2019-2020年高中生物第1部分微生物的利用實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離學(xué)案浙科版.doc

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2019-2020年高中生物第1部分微生物的利用實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離學(xué)案浙科版 課　標　解　讀 重　點　難　點 1.進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)的操作。 2.進行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進行細菌的劃線培養(yǎng)。 3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和實驗原理。 1.微生物實驗的無菌操作。 2.利用LB液體培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)。 3.利用LB固體培養(yǎng)基分離大腸桿菌。 4.劃線分離法和涂布分離法。 二、實驗內(nèi)容 1．本實驗的內(nèi)容是將大腸桿菌擴大培養(yǎng)和劃線分離。分離后，一個菌體便會形成一個菌落，這是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達量菌株的最簡便方法之一。 2．本實驗用LB液體培養(yǎng)基(通用的細菌培養(yǎng)基)擴大培養(yǎng)大腸桿菌。培養(yǎng)后再在LB固體平面培養(yǎng)基上劃線進行分離，隨后培養(yǎng)基上便會形成一個個單獨的菌落。 三、細菌的培養(yǎng)和分離 1．細菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，約20分鐘分裂一次。人們在培養(yǎng)細菌時，一般用接種環(huán)轉(zhuǎn)移帶菌的培養(yǎng)物。接種時，先將接種環(huán)在明火上燒紅后冷卻，再操作。 2．細菌的分離 (1)劃線分離法：在液體培養(yǎng)基中，只要接種后培養(yǎng)8 h，每毫升培養(yǎng)基中就有幾億個細菌?？捎媒臃N環(huán)蘸菌液在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線過程中接種環(huán)上的菌液逐漸減少，因此，劃線到最后，可使細菌間的距離加大。在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)10～20 h后，可由一個細菌產(chǎn)生單菌落，菌落不會重疊。如果再將每個菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是由一個細菌產(chǎn)生的后代。這種方法也可用于分離細菌，將污染的雜菌除去。 接種環(huán)在取菌種前和劃線前都要灼燒、而后都要冷卻、操作完畢后又要灼燒的原因是什么？ 【提示】　取菌種前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進行，目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環(huán)的目的是防止細菌污染環(huán)境和操作者。 (2)涂布分離法：先將培養(yǎng)的菌液稀釋，通常稀釋10－5～10－7倍，然后取0.1 mL不同稀釋度的稀釋菌液加在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)南♂尪认?，可產(chǎn)生相互分開的菌落。通常每個培養(yǎng)皿有20個以內(nèi)的單菌落最為適合。將每個菌落分別接種在斜面上擴增培養(yǎng)后，再做功能性實驗。 細菌的兩種分離法各有優(yōu)點，都可采用。劃線分離法，方法簡單；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復(fù)雜些。 四、滅菌操作 1．各種器皿必須是無菌的：實驗用具用牛皮紙或報紙包好，所有容器都先封口，然后進行高壓蒸汽滅菌(1 kg/cm2壓力、121 ℃、15 min)處理，并在超凈臺上使用。 注意：實驗中所需棉花不能用脫脂棉，因為脫脂棉易吸水。 2．各種培養(yǎng)基必須是無菌的。 3．細菌轉(zhuǎn)移過程要避免雜菌污染和菌種外泄。 注意：培養(yǎng)皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基，沖散菌落。 五、大腸桿菌培養(yǎng)與分離的實驗步驟 1．在兩個250 mL三角瓶中分別裝入50 mL LB液體培養(yǎng)基和50 mL LB固體培養(yǎng)基，加上封口膜。將培養(yǎng)皿包好，連同培養(yǎng)基一同滅菌15 min。 2．滅菌后待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃時，關(guān)閉紫外燈，點燃酒精燈，并用酒精棉球擦拭桌面和實驗者的手。