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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,,單擊此處編輯母版文本樣式,,第二級(jí),,第三級(jí),,第四級(jí),,第五級(jí),,,*,第 六 章,微 生 物 的 生 長,,繁殖 及 其 控 制,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,微生物的分離和純培養(yǎng),,微生物的生長繁殖,及其測定,,微生物生長繁殖的,控制,,內(nèi)容提要,?,,?,?,,無菌技術(shù),微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌,干熱滅菌,,濕熱滅菌,接種操作,無菌條件下進(jìn)行,工具:接種環(huán)或接種針,,純培養(yǎng),的分離方法,,稀釋倒(涂)平板法,劃線法,選擇培養(yǎng)基分離法,單細(xì)胞(孢子)分離,,二元培養(yǎng)物,主要用于病毒等寄生生物的培養(yǎng),培養(yǎng)物中含有兩種微生物,并有意識(shí)地保持二者之間
2、的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱為二元培養(yǎng)物,,微生物的保藏技術(shù),干燥保藏法,,常用作中期保藏,時(shí)間為,1,~,5,年,傳代培養(yǎng)保藏,,常用作短期保藏,,4℃,保藏,時(shí)間為,3,~,4,月,冷凍保藏法,,常用作長期保藏,時(shí)間為,5,~,10,年及以上,,微生物的生長繁殖及其測定,微生物生長的測定,,計(jì)數(shù)法、重量法、生理指標(biāo)法,微生物的生長繁殖,,細(xì)菌群體生長的規(guī)律,,細(xì)菌群體生長的數(shù)學(xué)模型,,細(xì)菌群體生長的主要參數(shù),,同步培養(yǎng),,連續(xù)培養(yǎng),,生長曲線,(growth curve),描述細(xì)菌生長規(guī)律,總菌數(shù),活菌數(shù),培養(yǎng)時(shí)間,Ⅱ,.,對數(shù)期,Ⅲ,.,穩(wěn)定期,Ⅳ,.,衰亡期,Ⅰ,.,遲緩期,細(xì)菌數(shù)目(個(gè),/m
3、l,),對數(shù),Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅰ,細(xì)菌群體生長的規(guī)律,,延滯期,出現(xiàn)原因,把細(xì)菌接種到新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),并不立即進(jìn)行分裂繁殖,細(xì)菌增殖數(shù)為0,這時(shí),需要合成多種酶,輔酶和某些中間代,,謝產(chǎn)物,要經(jīng)過一個(gè)調(diào)整和適應(yīng)過程 。,,遲緩,期特點(diǎn),生長速率常數(shù)等于零,菌體粗大,,,代謝活力強(qiáng),,對不良條件抵抗能力降低,RNA含量增加,,,影響延滯期限長短因素,接種齡,接種量,培養(yǎng)基成分,,,縮短延滯期的意義和方法,可以縮短生產(chǎn)周期,提高設(shè)備利用率。,,接種對數(shù)生長期的菌種,采用最適菌齡,,加大接種量,用與培養(yǎng)菌種相同組成分的培養(yǎng)基,,,指數(shù)期,(,對數(shù)期,),(exponential phase),,特
4、點(diǎn),該期的細(xì)菌生產(chǎn)中多被用做種子和科學(xué)試驗(yàn)材料,①,活菌數(shù)和總菌數(shù)接近,②,酶系活躍,代謝旺盛。,③,生長速率最大,,generation time,最短。,④,細(xì)胞的化學(xué)組成及形態(tài),,,生理特性比較一致,,,N,t,N,0,t,1,t,0,培養(yǎng)時(shí)間,Lg,,細(xì)胞數(shù),/ml,t,2,- t,1,3.322(lgN,t,-lgN,0,),生長速率常數(shù),R=,t,1,- t,0,3.322(lgN,t,-lgN,0,),代時(shí),G=,指數(shù),期生長的數(shù)學(xué)模型,繁殖代數(shù),n=3.322(lgN,t,-lgN,0,),,影響,指數(shù)期,的因素,菌種,營養(yǎng)成分,營養(yǎng)物濃度,培養(yǎng)溫度,,,穩(wěn)定期,(
