4DNA連接酶　T4DNA連接酶(其他合理答案也可) 解析　(1)分析圖a可知，限制酶Sau3A Ⅰ與BamH Ⅰ切割DNA后形成的黏性末端相同，故經這兩種酶切割得到的產物可以用DNA連接酶進行連接。 (2)構建基因表達載體時，為保證目的基因能在宿主細胞中成功表達，目的基因應插入在啟動子和終止子之間，據(jù)此可判斷甲、丙均不符合要求，目的基因均不能被轉錄。 (3)常見的DNA連接酶有Ecoli DNA連接酶和T4DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。 知識拓展 與DNA相關的六種酶的比較 題型二 載體的作用及特點 2．(2016全國卷Ⅰ)某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamH Ⅰ酶切后，與用BamH Ⅰ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}： (1)質粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有______________________________(答出兩點即可)，而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。 (2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是________________________________________________；并且____________和____________________________________________的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是_______________________________。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有________________的固體培養(yǎng)基。 (3)基因工程中，某些噬菌體經改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自于______________。 答案　(1)能自我復制、具有標記基因 (2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長　含有質粒載體　含有插入了目的基因的重組質粒(或含有重組質粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長　四環(huán)素 (3)受體細胞 解析　(1)質粒作為載體應具備的基本條件有：能自我復制、具有標記基因、含有一至多個限制酶切割位點等。 (2)由題意可知，未被轉化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞中均不含有氨芐青霉素抗性基因，所以在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上均不能生長。質粒載體上含有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，插入了目的基因的重組質粒中僅含有氨芐青霉素抗性基因(四環(huán)素抗性基因被破壞)，所以含有質粒載體和含有插入了目的基因的重組質粒的細胞均能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，但前者可以在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長而后者不能，所以可用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基，篩選出含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落。 (3)噬菌體屬于病毒，病毒增殖過程中所需的原料、酶等均來自于受體細胞。 考點2　　基因工程的基本操作程序 題型一 目的基因的獲取 1．基因工程又稱為DNA重組技術，回答相關問題： Ⅰ.(1)在基因工程中，獲取目的基因主要有兩大途徑，即________和從________中分離。 (2)利用某植物的成熟葉片為材料，同時構建cDNA文庫和基因組文庫，兩個文庫相比，cDNA文庫中含有的基因數(shù)目比基因組文庫中的少，其原因是________________________。 (3)在基因表達載體中，啟動子是________聚合酶識別并結合的部位。若采用原核生物作為基因表達載體的受體細胞，最常用的原核生物是________。 Ⅱ.將外源生長激素基因導入綿羊體內，轉基因綿羊的生長速度比一般綿羊提高30%，體型增大50%。外源生長激素基因除可以從基因組文庫中獲取外，還可通過以下途徑合成：一是利用從供體動物的________細胞中提取的mRNA，在________酶催化下合成；二是通過分析生長激素的________序列推測基因的結構，進而人工合成。這兩種途徑合成的生長激素基因________(填“相同”或“不同”)，原因是_____________________________________________________。 答案?、?(1)人工合成　已有物種 (2)cDNA文庫中只含有葉片細胞已轉錄(或已表達)的基因，而基因組文庫中含有該植物的全部基因 (3)RNA　大腸桿菌 Ⅱ.