在酒精燈火焰旁用右手持盛有固體培養(yǎng)基的三角瓶，左手拿培養(yǎng)皿，并將培養(yǎng)基倒入4個培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于水平位置上，待其凝固。 為什么要在酒精燈火焰旁進行操作？ 【提示】　酒精燈火焰旁約10 cm的空間是一個無菌區(qū)，在酒精燈火焰旁操作能防止雜菌污染。 3．?dāng)U大培養(yǎng) 先將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒紅，再深入到大腸桿菌斜面，使環(huán)冷卻后，取菌體，并將菌體放入三角瓶液體培養(yǎng)基中，封瓶后在37 ℃每分鐘200轉(zhuǎn)的搖床上振蕩培養(yǎng)12 h。 4．劃線分離 用在酒精燈火焰上灼燒后的接種環(huán)深入到搖床上培養(yǎng)后的菌液中，然后在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，接種環(huán)需蘸菌液1次，劃線后蓋好皿蓋，將培養(yǎng)皿倒置，在37 ℃，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h后，可在劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落，表明菌已被分離。 5. 在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。 微生物培養(yǎng)的基本條件 1.培養(yǎng)基及其類型 (1)培養(yǎng)基：①概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，此即培養(yǎng)基。 ②作用：在提供主要營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)及O2的需求，如培養(yǎng)乳酸桿菌時需在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時需將pH調(diào)至酸性，培養(yǎng)厭氧型微生物需給予無氧條件等。 (2)培養(yǎng)基的種類 劃分標準 培養(yǎng)基種類 特點 用途 物理性質(zhì) 液體培養(yǎng)基 不加凝固劑 微生物的擴大培養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn) 半固體培養(yǎng)基 加凝固劑，如瓊脂 觀察微生物的運動、分類鑒定 固體培養(yǎng)基 微生物分離、鑒定、活菌計數(shù)、保藏菌種 用途 選擇培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長 培養(yǎng)、分離出特定微生物(如培養(yǎng)酵母菌和霉菌，可在培養(yǎng)基中加入青霉素；培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，可在培養(yǎng)基中加入高濃度食鹽) 用途 鑒別培養(yǎng)基 根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品 鑒別不同種類的微生物，如可用伊紅—美藍培養(yǎng)基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤) 2.無菌技術(shù) 進行微生物培養(yǎng)獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染，無菌技術(shù)即圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括以下幾個方面： (1)對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。 (2)將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。 (3)為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進行。 (4)實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。 3．消毒和滅菌的比較 概念 常用方法 應(yīng)用的范圍 消毒 使用較為溫和的物理或化學(xué)方法，殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法：在100 ℃開水中煮沸5～6 min 一般物品 巴氏消毒法：70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min 對于一些不耐高溫的液體，如牛奶 化學(xué)藥劑消毒法 如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等 滅菌 使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物(包括芽孢和孢子) 灼燒滅菌：酒精燈火焰 接種工具的滅菌 干熱滅菌：干熱滅菌箱內(nèi)160～170 ℃下滅菌1～2 h 玻璃器皿、金屬工具的滅菌 高壓蒸汽滅菌：121 ℃條件下，滅菌15～30 min 培養(yǎng)基及容器的滅菌 注：消毒與滅菌的最大區(qū)別是芽孢和孢子能否存活 　某小組同學(xué)為了調(diào)查湖水中細菌的污染情況而進行了實驗。