5、stationary phase),,出現(xiàn)原因,,營養(yǎng)的消耗,有害代謝產(chǎn)物積累,pH,值,Eh,值等理化條件不適,出現(xiàn)原因,,營養(yǎng)物比例失調(diào),,穩(wěn)定期,特點(diǎn),活菌數(shù)保持相對穩(wěn)定,總菌數(shù)達(dá)最高水平。,細(xì)菌代謝物積累達(dá)到最高峰。,芽孢桿菌這時(shí)開始形成芽孢。,這是生產(chǎn)收獲時(shí)期。,,,衰亡期,(decline phase/death phase),,特點(diǎn),細(xì)菌死亡數(shù)大于增殖數(shù),,,活菌數(shù)明顯減少,,,群體衰落,細(xì)胞出現(xiàn)多形態(tài),,,大小不等的 畸形,,,變成衰退型,細(xì)胞死亡,,,出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。,,,離心法,硝酸纖維素濾膜法,獲得同步生長,(synchronous growth),的方法:,機(jī)械方法,環(huán)境
6、條件控制技術(shù)(溫度、培養(yǎng)基成分控制、其它),過濾法,同步培養(yǎng),(synchronous culture),使培養(yǎng)基中細(xì)菌同時(shí)分裂,處于相同的生長階段叫同步生長。,,連續(xù)培養(yǎng),(continuous culture)(open culture),將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中培養(yǎng),最后一次收獲,叫分批培養(yǎng),將微生物放在恒定的容積的流動(dòng)系統(tǒng)中培養(yǎng)稱為連續(xù)培養(yǎng)。,優(yōu)點(diǎn):縮短發(fā)酵周期;便于自動(dòng)控制;產(chǎn)物質(zhì),要,量均一,,缺點(diǎn):菌種易退化;易染雜菌,,,,……,含,N,量法,DNA/RNA法,葉綠素法,菌體內(nèi)重要組成測定法,微生物生長的測定,,稱,重量法,測體積法,N,×,6.25=Pr,,測生長量,(
7、,直接法,),,比 濁 法,生理指標(biāo)法,測生長量,(,間接法,),,計(jì)繁殖數(shù),血球計(jì)數(shù)板法,液體稀釋法,平板菌落計(jì)數(shù)法,濾膜,培養(yǎng)法,各種型號(hào)的全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀,,微生物生長繁殖的控制,,環(huán)境因子對微生物生長的影響,控制微生物的物理因素,控制微生物的化學(xué)物質(zhì),,環(huán)境因子對微生物生長的影響,,營養(yǎng)物質(zhì),氧,水的活性,溫度,pH,,嗜冷微生物,(低溫微生物),E系在低溫下仍能起催化作用,細(xì)胞膜含較多的不飽合脂肪酸在低溫下仍,,具有通透性。,上下班,嗜冷機(jī)制:,,,嗜熱微生物,的嗜熱機(jī)制,細(xì)胞內(nèi)的E具強(qiáng)抗熱性,產(chǎn)生的多胺,熱亞胺和高溫精胺物質(zhì)對蛋白質(zhì),,等組織結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。,一一一一一口口口
8、,核酸也具有熱穩(wěn)定性的保護(hù)結(jié)構(gòu)。,細(xì)胞膜含有較多的飽和脂肪酸和直鏈脂肪酸,,,使膜具有穩(wěn)定性。,上,,,pH,影響細(xì)胞膜透性與穩(wěn)定性,影響物質(zhì)溶解度,影響細(xì)胞表面電荷分布,因此影響微生物生長、繁殖,發(fā)育。,各類微生物能夠生長的,pH,值較寬,,,但細(xì)胞內(nèi)部,pH,值,卻接近中性。,,微生物的活動(dòng)也能改變環(huán)境中的,pH,值,,氧氣,專性好氧菌(,obligate or strict aerobes,),兼性厭氧菌(,facultative anaerobes,),,耐氧菌(,aerotolerant,anaerobes,),厭氧菌(,anaerobes,),微好氧菌(,microaerophil