垂體　逆轉錄　氨基酸　不同　一種氨基酸可能不只由一種密碼子決定(密碼子的簡并性) 解析?、?(1)獲取目的基因的途徑，一是人工合成，二是從自然界已有物種中分離。 (2)基因組文庫中含有該植物的所有基因，而cDNA文庫中只含有已經轉錄的基因。 (3)啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位；最常用的原核生物受體細胞是大腸桿菌。 Ⅱ.生長激素是垂體合成分泌的，故只有在垂體細胞中才能提取到生長激素基因轉錄形成的mRNA，再在逆轉錄酶的催化作用下合成生長激素基因；也可以通過分析生長激素的氨基酸序列，推測出其mRNA中的堿基序列，進而推測出生長激素基因中的堿基序列，最后用化學方法人工合成。因為決定氨基酸的密碼子具有簡并性，因而這兩種方法合成的生長激素基因結構可能不同。 技法提升 獲取目的基因的方法選擇 (1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通過構建基因文庫的方法，即通過受體菌儲存并擴增目的基因后，從基因文庫中獲取目的基因。 (2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比較小，可以通過DNA合成儀利用化學方法直接人工合成。 (3)如果知道要擴增的目的基因及兩端的核苷酸序列，而且基因又比較大，可以通過PCR技術擴增目的基因。 題型二 PCR技術原理及應用 2．多聚酶鏈式反應(PCR技術)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，其簡要過程如圖所示。下列關于PCR技術敘述不正確的是(　　) A．PCR技術是在實驗室中以少量DNA制備大量DNA的技術 B．反應中新合成的DNA又可以作為下一輪反應的模板 C．PCR技術中以核糖核苷酸為原料，以指數(shù)方式擴增 D．應用PCR技術與探針雜交技術可以檢測基因突變 答案　C 解析　PCR技術是體外大量擴增DNA的技術，即以少量DNA制備大量DNA的技術，A正確；PCR技術的原理是DNA雙鏈復制，反應中新合成的DNA又可以作為下一輪反應的模板，所需原料是脫氧核苷酸，并以指數(shù)方式擴增，B正確，C錯誤。 3．(2017江蘇高考)金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結合蛋白，某研究小組計劃通過多聚酶鏈式反應(PCR)擴增獲得目的基因，構建轉基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴增過程示意圖如下，請回答下列問題： (1)從高表達MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過________獲得________用于PCR擴增。 (2)設計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)，為方便構建重組質粒，在引物中需要增加適當?shù)腳___________________位點。設計引物時需要避免引物之間形成________，而造成引物自連。 (3)圖中步驟1代表________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個步驟組成一輪循環(huán)。 (4)PCR擴增時，退火溫度的設定是成敗的關鍵。退火溫度過高會破壞________的堿基配對。退火溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，長度相同但________的引物需要設定更高的退火溫度。 (5)如果PCR反應得不到任何擴增產物，則可以采取的改進措施有________(填序號：①升高退火溫度?、诮档屯嘶饻囟取、壑匦略O計引物)。 答案　(1)逆轉錄　cDNA (2)限制性核酸內切酶　堿基互補配對 (3)變性 (4)引物與模板　GC含量高 (5)②③ 解析　(1)目的基因的獲?。簭母弑磉_MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過逆轉錄獲得cDNA用于PCR的擴增。 (2)設計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)，為方便基因與載體相連構建重組質粒，在引物中需要增加適當?shù)南拗菩院怂醿惹忻肝稽c。為了避免引物自連，設計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對。 (3)根據(jù)PCR的過程可知，圖中步驟1為變性，步驟2為退火，步驟3為延伸，這三個步驟構成一輪循環(huán)。 (4)退火溫度過高，會破壞引物與模板的堿基配對。因A、T之間形成兩個氫鍵，G、C之間形成三個氫鍵，形成G、C堿基對需要更多的能量，故需要更高的溫度。 (5)如果PCR反應得不到任何擴增產物，可能的原因是退火溫度過高，或者設計的引物不合適，不能與模板結合。因此可采取的改進措施有降低退火溫度、重新設計引物等。 知識拓展 PCR技術與體內DNA復制的異同點 題型三 基因表達載體的構建 4．在基因表達載體的構建中，下列說法不正確的是(　　) ①一個表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子 ②有了啟動子才能驅動基因轉錄出mRNA ③終止子的作用是使轉錄在所需要的地方停止 ④所有基因表達載體的構建是完全相同的 A．