實驗包括制備培養(yǎng)基、滅菌、接種及培養(yǎng)、菌落觀察計數(shù)。請回答與此實驗相關(guān)的問題。 (1)制備培養(yǎng)基：根據(jù)物理性質(zhì)的不同，可以將培養(yǎng)基分為液體、半固體和固體培養(yǎng)基。對細菌進行大量的擴增，用________培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；對細菌進行分離，用________培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。 (2)滅菌：在培養(yǎng)微生物時必須進行無菌操作，包括各種________都必須是無菌的。對它們進行滅菌，通常用________法滅菌。 (3)接種及培養(yǎng)：接種時常用的工具是________和玻璃三角刮刀。 為了盡快觀察到細菌培養(yǎng)的實驗結(jié)果，應(yīng)將接種了湖水樣品的平板置于________中培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度設(shè)定在37 ℃。要使該實驗所得結(jié)果可靠，還應(yīng)該同時在另一平板上接種________作為對照進行實驗。 (4)菌落觀察計數(shù)：培養(yǎng)20小時后，觀察到平板上有形態(tài)和顏色不同的菌落，這說明湖水樣品中有________種細菌。一般說來，菌落總數(shù)越多，湖水遭受細菌污染的程度越________。 (5)選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。如果提高培養(yǎng)基中NaCl的濃度，可以用于篩選耐________細菌。 【思路點撥】　(1)細菌擴大培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基，分離用固體培養(yǎng)基。(2)無菌操作包括所有的器皿要無菌，所有的培養(yǎng)基要無菌，接種過程要防止雜菌污染。實驗室中常用高壓蒸汽滅菌法。(3)接種時常用接種環(huán)，用恒溫培養(yǎng)箱保持溫度。在實驗過程中，除實驗變量以外的其他各變量應(yīng)適宜且相同，以利于更好地實現(xiàn)實驗?zāi)康摹?4)不同的菌落具有各自不同的菌落特征(如硬度、顏色、透明度、光滑度等。)(5)選擇培養(yǎng)基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來。 【答案】　(1)液體　固體平面　(2)器皿和培養(yǎng)基 高壓蒸汽滅菌　(3)接種環(huán)　恒溫培養(yǎng)箱　無菌水 (4)多　高　(5)鹽(或NaCl) 1．細菌培養(yǎng)過程中分別采用了高壓蒸汽、用酒精棉球擦試、火焰灼燒等幾種不同的處理，這些方法依次用于殺滅哪些部位的雜菌(　　) A．接種環(huán)、手、培養(yǎng)基 B．高壓鍋、手、接種環(huán) C．培養(yǎng)基、手、接種環(huán) D．接種環(huán)、手、高壓鍋 【解析】　此題考查對無菌技術(shù)的掌握。高壓蒸汽滅菌鍋是滅菌的一個設(shè)備，通常用于培養(yǎng)基的滅菌。用酒精擦拭雙手是消毒的一種方法?；鹧孀茻?，可以迅速徹底地滅菌，適用于微生物接種工具的滅菌，如接種環(huán)。 【答案】　C 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離 1.LB培養(yǎng)基的制備 (1)計算：根據(jù)LB培養(yǎng)基配方的比例，計算配制50 mL 的培養(yǎng)基時各種成分的用量。 (2)稱量：準確地稱取各種成分。即：蛋白胨0.5 g、酵母提取物0.25 g、氯化鈉0.5 g，加水50 mL。(如配LB固體培養(yǎng)基，則再加1 g 瓊脂) (3)制備空白斜面：將LB液體培養(yǎng)基配好，加入瓊脂并加熱使之融化后，通過玻璃漏斗加入試管中，每試管2 mL，加棉塞并將試管捆在一起，上端加蓋一張牛皮紙，滅菌。滅菌后斜靠于平放的鉛筆上，冷卻后即成空白斜面培養(yǎng)基。 2．進行大腸桿菌培養(yǎng)與分離操作 (1)滅菌 (2)制備LB固體平面培養(yǎng)基——倒平板操作 待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。倒平板的具體操作描述如下： (3)擴大培養(yǎng) ①左手持大腸桿菌斜面和有液體培養(yǎng)基的三角瓶，右手拿接種環(huán)并用無名指、小指夾住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。 ②將接種環(huán)在火焰上燒紅，再深入到斜面，使其冷卻后取菌體。 ③將菌體放入三角瓶液體培養(yǎng)基中(將封口膜及斜面棉塞復(fù)原)。 ④三角瓶在37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)12 h。 (4)劃線分離 ①取種 在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)，將上述培養(yǎng)后的菌液打開，接種環(huán)部分深入到菌液中取種。 ②平板劃線操作 在LB固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線(如下圖所示)，劃線后蓋好培養(yǎng)皿。 ③培養(yǎng) 將上述劃線操作后的培養(yǎng)皿倒置放至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，可看到劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落，表明菌已被分離。 (5)菌種純化與保藏 在無菌操作下，將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種至斜面上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，4 ℃冰箱保存即可。 劃線的目的是將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面，以期在連續(xù)劃線后，可以分離到由單個細胞繁殖而來的子細胞群體(菌落)，從而達到純化菌種的目的，為此，在劃線操作時，接種環(huán)只需在菌液中蘸取菌液一次，且作第二次及其以后的劃線操作時，須從上一次劃線的末端劃線——如此可使菌體數(shù)量隨劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散，最終實現(xiàn)在平板上得到單菌落的目的。 　下圖為“大腸桿菌的培養(yǎng)和分離”實驗的基本流程： →→→→ 請回答： (1)滅菌常用________法，滅菌后，要待________________時才能打開鍋蓋。 (2)倒平板和接種前要用________擦手。接種和劃線前使用________的方法對接種環(huán)滅菌。 (3)劃線分離時，接種環(huán)在菌液中蘸取________次。下圖甲表示在平板培養(yǎng)基上的第一次和第二次劃線，請在乙圖中畫出第三次劃線。 (4)劃線后在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿須倒置，目的是__________________。 (5)實驗完成后，接觸過細菌的器皿應(yīng)如何處理？____________________。 【思路點撥】　此題考查大腸桿菌的培養(yǎng)和分離過程，具體分析如下： (1)滅菌是指對LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基進行的滅菌。對培養(yǎng)基進行的滅菌應(yīng)該是用滅菌鍋進行高壓蒸汽滅菌。滅菌后，滅菌鍋內(nèi)的壓力與大氣壓相同時，才能打開滅菌鍋，否則會造成培養(yǎng)液濺出。 (2)在進行實驗操作時，操作者的雙手要用酒精棉球擦拭消毒，接種環(huán)要用火焰燒灼滅菌。 (3)劃線分離時，接種環(huán)在菌液中蘸取菌液1次然后連續(xù)劃線。 (4)在培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿須倒置，目的是防止冷凝后形成的水滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基，沖散菌落。 (5)實驗完成后，接觸過細菌的器皿應(yīng)滅菌處理以防止污染。 【答案】　(1)高壓蒸汽　滅菌鍋內(nèi)壓力與大氣壓相同 (2)酒精棉球　(酒精燈火焰上)灼燒 (3)1　(見右圖) (4)避免水滴污染培養(yǎng)基 (5)接觸過細菌的器皿應(yīng)作滅菌處理 劃線分離操作 ①第一次劃線及每次劃線之前都需灼燒滅菌，劃線操作結(jié)束仍需灼燒接種環(huán)，每次灼燒的目的如下表： 第一次灼燒 每次劃線之前灼燒 劃線結(jié)束灼燒 目的 避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物 殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使每次劃線的菌種來自上次劃線末端 殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者 ②灼燒接種環(huán)之后，要冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。 ③劃線時最后一區(qū)域不要與第一區(qū)域相連。 ④劃線用力要大小適當(dāng)，防止用力過大將培養(yǎng)基劃破。 2．下圖為“大腸桿菌的培養(yǎng)和分離”實驗的基本流程，請回答： →→→→ (1)A過程配制的是通用細菌培養(yǎng)基，稱為________培養(yǎng)基。配制時除了加入特定的營養(yǎng)物質(zhì)以外，還要加入一定量的氯化鈉，以維持________。對培養(yǎng)基酸堿度的調(diào)節(jié)，應(yīng)該在B過程的________(填“前面”或“后面”)。 (2)D過程與C過程相比，培養(yǎng)基中增加的物質(zhì)是________。E過程所需的溫度是________。 (3)D過程后，一個菌體便會形成一個________，這種分離方法是________________的通用方法，也是篩選特定菌株的最簡便方法之一。 【答案】　(1)LB　滲透壓　前面　(2)瓊脂　4 ℃ (3)(單)菌落　消除污染雜菌(純化菌種) 1．