基因工程原理第七章

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1、第七章 動(dòng)物細(xì)胞基因操作 動(dòng)物細(xì)胞基因操作 動(dòng)物細(xì)胞基因操作的必須性 :可進(jìn)行細(xì)菌和真菌 細(xì)胞所無(wú)法進(jìn)行的真正的翻譯后修飾 載體 1) 非復(fù)制質(zhì)粒載體 2) 帶有病毒復(fù)制子的質(zhì)粒 3) 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體 細(xì)胞：與細(xì)胞本身特性、載體、轉(zhuǎn)移、應(yīng)用相 關(guān) 轉(zhuǎn)移：轉(zhuǎn)移技術(shù)、瞬時(shí)與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、共轉(zhuǎn)染 應(yīng)用：細(xì)胞研究、蛋白表達(dá)、體內(nèi)基因治療、 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 第一節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞 DNA 轉(zhuǎn)移技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的途徑 =轉(zhuǎn) 基因技術(shù) 直接 DNA轉(zhuǎn)移：外源 DNA通過(guò)物理轉(zhuǎn)化直 接進(jìn)入細(xì)胞 如顯微注射、含 DNA顆粒轟擊、 轉(zhuǎn)染：化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)、脂質(zhì)體、電穿孔 轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過(guò)動(dòng)物病毒包裹，利用病毒可 以自然感染細(xì)胞并將自

2、身核酸分子轉(zhuǎn)入 細(xì)胞的能力。 轉(zhuǎn)染技術(shù) 化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù) (利用胞吞作用 ) 1) DNA/磷酸鈣共沉淀法 適用于單層生長(zhǎng)細(xì)胞，不適用于懸浮或成團(tuán)生長(zhǎng)的細(xì)胞 對(duì)某些細(xì)胞有毒性，難以轉(zhuǎn)染 2) 二乙氨乙基葡聚糖 (DEAE-dextran) 可溶性聚陽(yáng)離子制劑，不能用于形成穩(wěn)定的細(xì)胞系 脂質(zhì)體 (利用胞吞作用 ) 低毒性，易操作，效率高，適用細(xì)胞類型多，甚至可轉(zhuǎn)染 活體細(xì)胞 電穿孔 (利用電脈沖在細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)的納米大小的孔） 轉(zhuǎn)移后 DNA的命運(yùn) 具備在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的復(fù)制起始子， 可以穩(wěn)定復(fù)制 (穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 ) 可以整合到基因組 DNA上，穩(wěn)定復(fù)制 (穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染 ) 不具備在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功

3、能，也沒有整 合到基因組 DNA上，瞬時(shí)保留 (瞬時(shí)轉(zhuǎn)染） DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的效率遠(yuǎn)高于 DNA整合的效率 兩個(gè)物理上不相連的基因可以發(fā)生共轉(zhuǎn)染， 甚至可以都整合到基因組 DNA上 第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞載體 動(dòng)物細(xì)胞載體 非復(fù)制型載體 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的載體 (啟動(dòng)子功能分析的載體 ) 選擇標(biāo)記 DNA 帶有病毒復(fù)制子的質(zhì)粒 SV40、 BPV、 EBV 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體 腺病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、 Lentivirus等 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的非復(fù)制型載體 載體無(wú)法復(fù)制，也不 整合于基因組上 在宿主細(xì)胞中往往只 能保持 1-2d的穩(wěn)定 可以進(jìn)行基因的表達(dá) 載體上往往具有報(bào)告 基因，能夠報(bào)告表達(dá) 的發(fā)生 啟動(dòng)子功能分析與

4、報(bào)告基因 選擇標(biāo)記基因 未經(jīng)克隆的含 TK基因的外源 DNA使一些攝 入細(xì)胞具有了 在選擇培養(yǎng)基 上生存的能力， 這樣的基因稱 為選擇性標(biāo)記 基因 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) TK 胸苷激酶 核苷酸從頭合成和補(bǔ)救途徑：編碼補(bǔ) 救途徑的酶的基因 (Hprt,Tk)可以用 作選擇標(biāo)記 共轉(zhuǎn)化與選擇標(biāo)記 兩個(gè)物理上不相連的基因通過(guò)共轉(zhuǎn)染，共同整 合到基因組中的現(xiàn)象 這是由于發(fā)生了整合之前的 DNA融合 只要能同時(shí)轉(zhuǎn)入一個(gè)選擇標(biāo)記基因，共轉(zhuǎn)化現(xiàn) 象就可以使任何外源 DNA序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物 細(xì)胞 根據(jù)標(biāo)記基因篩選方法，選擇標(biāo)記可以分為： 內(nèi)源性選擇標(biāo)記、顯性選擇標(biāo)記、擴(kuò)增選擇標(biāo) 記 內(nèi)源性選擇標(biāo)記 來(lái)自于動(dòng)物細(xì)胞 內(nèi)