9、ic,bacteria,),超氧化物歧化酶,(,SOD,)和,過氧化氫酶,,,(,Catalase,,),,厭氧菌(,anaerobes,),將環(huán)境中氧吸掉;抽真空;深層培養(yǎng),氧對其有毒,能量來源于發(fā)酵無氧呼吸環(huán)式光合磷酸化或甲烷發(fā)酵,O,2,.,-,超氧陰離子自由基 普遍存在,H,2,O+,1/2,O,2,,,,過氧化氫酶,(好氧菌),2H,2,O,過氧化氫酶,(耐氧菌),NADH,2,NAD,O,2,.,+2H,+,H,2,O,2,+O,2,,,,-,SOD,(好氧菌及耐氧菌),1,,1,,1,,細(xì)胞內(nèi)缺泛,SOD,、細(xì)胞色素氧化酶和過氧化氫酶,A,.,,+,,B,.,A,
10、:,B,,共價(jià)結(jié)合,均裂,,固體培養(yǎng)法,液體培養(yǎng)法,好氧菌的固體培養(yǎng),厭氧菌的固體培養(yǎng),好氧菌的液體培養(yǎng),厭氧菌的液體培養(yǎng),試管培養(yǎng),三角瓶(搖瓶),臺(tái)式發(fā)酵罐,,高層瓊脂柱,厭氧培養(yǎng)皿,,厭氧罐,厭氧手套箱,好氧及厭氧,微生物培養(yǎng)法,實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法,生產(chǎn)實(shí)踐中的培養(yǎng)微生物裝置,固體培養(yǎng)法,液體培養(yǎng)法,好氧菌,-,曲法培養(yǎng),厭氧菌,-,堆積培養(yǎng),發(fā)酵罐(,Fermenter,),,控制,微生物的,物理因素及化學(xué)因素,,幾個(gè)基本概念,物理滅菌因素的代表,—,高溫,化學(xué)殺菌劑、消毒劑和治療劑,,消毒,(disinfection),:殺死或消除物體上的病原微生,,物的方法,滅菌(,sterilitio
11、n,):殺死物體上全部微生物的方法,防腐,(antisepsis),:用理化方法防止抑制微生物生長,,的方法,幾個(gè)基本概念,化療,(chemotherapy),:利用對病源菌具有高度毒力而,,對宿主基本無毒的化學(xué)物質(zhì)來抑制,,宿主體內(nèi)病源微生物的生長繁殖,,高溫滅菌,多數(shù)細(xì)菌,酵母菌和霉菌的營養(yǎng)細(xì)胞和病毒在,,50-65,o,C,10 min,可以致死。,F,,一般噬菌體,65,-,80,o,C致死,,放線菌霉菌的孢子比營養(yǎng)細(xì)胞抗熱性強(qiáng),,,76,-,80,o,C,10min,可以殺死,B,,細(xì)菌芽孢,在,100,o,C下5-,20min,才能致死,,嗜熱脂肪芽孢桿菌可在,80,o,C條件下生
12、活,,,在,120,o,C,,12min,才能殺死,,BBBBBBBBBBB,同種微生物老齡菌比幼菌耐熱。,,,高溫滅菌,干熱滅菌,(dry heat sterilization),濕熱滅菌,(,mosist,heat sterilization),,焚燒滅菌法:常用與廢棄物動(dòng)物尸體等處理。,烘烤滅菌法;實(shí)驗(yàn)室用干燥箱烘烤接種工具。,,,濕熱滅菌,(,mosist,heat sterilization),,煮沸滅菌法(煮沸消毒法),高壓蒸汽滅菌法,間歇滅菌法,巴斯德消毒法:(巴氏消毒法),該法比干熱滅菌效果好,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在有水的,,情況下容易凝固,如含水,50,%,蛋白質(zhì)凝固溫度,,為,56,
13、o,C,;含水6%蛋白質(zhì)凝固溫度為,160-170,o,C,,,煮沸滅菌法(煮沸消毒法),,物品在水中煮沸,15min,,,可殺死所有營養(yǎng)細(xì)胞和一部分芽孢。在水中加入1%的N,a,2,CO,3,或2-5%的石炭酸效果更好。此法適合注射器和解剖用具的消毒。,,,,高壓蒸汽滅菌,,(normal,autoclving,),是濕熱滅中最好方法,通常在,1.05kg/cm,2,,,的壓力下面(此時(shí),,溫度,121,o,C,)處理,15,-,30min,。,要排冷,否則會(huì)形成假壓,雖然壓力達(dá)到要求,溫度卻達(dá)不到相應(yīng)高度,而影響滅菌效果。,,間歇滅菌法,(fractional sterilization)