②③ B．①② C．①④ D．③④ 答案　C 解析　一個表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等，①錯誤；啟動子能啟動轉錄過程，即有了啟動子才能驅動基因轉錄出mRNA，②正確；終止子的作用是使轉錄在所需要的地方停止，③正確；不同的基因表達載體構建方法不同，④錯誤。綜上所述，C符合題意。 5．(2016江蘇高考)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中標注了相關限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復標注。請回答下列問題： (1)用圖中質粒和目的基因構建重組質粒，應選用________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過________酶作用后獲得重組質粒。為了擴增重組質粒，需將其轉入處于________態(tài)的大腸桿菌中。 (2)為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中________________________。 (3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為________，對于該部位，這兩種酶________(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。 (4)若用Sau3AⅠ切圖1質粒最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。 答案　(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA連接　感受 (2)四環(huán)素　引物甲和引物丙 (3)　都不能 (4)7 解析　(1)由題圖可知，質粒的兩個標記基因中都含有BamHⅠ的切點，因此不能用BamHⅠ進行切割，結合題干及表中信息可知質粒中不含Sau3AⅠ的切點，因此也不能用Sau3AⅠ進行切割，所以只能用質粒中和目的基因兩端都含有切點的BclⅠ和HindⅢ這兩種限制酶來切割目的基因和質粒。酶切后的載體和目的基因片段，通過DNA連接酶作用后獲得重組質粒。要將重組質粒轉入大腸桿菌，要先用CaCl2處理大腸桿菌，使其處于感受態(tài)。 (2)重組質粒中只含有四環(huán)素抗性基因這一個標記基因，所以為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，含有重組質粒的大腸桿菌能在該平板上長出菌落。要用PCR擴增目的基因，所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙，因為從圖2中可以看出，引物甲與引物丙與模板鏈結合后能完成目的基因的復制。 (3)BamHⅠ酶切的DNA末端是，BclⅠ酶切的DNA末端是，這兩個末端連接后的連接部位的6個堿基對序列為，由于連接后的6個堿基對序列中沒有BamHⅠ和BclⅠ能識別的酶切位點，故對于該部位BamHⅠ和BclⅠ都不能將其切開。 (4)因為質粒的BamHⅠ和BclⅠ識別序列中都有Sau3AⅠ的識別序列和切割位點，所以用Sau3AⅠ切圖1質粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ切點及得到的7種大小不同的DNA片段情況如下：①切點在1或2或3的位置可以分別得到1種DNA分子，但其大小相同；②切點在1和2的位置可以得到2種DNA分子；③切點在1和3的位置可以得到2種DNA分子；④切點在2和3的位置可以得到2種DNA分子，故最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。 技法提升 1.基因表達載體構建時限制酶的選擇 (1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類 ①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。 ②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。 ③為避免目的基因和質粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切點)。 (2)根據(jù)質粒的特點確定限制酶的種類 ①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致(也可以是能形成相同黏性末端的不同限制酶)，以確保具有相同的黏性末端。 ②質粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標記基因；如果所選酶的切點不止一個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復制起點區(qū)，則切割重組后的片段進入受體細胞后將不能自主復制。 2.基因表達載體中啟動子、終止子的來源 (1)如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，目的基因中已含有啟動子、終止子，在構建基因表達載體時，不需要在質粒上接上特定的啟動子、終止子。 (2)如果目的基因是通過人工方法合成的，或通過cDNA文庫獲得的，則目的基因是不含啟動子和終止子的。