5、的標(biāo)記基因， 大多數(shù)涉及與冗 余內(nèi)源核苷酸生 物合成途徑 內(nèi)源性選擇標(biāo)記 的缺點(diǎn)：只能用 于那些對(duì)應(yīng)基因 不具有功能的突 變細(xì)胞。 顯性選擇標(biāo)記 顯性選擇標(biāo)記：往往 來(lái)自于細(xì)菌 (外源 )， 因此其所提供的表型 對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)是全新 的，可用于任何細(xì)胞。 這些標(biāo)記通常是細(xì)菌 的抗藥基因，因此陽(yáng) 性細(xì)胞可以在適當(dāng)?shù)?藥物濃度的培養(yǎng)基上 進(jìn)行篩選。 擴(kuò)增選擇標(biāo)記 當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞暴露在某 種藥物的有毒濃度中， 少數(shù)個(gè)別細(xì)胞由于自 發(fā)的、擴(kuò)增性的抗藥 突變而存活，這樣的 DNA上的擴(kuò)增性標(biāo)記， 稱為擴(kuò)增選擇標(biāo)記 出現(xiàn)擴(kuò)增選擇性標(biāo)記 的細(xì)胞栽種群中是隨 機(jī)出現(xiàn)的，可進(jìn)行高 濃度抗藥性的篩選 側(cè)翼 DNA序列可

6、隨標(biāo) 記基因一起擴(kuò)增 氨基蝶呤 DHFR 葉酸 擴(kuò)增選擇標(biāo)記 擴(kuò)增選擇 標(biāo)記也常 可用于內(nèi) 源或顯性 選擇標(biāo)記， 但常常用 于擴(kuò)增選 擇的藥物 不同 擴(kuò)增選擇標(biāo)記常用于外源基因 的高效表達(dá) 復(fù)制子載體：帶有病毒復(fù)制子 的載體 病毒基因組具有在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制的能力 可能造成溶解性感染，使宿主細(xì)胞裂解，如 SV40，由于宿主細(xì)胞的裂解，實(shí)現(xiàn)的是一種高 水平瞬時(shí)表達(dá) 可能造成潛伏性感染，從而并不影響宿主細(xì)胞 生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，如 EBV和 PBV，其中 EBV 載體相對(duì)于 PBV載體復(fù)制更加穩(wěn)定 SV40（猴多瘤病毒 DNA） 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體 外源 DNA分子包入病毒粒子 (通過(guò)連接或同源重 組

7、的方式插入病毒載體），后者吸附到細(xì)胞表 面從而進(jìn)入細(xì)胞 效率很高，而且具有高效復(fù)制與高水平表達(dá)基 因的潛能 不僅可用于培養(yǎng)細(xì)胞，也可用于活體細(xì)胞 腺病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、 Lentivirus等 可復(fù)制病毒載體與復(fù)制缺陷型 病毒載體 當(dāng)轉(zhuǎn)移基因插入到基因組中或它所替換的基因 對(duì)于在宿主細(xì)胞中的感染周期不是必需時(shí)，載 體可以獨(dú)立的增殖，稱為可復(fù)制的或不依賴輔 助病毒載體。 當(dāng)轉(zhuǎn)入基因替換了病毒的必需基因時(shí)，這樣的 載體則稱為復(fù)制缺陷型或輔助病毒依賴性載體。 因?yàn)樗鼈兪サ墓δ苄枰ㄟ^(guò)共轉(zhuǎn)入攜帶有載 體所缺失基因的輔助病毒來(lái)提供。 可復(fù)制病 毒載體與 復(fù)制缺陷 型病毒載 體 :以桿 狀病毒為