下列有關(guān)倒平板操作錯誤的是(　　) A．將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上 B．使打開的錐形瓶瓶口迅速通過火焰 C．將培養(yǎng)皿打開，培養(yǎng)皿蓋倒放在桌面上 D．等待平板冷卻凝固后需要將平板倒過來放置 【解析】　整個倒平板過程要防止外來雜菌的入侵，因此，滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，打開的錐形瓶瓶口迅速通過火焰，培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不能將培養(yǎng)皿蓋完全打開，等待平板冷卻凝固后需要將平板倒過來放置。 【答案】　C 2．無菌技術(shù)包括以下幾個方面的敘述，其中錯誤的是(　　) A．對培養(yǎng)操作的空間、操作者的衣著和手進行滅菌 B．對培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌 C．為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進行 D．實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸 【解析】　滅菌是采用強烈的理化因素對用于微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)皿、接種用具和培養(yǎng)基進行處理，使物體內(nèi)外一切微生物，包括芽孢和孢子都要被殺死；實驗操作者的衣著和手以及操作空間只能進行消毒。 【答案】　A 3．下列依次表示倒平板、接種的位置，以及劃線法接種的路徑示意圖，其中錯誤的是(　　) 【解析】　在劃線時，應(yīng)在第一區(qū)的劃線末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線，在第二區(qū)的劃線末端開始往第三區(qū)劃線。 【答案】　D 4．關(guān)于大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗以下敘述不正確的是(　　) A．本實驗的內(nèi)容是將大腸桿菌進行擴大培養(yǎng)和劃線分離 B．本實驗用LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)大腸桿菌，再在LB固體平面培養(yǎng)基上劃線進行大腸桿菌的分離 C．除劃線分離外，也可用涂布分離法分離大腸桿菌，兩種分離方法中劃線分離方法簡單且單菌落更易分開 D．進行培養(yǎng)之前對加入培養(yǎng)基的三角瓶、試管也要在121 ℃下滅菌15 min 【解析】　劃線分離與涂布分離均可實現(xiàn)對大腸桿菌的分離，其中劃線分離法操作簡單，但單菌落相對不易分開，涂布分離法操作雖相對復(fù)雜，但單菌落更易分開。 【答案】　C 5．微生物與人類關(guān)系密切。雖然有些微生物能使動植物患病，但多數(shù)微生物對人類是有益的。請回答： (1)培養(yǎng)基中含有蛋白胨、淀粉分別為細菌培養(yǎng)提供____________。對培養(yǎng)基進行滅菌，應(yīng)該采用的方法是____________。接種時通常采用________法。 (2)在制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的倒平板操作時，平板冷凝后，要將平板倒置的原因是____________________________________________________ ____________________________________________________________。 (3)微生物接種的方法很多，最常用的是平板劃線法和____________法。在用平板劃線法接種時，在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)的目的是______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ____________________________________________________________。 在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ____________________________________________________________。 【答案】　(1)氮源(碳源)、碳源　高壓蒸汽滅菌　平板劃線 (2)皿蓋上會凝有水珠，防止水珠落入培養(yǎng)皿造成污染，還可使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā) (3)稀釋涂布平板 第一步灼燒接種環(huán)是防止接種環(huán)上有其他微生物而污染培養(yǎng)基。每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次接種時留下的菌種，使下一次劃線時接種環(huán)上的菌種直接來自上次劃線的末端，以便通過多次劃線后，得到單個的菌落　劃線結(jié)束后仍要灼燒接種環(huán)，以免菌種對環(huán)境造成污染和感染操作者