因此，在構建基因表達載體時，需要在與質粒結合之前，在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。 題型四 目的基因的導入與檢測 6．下面為利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關敘述，正確的是(　　) A．②的構建需要限制性核酸內切酶和DNA聚合酶參與 B．③侵染植物細胞后，重組Ti質粒整合到④的染色體上 C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲性狀 D．⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異 答案　D 解析　構建重組質粒需要用到限制性核酸內切酶和DNA連接酶，不需要DNA聚合酶，A錯誤；含重組Ti質粒的農桿菌侵染植物細胞后，重組Ti質粒的TDNA整合到受體細胞的染色體上，而不是重組Ti質粒整合到受體細胞的染色體上，B錯誤；導入受體細胞的目的基因表達后，轉基因植株方能表現(xiàn)出相應性狀，若目的基因在受體細胞中不表達，轉基因植株不能表現(xiàn)出相應性狀，C錯誤；⑤表現(xiàn)出抗蟲性狀則表明該植株細胞發(fā)生了基因重組，基因重組是可遺傳變異，D正確。 7．(2019威海模擬)科學家將人的生長激素基因與某種細菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子進行重組，并成功地在該細菌中得以表達(如下圖)。請據(jù)圖分析回答： (1)細菌是理想的受體細胞，這是因為它__________________。 (2)質粒A與目的基因結合時，首先需要用________酶將質粒切開“缺口”，然后用________酶將質粒與目的基因“縫合”起來。 (3)若將細菌B先接種在含有________的培養(yǎng)基上能生長，說明該細菌中已經導入外源質粒，但不能說明外源質粒是否成功插入目的基因；若將細菌B再重新接種在含有________的培養(yǎng)基上不能生長，則說明細菌B中已經導入了插入目的基因的重組質粒。 答案　(1)繁殖快、單細胞、遺傳物質相對較少 (2)限制性核酸內切　DNA連接 (3)氨芐青霉素　四環(huán)素 解析　(1)細菌具有繁殖快、單細胞、遺傳物質相對較少等優(yōu)點，因此是基因工程中的理想的受體細胞。 (2)構建基因表達載體時，需先用限制酶分別切割目的基因和載體，再用DNA連接酶將兩者連接起來。 (3)質粒A和重組質粒中都有完整的氨芐青霉素抗性基因，因此細菌有氨芐青霉素抗性說明該細菌中已經導入外源質粒，但不能說明外源質粒是否成功插入目的基因；重組質粒中四環(huán)素抗性基因內插入了目的基因，不能表達，因此若細菌再對四環(huán)素無抗性，則說明細菌B中已經導入了插入目的基因的重組質粒。 技法提升 如何篩選出含有目的基因的受體細胞 (1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內部，則四環(huán)素抗性基因失活。 (2)被轉化的細菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含質粒的細菌。 (3)篩選方法：將含有重組質粒的細菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質粒的細菌和含質粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進行培養(yǎng)。 考點3　基因工程的應用及蛋白質工程 題型一 基因工程的應用 1．(2018山東聊城二模)普通番茄細胞中含有PG基因，其能控制合成多聚半乳糖醛酸酶(簡稱PG)，PG能破壞細胞壁使番茄軟化不耐貯藏?？茖W家將抗PG基因導入番茄細胞，培育出了抗軟化、保鮮時間長的轉基因番茄。如圖表示抗PG基因的作用原理，回答下列問題： (1)據(jù)圖回答該轉基因番茄具有抗軟化、保鮮時間長的原理是______________________________。 (2)為培育抗軟化番茄，應采用________技術將抗PG基因進行體外擴增。在該技術的反應體系中除模板、引物、原料外，還需要加入________，這個基因的表達需要________等不可缺少的調控組件。 (3)將抗PG基因插入Ti質粒的________上構建基因表達載體，通過農桿菌轉化法將抗PG基因導入番茄細胞，為檢驗抗PG基因是否成功表達，在個體生物學水平上應檢測______________________。 (4)為避免抗PG基因通過花粉傳播進入其他植物而導致“基因污染”，應將抗PG基因導入________(填“細胞核”或“細胞質”)。 答案　(1)抗PG基因能阻止PG基因表達的翻譯過程，使細胞不能合成PG (2)PCR(多聚酶鏈式反應)　熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)　啟動子、終止子 (3)T－DNA　轉基因番茄是否抗軟化以及保鮮時間的長短 (4)細胞質 解析　(1)據(jù)題圖可知，抗PG基因轉錄成的mRNA能夠與PG基因轉錄成的mRNA結合，阻止了PG基因表達的翻譯過程，使細胞不能合成PG，不能破壞細胞壁而使轉基因番茄抗軟化且保鮮時間延長。 (2)采用PCR技術將抗PG基因進行體外擴增；PCR過程所需要的條件有：模板(抗PG基因)、引物、原料(四種游離的脫氧核糖核苷酸)、熱穩(wěn)定DNA聚合酶；啟動子、終止子等是基因表達不可缺少的調控組件。 (3)將抗PG基因插入Ti質粒的T－DNA上構建基因表達載體，通過農桿菌轉化法將抗PG基因導入番茄細胞，為檢驗抗PG基因是否成功表達，在個體生物學水平上應檢測轉基因番茄是否抗軟化以及保鮮時間的長短。 (4)花粉中的雄配子幾乎不含質基因，所以為避免抗PG基因通過花粉傳播進入其他植物而導致“基因污染”，應將抗PG基因導入細胞質。 題后歸納 有關基因工程應用的四個易錯點 (1)動物基因工程主要是為了改善畜產品的品質，而不是為了產生體型巨大的個體。 (2)Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并無毒性，進入昆蟲消化道被分解成多肽后產生毒性。 (3)青霉素是青霉菌產生的，不是通過基因工程產生的。 (4)并非所有個體都可作為乳腺生物反應器。操作成功的應該是雌性個體，個體本身的繁殖速度較高，泌乳量、蛋白含量等都是應該考慮的因素。 題型二 蛋白質工程 2．(2015全國卷Ⅱ)已知生物體內有一種蛋白質(P)，該蛋白質是一種轉運蛋白，由305個氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性?；卮鹣铝袉栴}： (1)從上述資料可知，若要改變蛋白質的功能，可以考慮對蛋白質的________進行改造。 (2)以P基因序列為基礎，獲得P1基因的途徑有修飾________基因或合成________基因。所獲得的基因表達時是遵循中心法則的，中心法則的全部內容包括________的復制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即：________________________________。 (3)蛋白質工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預期蛋白質功能出發(fā)，通過__________________和__________________，進而確定相對應的脫氧核苷酸序列，據(jù)此獲得基因，再經表達、純化獲得蛋白質，之后還需要對蛋白質的生物________進行鑒定。 答案　(1)氨基酸序列(或結構) (2)P　P1　DNA和RNA(或遺傳物質)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(或轉錄、逆轉錄、翻譯) (3)設計蛋白質的結構　推測氨基酸序列　功能 解析　(1)從題中所述資料可知，將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸后，該蛋白質的功能發(fā)生了改變，此過程是通過對構成蛋白質的氨基酸序列進行改造，進而改變了蛋白質的結構，從而改變了蛋白質的功能。 (2)在蛋白質工程中，目的基因可以以P基因序列為基礎，對生物體內原有P基因進行修飾，也可以通過人工合成法合成新的P1基因。所獲得的基因表達遵循中心法則時，中心法則的全部內容包括DNA和RNA復制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即DNA→RNA，RNA→DNA，RNA→蛋白質。 (3)蛋白質工程的基本途徑是預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→合成DNA→表達出蛋白質，經過該過程得到的蛋白質，需要對其生物功能進行鑒定，以保證其發(fā)揮正常作用。 知識拓展 蛋白質工程與基因工程的比較 實驗16　　DNA的粗提取與鑒定 1．DNA粗提取和鑒定的原理 (1)提取思路：利用DNA和其他物質在理化性質方面的差異，提取DNA。 (2)DNA的理化性質(提取和鑒定原理)： ①DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同 ②DNA不溶于酒精； ③對酶、高溫和洗滌劑的耐受性強； ④DNA＋二苯胺試劑藍色。 2．DNA粗提取和鑒定的操作流程 1．(2018揚州江都中學段考)下列有關“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是(　　) A．DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸餾水 B．向雞血細胞液中加蒸餾水是為了釋放出DNA C．向濃鹽溶液中加蒸餾水是為了析出DNA D．用菜花替代雞血做實驗，其實驗操作步驟相同 答案　D 解析　DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸餾水，A正確；向雞血細胞液中加蒸餾水是為了讓雞血細胞吸水漲破，從而釋放出DNA，B正確；向溶解DNA的濃鹽溶液中加蒸餾水是為了降低DNA的溶解度，進而析出DNA，C正確；用菜花替代雞血作為實驗材料，其實驗操作步驟不完全相同，如植物細胞有細胞壁，破碎細胞時需要充分攪拌和研磨并加入食鹽和洗滌劑，D錯誤。 2．下列關于“DNA的粗提取和鑒定”實驗依據(jù)原理的敘述，錯誤的是(　　) A．利用DNA不溶于酒精溶液，而蛋白質能溶于酒精溶液，可將DNA與蛋白質分離 B．利用高溫能使蛋白質變性，卻對DNA沒有影響的特性，可將DNA與蛋白質分離 C．利用二苯胺與DNA沸水浴呈現(xiàn)藍色可用于DNA的鑒定 D．在DNA濾液中加入嫩肉粉，通過木瓜蛋白酶的作用，可將DNA與蛋白質分離 答案　B 解析　高溫能使蛋白質、DNA變性，蛋白質在60～80 ℃發(fā)生變性，而DNA在80 ℃以上才變性，不能將DNA與蛋白質分離。 