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1、 基因工程的基本操作程序主要包括 四個基本步驟： 1）目的基因的獲取 2）基因表達載體的構(gòu)建 3）將目的基因?qū)胧荏w細胞 4）目的基因的檢測與鑒定 步驟一： 目的基因的獲取 目的基因是人們所 需要轉(zhuǎn)移 或 改造 的基因 , 獲取目的基因是實施基因工程的第一步 。 如蘇云金芽孢桿菌的 抗蟲基因 ，還有植 物的 抗?。共《尽⒖辜毦┗?、 種子貯 藏蛋白的基因 ，以及人的 胰島素基因、干擾 素基因 等。 1.從基因文庫中獲取目的基因： 基因文庫 : 將含有某種生物不同基因的許多 DNA片段 ,導入 受體菌的群體中儲存 ,各個受體菌分別含有這種生物的 不
2、同的基因 ,稱為基因文庫 基因組文庫 : 基因文庫中包含了一種生物所有的基因 ,這種基 因文庫叫做基因組文庫 . 部分基因文庫 : 基因文庫中包含了一種生物的一部分基因 ,這種基 因文庫叫做部分基因文庫 . 2.PCR技術(shù) 原理： 前提： 原料： 優(yōu)點 過程： PCR擴增儀 DNA復制 已知目的基因的一段核苷酸序列 ：以 _____方式擴增， 在短時間內(nèi)大量擴增目的基因 指數(shù) 模板 DNA； DNA引物；四種脫氧 核苷酸；熱穩(wěn)定 DNA聚合酶 （ Taq酶）；離子 變性 復性 延伸 1） 反轉(zhuǎn)錄法 ： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成 的信使
3、RNA為模板，反 轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈 DNA， 然后在酶的作用下合成 雙鏈 DNA，從而獲得所 需的基因。 目的基因的 mRNA 單鏈 DNA(cDNA) 雙鏈 DNA (即目的基因 ) 反轉(zhuǎn)錄 合成 3.人工合成基因法 2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成 DNA法 ： 根據(jù)已知蛋白質(zhì) 的氨基酸序列，推測 出相應(yīng)的信使 RNA序 列，然后按照堿基互 補配對原則，推測出 它的結(jié)構(gòu)基因的核苷 酸序列，再通過化學 方法，以單核苷酸為 原料合成目的基因。 蛋白質(zhì)的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 推測 推測 目的基因 化學合成 基因表達載體的組成： 目
4、的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存 在，并且可以遺傳給下一代，同時使目 的基因能夠表達和發(fā)揮作用。 a、目的基因 b、啟動子 c、終止子 d、標記基因等 步驟二： 基因表達載體的構(gòu)建 (基因工程的核心） 啟動子： 位于基因的首端的 一段特殊的 DNA片斷，它是 RNA聚合酶識別和結(jié)合的部 位，有了它才能 驅(qū)動基因轉(zhuǎn) 錄出 mRNA，最終獲得蛋白質(zhì) 終止子： 位于基因的尾端的 一段特殊的 DNA片斷， 能終 止 mRNA的轉(zhuǎn)錄 標記基因 的作用是 為了 鑒別 受體細胞中是否含有目的基 因，從而將有目的基因的細 胞篩選出來 1）用一定的 限制酶切割質(zhì)粒 ，使其出現(xiàn) 一 個切口
5、，露出 黏性末端 。 2）用 同一種 限制酶 切斷目的基因 ，使其產(chǎn) 生 相同 的 黏性末端 。 3）將切下的目的基因片段 插入質(zhì)粒 的切口 處，再加入適量 DNA連接酶 ，形成了一個 重 組 DNA分子 （重組質(zhì)粒） 目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際 上是不同來源的 基因重組的過程。 構(gòu)建步驟： 常用的受體細胞： 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、 酵母菌和動植物細胞等。 步驟三：目的基因?qū)胧荏w細胞 三、將目的基因?qū)胧荏w細胞 （一）轉(zhuǎn)化： （二）方法 將目的基因?qū)? 植物細胞 將目的基因?qū)? 動物細胞 將目的基因?qū)? 微生物細胞
6、 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法 顯微注射法 感受態(tài)細胞 目的基因進入 _________內(nèi)，并且在 受體細胞內(nèi)維持 _____和 _____的過程 受體細胞 穩(wěn)定 表達 1.將目的基因?qū)胫参锛毎? 3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎? 首先用 Ca2+ 處理細胞 ,以 增大 細菌 細胞壁的通透 性 ,使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中 DNA分子的 生理狀態(tài) ,這種細胞稱為感受態(tài)細胞 . 第二步是將重組表達載體 DNA分子溶于緩 沖液中與感受態(tài)細胞混合 ,在一定的溫度下促進感 受態(tài)細胞吸收 DNA分子 ,完成轉(zhuǎn)化過程 . 第二步 目的基因在受體細胞內(nèi)
7、，隨其繁 殖而 復制 ，由于細菌 繁殖的速度 非?？?，在很短 的時間內(nèi)就能獲得 大量 的目的基因。 （一）、檢測 1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的 DNA上是否插入 了目的基因 (關(guān)鍵步驟 ) .首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組 DNA .用含目的基因的 DNA片段用放射性同位素 等作標記 ,以此做探針 .使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交 ,若顯 示出雜交帶 ,表明染色體已插入染色體 DNA中 （ 1） 方法 : DNA分子雜交 （ 2）過程 : 歸納步驟 DNA分子雜交示意圖 采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的 DNA分 子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補 的堿基序列，那
8、么，互補的堿基序列就會結(jié)合 在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序 列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 （二）、鑒定（個體生物學水平） 2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA 3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等 方法 : 分 子 雜 交 方法 : 抗原抗體雜交 過程 : 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的 mRNA雜交 , 若出現(xiàn)雜交帶 ,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了 mRNA 不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀， 才能說明目的基因完成了 表達 。 受體細胞攝入 DNA分子后就說明目的基因 完成了表達嗎？ 若不能表達， 要對抗蟲基因 再進行 修飾
9、 。 1） 以下說法正確的是 （ ） A、 所有的限制酶只能識別一種特定的核苷 酸序列 B、 質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體 C、 運載體必須具備的條件之一是：具有多 個限制酶切點 ， 以便與外源基因連接 D、 基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來 C 練習 2） 不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是 A、 能復制 （ ） B、 有多個限制酶切點 C、 具有標記基因 D、 它是環(huán)狀 DNA D 練習 3） 有關(guān)基因工程的敘述中 ， 錯誤的是 （ ） A、 DNA連接酶將黏性末端
10、的堿基對連接起 來 B、 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、 目的基因須由運載體導入受體細胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶 A 練習 4） 有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、 限制酶只在獲得目的基因時才用 B、 重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成 C、 質(zhì)粒都可作為運載體 D、 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供 資料 D 練習 5） 基因工程是在 DNA分子水平上進行設(shè)計 施工的 。 在基因操作的基本步驟中 ， 不進行 堿基互補配對的步驟是 （ ） A、 人工合成目的基因 B、 目的基因與運載體結(jié)合 C、 將目的基因?qū)胧荏w細胞 D、 目的基因的檢測和表達 C 練習
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