8、例 無(wú)內(nèi)含載體 不具有所有病毒編碼序列的載體，只含有包裝 和基因組擴(kuò)增所必需的順式作用元件。 優(yōu)點(diǎn) : 1) 可容納高容量的外源 DNA 2) 不產(chǎn)生病毒基因產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性 第三節(jié) 細(xì)胞與應(yīng)用 正常動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)特性 宿主動(dòng)物細(xì)胞所需特性 正常細(xì)胞生長(zhǎng)特性和宿主細(xì)胞所需特性 上的差異某種程度上造成了各種表達(dá)系 統(tǒng)對(duì)宿主細(xì)胞選擇和應(yīng)用的差異 第四節(jié) 動(dòng)物基因操作 動(dòng)物基因工程 動(dòng)物基因工程 動(dòng)物基因工程 動(dòng)物細(xì)胞基因工程 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體 動(dòng)物工程細(xì)胞 動(dòng)物遺傳性狀改良 藥物篩選研究評(píng)價(jià)模型 人體基因治療 蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn) 藥物篩選研究評(píng)價(jià)模型 動(dòng)物基因工程 哺乳動(dòng)物 轉(zhuǎn)基因小鼠 胚胎干細(xì)

9、胞 同源重組 基因?qū)ぐ?克隆羊 核移植 其他脊椎動(dòng)物 爪蟾 無(wú)脊椎動(dòng)物 果蠅 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的方法 體細(xì)胞 -卵 細(xì)胞核替 換 顯微注射 受精卵 反病毒侵 染胚胎干 細(xì)胞或早 期胚 轉(zhuǎn)基因小鼠 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞在發(fā)育能力上受到限制，不能 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：分化的細(xì)胞無(wú)法完全去分化 和重復(fù)發(fā)育 動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)生殖細(xì)胞系轉(zhuǎn)化的唯一途徑就是在 形成生殖細(xì)胞系的發(fā)育階段之前把 DNA導(dǎo)入全 能細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞 (Es Cells)是這樣一個(gè)動(dòng)物體特殊 的全能細(xì)胞 轉(zhuǎn)基因小鼠中的 DNA轉(zhuǎn)移方法 直接顯微注射：注入剛受精卵細(xì)胞的 雄或雌性原核中 重組反轉(zhuǎn)錄病毒：不適宜產(chǎn)生完全的 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可用于形成胚轉(zhuǎn)基

10、因部 分 Es細(xì)胞轉(zhuǎn)染：可利用標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記進(jìn)行篩 選 胚胎干細(xì)胞 (Es Cells) 取自生殖細(xì)胞發(fā)育前的早期胚 具有發(fā)育成動(dòng)物的所有組織的能力 受同源重組影響顯著，可以用于基因?qū)?靶，即可用外源 DNA的同源片段精確地 替換內(nèi)源基因組的片段。 Es細(xì)胞的基因?qū)ぐ?外源 DNA的同源片段精確替換內(nèi)源基因組片 段的過(guò)程 由于同源重組的幾率遠(yuǎn)低于隨機(jī)整合，進(jìn)行 尋靶的細(xì)胞需要有較高的同源重組能力 體外操作的多能性、可操作性以及同源重組 的能力使 Es細(xì)胞成為唯一適合于產(chǎn)生定向突 變小鼠的細(xì)胞，即在每個(gè)細(xì)胞中攜帶有相同 突變并能將其傳遞給生殖細(xì)胞系的小鼠。 標(biāo)記基因已被運(yùn)用到尋靶過(guò)程和其后的篩選 尋靶載體 特化的質(zhì)粒載體，導(dǎo)入到 Es 細(xì)胞后可以促進(jìn)同源重組 促進(jìn)同源重組的原因主要是 含有一段同源區(qū) 轉(zhuǎn)染前載體的線性化，有助 于重組效率的提高 多數(shù)基因?qū)ぐ惺菫榱舜驍鄡?nèi) 源基因位點(diǎn)，使之無(wú)效，稱 為基因敲除 兩種類型的尋靶載體：替代與 插入 插入載體是打 斷了原基因， 也會(huì)出現(xiàn)選擇 標(biāo)記附近的序 列重復(fù)，可能 會(huì)導(dǎo)致再次的 同源重組而回 復(fù)野生型 替換載體更普 及 篩選策略 標(biāo)記基因篩選：對(duì)于插入載體，標(biāo)記基因 可位于載體骨架內(nèi)任何地方；對(duì)于替換載 體，標(biāo)記基因必須在同源區(qū)內(nèi)。目前最常 用的標(biāo)記基因是 neo標(biāo)記。 Southern blot PCR Western blot