3．下列關于“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是(　　) 答案　A 解析　蒸餾水與雞血細胞混合的目的是使紅細胞吸水漲破，釋放出核物質，B錯誤；將蒸餾水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中，其目的是降低DNA的溶解度，初步析出DNA，C錯誤；加入冷卻酒精的目的是進一步析出DNA，D錯誤。 題后歸納 DNA的粗提取與鑒定實驗中的“2、4、4” 方向真題體驗 1．(2018全國卷Ⅱ)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1－GFP融合基因(簡稱為甲)，并將其插入質粒P0，構建了真核表達載體P1，其部分結構和酶切位點的示意圖如下，圖中E1～E4四種限制酶產生的黏性末端各不相同。 回答下列問題： (1)據(jù)圖推斷，該團隊在將甲插入質粒P0時，使用了兩種限制酶，這兩種酶是____________。使用這兩種酶進行酶切是為了保證______________，也是為了保證__________________。 (2)將P1轉入體外培養(yǎng)的牛皮膚細胞后，若在該細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了________和________過程。 (3)為了獲得含有甲的牛，該團隊需要做的工作包括：將能夠產生綠色熒光細胞的________移入牛的________________________中、體外培養(yǎng)、胚胎移植等。 (4)為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR方法進行鑒定。在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的________(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作為PCR模板。 答案　(1)E1和E4　甲的完整　甲與載體正確連接 (2)轉錄　翻譯 (3)細胞核　去核卵母細胞 (4)核DNA 解析　(1)甲是將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端而獲得的L1－GFP融合基因，據(jù)此結合題意并分析圖示可知：該團隊在將甲插入質粒P0時，如果用E2或E3，則目的基因不完整，而使用E1和E4這兩種限制酶進行酶切保證了甲的完整，而且也保證了甲與載體正確連接，因此，使用的兩種限制酶是E1和E4。 (2)構建的真核表達載體P1中含有GFP基因，而GFP基因的表達產物“某種熒光蛋白(GFP)”在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光。若在導入P1的牛皮膚細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了表達?；虻谋磉_過程包括轉錄和翻譯。 (3)若要獲得含有甲的牛，可采用核移植技術，即將能夠產生綠色熒光細胞的細胞核移入牛的去核卵母細胞中獲得重組細胞，并將該重組細胞在體外培養(yǎng)成重組胚胎，再經過胚胎移植等獲得含有甲的牛。 (4)PCR是多聚酶鏈式反應的縮寫，是一種在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。若利用PCR方法檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，則應分別以該牛不同組織細胞中的核DNA作為PCR模板。 2．(2018江蘇高考)為生產具有特定性能的α－淀粉酶，研究人員從某種海洋細菌中克隆了α－淀粉酶基因(1656個堿基對)，利用基因工程大量制備α－淀粉酶，實驗流程如圖。請回答下列問題： (1)利用PCR技術擴增α－淀粉酶基因前，需先獲得細菌的________。 (2)為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的________端加上限制性酶切位點，且常在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是________________________________________________。 (3)進行擴增時，反應的溫度和時間需根據(jù)具體情況進行設定，下列選項中________的設定與引物有關，________的設定與擴增片段的長度有關。(填序號) ①變性溫度　②退火溫度?、垩由鞙囟取、茏冃詴r間 ⑤退火時間　⑥延伸時間 (4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α－淀粉酶的mRNA 的部分堿基序列： 5′－U……－3′ 圖中虛線框內mRNA片段包含________個密碼子，如虛線框后的序列未知，預測虛線框后的第一個密碼子最多有________種。 (5)獲得工程菌表達的α－淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測定酶活性，結果如下： 根據(jù)上述實驗結果，初步判斷該α－淀粉酶活性最高的條件為____________________________________________________。 