14、,,是用常壓蒸汽反復(fù)幾次進(jìn)行滅菌的方法。,,主要用于不宜高壓滅菌的培養(yǎng)基,,,不耐熱的藥物和營養(yǎng)物等,方法是將待滅菌物品置于蒸鍋內(nèi)加熱到沸騰維持,15-30min,,殺死營養(yǎng)細(xì)胞,取出冷卻后在,37,o,C,恒溫培養(yǎng),24,小時(shí),使芽,,孢萌發(fā),再用此法滅菌,反復(fù)三次,即可達(dá)到滅菌目的。,,巴氏消毒法,(pasteurization),是食品(牛奶)釀造(啤酒)工業(yè)中常用的方法。,,處理溫度變化很大,一般在,60,~,85,o,C處理,30min,~,,15s,,,有些做法是,61.7,-,62.8,o,C,處理,30min,或,71.6,o,C,,處理,15min,這樣即可殺死病原微生物。又
15、不致?lián)p壞營養(yǎng),可保留食品飲料原有用味。,根據(jù)結(jié)核桿菌在,62,o,C,下,15min,被致死。,低溫維持法,;,高溫瞬時(shí)滅菌,,輻射,可見光,紫外線,(非電離輻射),,X,射線與,r,射線,,O,2,,紫外線,0,3,0,2,+{,O,},紫外線(非電離輻射),殺菌機(jī)制:,誘導(dǎo)核酸形成胸腺嘧啶二聚體,從而干擾,,GGGGGGGG,了核酸的復(fù)制,H,,,,各種微生物對紫外線抗性,干細(xì)胞強(qiáng)于濕細(xì)胞,芽孢,孢子強(qiáng)于營養(yǎng)細(xì)胞,多倍體 > 二倍體 > 單倍體,,,,控制微生物的化學(xué)物質(zhì),(,因素,),抗微生物劑,抗代謝物,抗生素,化學(xué)治療劑,防腐劑,消毒劑,,酸和堿,重金屬極其鹽類,有機(jī)化合物,氧化
16、劑,,鹵素,,染色劑,表面活性劑,,表面消毒劑,(surface,disinfactant,),,抗代謝物,(,antimetabolite,),有些化合物在結(jié)構(gòu)上與生物體所必需的代謝物很相,,似,以至可以和特定的酶結(jié)合,從而阻礙了酶的功,,能。干擾代謝的正常代謝。這些物質(zhì)稱為抗代謝物。,,葉酸 磺胺類藥物,氨基酸,5,-甲基色氨酸,吡哆醇 異煙肼,嘌呤,6,-巰基嘌呤,抗代謝物,代謝物,,二氫蝶啶,二氫蝶酸,二氫葉酸,四氫葉酸,核 酸,,氨基酸,前 體,PABA,酶,①,酶,②,酶,③,Glu,TMP,COOH,H,2,N,NH,2,SO,2,R,
17、COOH,H,2,N,NH,2,SO,2,R,磺胺藥,(,sulphonamides,sulfa,drugs),抑菌機(jī)理,,TMP:,三甲基芐二氨嘧啶,,,(,磺胺增效劑,),選擇毒力,,是由微生物在代謝過程中產(chǎn)生,(,有的可人工合成,),具,,有一定濃度下抑制或殺死其他微生物的有機(jī)化合物。,F,,每種抗生素都有一定的殺菌范圍,稱為抗菌譜。,G,,抗生素的誕生,神奇的抗生素,抗藥性,抗生素,(antibiotic),,神奇,,的抗生素,抑制細(xì)胞壁的形成,影響細(xì)胞膜的功能,干擾蛋白質(zhì)合成,抑制核酸復(fù)制,和固醇結(jié)合影響細(xì)胞膜透性,作用于呼吸鏈影響能量利用,氨芐青霉素(,ampicillin,),和蛋白結(jié)合影響膜屏蔽作用,,白點(diǎn)是強(qiáng)度各異的抗生素,最底下的青霉素完全沒有黑環(huán),顯示它對鏈球菌已毫無作用,抗藥性,(antibiotic resistance),菌體內(nèi)產(chǎn)生了鈍化,,或分解藥物的酶,F,,改變細(xì)胞膜的透,,性而導(dǎo)致抗藥性,,細(xì)胞內(nèi)被藥物作用的部位發(fā)生了改變,目前,,典型的例子是核糖體發(fā)生了改變。,J,,,抗生素 +核糖體,→,結(jié)合,→,蛋白質(zhì)不能合成,救護(hù)途徑,泵出機(jī)制,,第一次用藥劑量要足,,避免在一個(gè)時(shí)期或長期多次使用同種抗生素,不同抗生素(或其他藥物)混合使用,對現(xiàn)有抗生素改造,篩選新抗生素,可怕的抗藥性,(antibiotic resistance),,,