答案　(1)基因組DNA (2)5′　使DNA片段能定向插入表達載體，減少自連 (3)②?、蕖?4)8　13 (5)pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L Tirs－HCl 解析　(1)由題干信息可知某種海洋細菌含有α－淀粉酶基因，因此在擴增α－淀粉酶基因前需先從細菌中提取細菌的基因組DNA。 (2)由于引物的作用是引導子鏈的延伸，將脫氧核苷酸連接到引物上時，是與引物的3′端相連的，由此確定需在引物的5′端加上限制性酶切位點。常在兩條引物上加入不同的限制酶切位點的主要目的是使DNA片段能定向插入表達載體，防止自身相連。 (3)進行PCR擴增時，退火的溫度與引物長短和堿基種類有關。延伸時間長短的設定與擴增片段的長度有關。 (4)密碼子是指mRNA上決定一個氨基酸的三個相鄰的堿基，該mRNA 上5′端為AUG(起始密碼子)，因此可依據(jù)三個堿基是一個密碼子來分析圖中虛線框中的堿基，可得出共有8個密碼子。由于虛線框后的第一個密碼子的第一個堿基已經固定為U，因此還有2個堿基未知，共可能有的種數(shù)為44＝16，又因為UAG、UGA、UAA為終止密碼子，因此決定氨基酸的密碼子最多有13種。 (5)據(jù)表格數(shù)據(jù)可知：α－淀粉酶在pH為8.5、緩沖液為50 mmol/L Tris－HCl的條件下相對活性為99.5%，初步判斷此條件下酶活性最高。 3．(2018天津高考)甲型流感病毒為RNA病毒，易引起流感大規(guī)模流行。我國科學家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環(huán)節(jié)如下。 (1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細胞內的增殖能力。以病毒RNA為模板，逆轉錄成對應DNA后，利用________技術擴增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達時不能合成完整長度的________，因此不能產生子代病毒。將該改造基因、表面抗原基因等其他基因分別構建重組質粒，并保存。 (2)構建適合改造病毒增殖的轉基因宿主細胞。設計合成一種特殊tRNA的基因，其產物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結合，并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與________連接后導入宿主細胞。提取宿主細胞的________進行分子雜交鑒定，篩選獲得成功表達上述tRNA的轉基因宿主細胞。 (3)利用轉基因宿主細胞制備疫苗。將(1)中的重組質粒導入(2)中的轉基因宿主細胞，并在補加________的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，則該宿主細胞能利用上述特殊tRNA，翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，產生大量子代病毒，用于制備疫苗。特殊tRNA基因轉錄時，識別其啟動子的酶是________(單選)。 A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶 C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶 (4)上述子代病毒不能在正常宿主細胞中增殖，沒有致病性，因此不經滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比，該病毒活疫苗的優(yōu)勢之一是可引起________免疫，增強免疫保護效果。 答案　(1)PCR　多肽(或蛋白質) (2)載體　總RNA (3)非天然氨基酸(Uaa)　D (4)細胞 解析　(1)利用PCR技術體外擴增DNA。若將基因中個別編碼氨基酸的序列替換為編碼終止密碼子的序列，則改造后的基因轉錄合成的mRNA中，終止密碼子提前出現(xiàn)，將不能控制合成完整長度的多肽(或蛋白質)。 (2)目的基因只有與載體連接后才能導入宿主細胞?？商崛∷拗骷毎目俁NA進行分子雜交鑒定，以篩選獲得成功表達題述tRNA的轉基因宿主細胞。 (3)由(2)知，轉基因宿主細胞含有的特殊tRNA基因轉錄的tRNA，該tRNA的反密碼子可與終止密碼子配對，并可攜帶非天然氨基酸(Uaa)，所以培養(yǎng)基中需補加非天然氨基酸(Uaa)。病毒中的基因進行轉錄時，識別其啟動子的酶是宿主的RNA聚合酶。 (4)因該病毒疫苗具有侵染性，故可引起細胞免疫。 4．(2018全國卷Ⅰ)回答下列問題： (1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Coben)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達，該研究除證明了質粒可以作為載體外，還證明了_____________________(答出兩點即可)。 (2)體外重組的質?？赏ㄟ^Ca2＋參與的________方法導入大腸桿菌細胞，而體外重組的噬菌體DNA通常需與______________組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導入宿主細胞。在細菌、心肌細胞、葉肉細胞中，可作為重組噬菌體宿主細胞的是____________。 (3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細胞內表達時，表達出的蛋白質可能會被降解。為防止蛋白質被降解，在實驗中應選用__________________的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化的過程中應添加________的抑制劑。 答案　(1)體外重組的質?？梢赃M入受體細胞；真核生物基因可在原核細胞中表達 (2)轉化　外殼蛋白(噬菌體蛋白)　細菌 (3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶 解析　(1)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達，該過程證明了體外重組的質?？梢赃M入受體細胞，真核生物基因可在原核細胞中表達等。 (2)用Ca2＋處理大腸桿菌細胞，可以增大細胞膜的通透性，使重組的質粒更容易導入到受體細胞內，因此體外重組的質粒可通過Ca2＋參與的轉化方法導入大腸桿菌細胞。體外重組的噬菌體DNA通常需與蛋白質外殼組裝成完整的噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組噬菌體DNA導入受體細胞。噬菌體主要寄生在細菌體內，而不能寄生在其他細胞中，因此可作為重組噬菌體宿主細胞的是細菌。 (3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細胞內表達時，表達出的蛋白質可能會被降解，為防止蛋白質被降解，可以選用不能產生該蛋白酶的缺陷細菌以及使用能夠抑制蛋白酶活性的藥物，因此為防止蛋白質被降解，在實驗中應選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化的過程中應添加蛋白酶的抑制劑。 5．(2017全國卷Ⅰ)真核生物基因中通常有內含子，而原核生物基因中沒有，原核生物沒有真核生物所具有的切除內含子對應的RNA序列的機制。已知在人體中基因A(有內含子)可以表達出某種特定蛋白(簡稱蛋白A)。回答下列問題： (1)某同學從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細胞卻未得到蛋白A，其原因是____________________________ ________________________________________________________。 (2)若用家蠶作為表達基因A的受體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用________作為載體，其原因是 _________________________________________________________。 (3)若要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。因為與家蠶相比，大腸桿菌具有 ____________________________________________________________(答出兩點即可)等優(yōu)點。 (4)若要檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用的檢測物質是________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”)。 (5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉化實驗為證明DNA是遺傳物質做出了重要貢獻，也可以說是基因工程的先導，如果說他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是 _________________________________________________________。 答案　(1)基因A有內含子，在大腸桿菌中，其初始轉錄產物中與內含子對應的RNA序列不能被切除，無法表達出蛋白A (2)噬菌體　噬菌體的宿主是細菌，而不是家蠶 (3)繁殖快、容易培養(yǎng) (4)蛋白A的抗體 (5)DNA可以從一種生物個體轉移到另一種生物個體 解析　(1)人是真核生物，從人的基因組文庫中獲得的基因A有內含子，而受體細胞大腸桿菌是原核生物，原核生物基因中沒有內含子，相應的就沒有切除內含子對應的RNA序列的機制，故無法表達出蛋白A。 (2)噬菌體是專一性侵染細菌的病毒，以細菌為宿主細胞，而昆蟲病毒侵染的是昆蟲，以昆蟲為宿主細胞。家蠶屬于昆蟲，故應選用昆蟲病毒作為載體。 (3)與家蠶相比，大腸桿菌具有繁殖快、容易培養(yǎng)等優(yōu)點，故要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。 (4)檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用相應的抗體即蛋白A的抗體進行抗原—抗體雜交。 (5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉化實驗中，S型細菌的DNA可以使R型細菌發(fā)生轉化，說明可調控多糖莢膜產生的基因整合到了R型細菌的DNA分子中并成功得以表達。也就是說DNA可以從一種生物個體轉移到另一種生物個體并進行表達，這就為基因工程理論的建立提供了啟示。