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1、,血液制品的質(zhì)量控制及安全性,主要內(nèi)容,1、血液制品的概況 2、血液制品的分離純化技術和生產(chǎn)工藝 3、血液制品的安全性和病毒滅活 4、血液制品的質(zhì)量標準和質(zhì)量控制,一、血液制品的概況,血液制品定義, 血液制品是指由健康人的血漿或經(jīng)特異免疫的人血漿，經(jīng)分離、提純或由重組DNA技術制成的血漿蛋白組分，以及血液細胞有形成分。用于治療和被動免疫預防。 血液制品屬于治療用生物制品。,血液制品： 是高投入、高科技含量、高技術門檻、高風險的生物產(chǎn)業(yè)。 是寶貴的人源性生物類藥品，對許多疾病有著不可替代的防治作用，關乎國計民生安全，屬于戰(zhàn)略性資源。 隨著國內(nèi)醫(yī)學進步與實踐水平的提高，血液制品的臨床使用量和適應癥
2、不斷擴大。,,全球血制品銷售結構,白蛋白類制劑,主要作用； 1、維持血液滲透壓 2、抗休克作用 3、運輸和解毒作用 4、調(diào)節(jié)膠體滲透壓紊亂而引進的機能障礙 5、營養(yǎng)供給,靜脈注射人免疫球蛋白的臨床應用,1、特發(fā)性血小板減少性紫癜。 2、原發(fā)性免疫缺陷病的替代治療。 3、繼發(fā)性免疫缺陷病的替代治療。 4、川崎病。 5、艾滋病的輔助治療。 6、預防成人骨髓移植的感染和移植物抗宿主病。 7、其它免疫調(diào)節(jié)紊亂的適應癥。,病毒檢測及滅活或去除技術進展 提高制品純度的進展 基因工程血液制品研究進展 工藝技術的改進： 高度自動化、智能化、擴大生產(chǎn)能力 病毒滅活和去除技術的提高綜合利用的研發(fā): 1-AT
3、、 AT-、纖原、冷沉淀、富含IgM/A-IgG 特免球蛋白的系列研發(fā)： 破免、乙免、靜注乙免、 綠膿桿菌特免、巨細胞病毒特免 、狂免、金葡特免、合胞病毒特,當代血液制品的主要進展,我國血液制品的發(fā)展趨勢,1、由血漿綜合利用低下階段向全面深度綜合利用方向邁進。 2、由各自單一企業(yè)競爭轉向戰(zhàn)略重組或聯(lián)盟形式競爭。 3、硬件、軟件提高的同時，全面開展技術創(chuàng)新。 4、不斷開展臨床適應癥的研究工作。,國內(nèi)血液制品發(fā)展, 1950年我國開始用鹽析法生產(chǎn)血液制品。 80年代末成都所是國內(nèi)第一家采用低溫乙醇分離技術的企業(yè)。 1996年蘭州生物制品研究所在國內(nèi)第一家成功引進Octapharma血漿蛋白組分壓濾
4、分離技術。 1998年血液制品生產(chǎn)企業(yè)在全國率先通過GMP認證。血液制品生產(chǎn)在GMP條件下進行。 2001年人白蛋白在全國實行批簽發(fā)制度。揭開了生物制品批簽發(fā)的序幕?，F(xiàn)在血液制品全部實行批簽發(fā)，以保證每批制品安全有效。 2005年按特殊藥品管理.,國內(nèi)血液制品企業(yè)及規(guī)模, 30家血液制品生產(chǎn)企業(yè)，160家單采血漿站分布在19個省，設計產(chǎn)能12000噸，目前實際生產(chǎn)4000噸。 中國生物技術集團公司是國內(nèi)最大的血液制品生產(chǎn)企業(yè)，下屬天壇蓉生，上生，武生，蘭州四家企業(yè)。有國內(nèi)最先進的生產(chǎn)車間，先進的生產(chǎn)工藝，完整的全面質(zhì)量管理體系，先進的質(zhì)量控制實驗室和強大的科研開發(fā)團隊，實現(xiàn)了血液制品生產(chǎn)過程的
5、自動化、管道化、在線檢測。,血液制品的相關法規(guī),血液制品安全與質(zhì)量控制體系 法規(guī)架構 血液制品管理條例國務院令（1996年12月30日發(fā)布并開始施行） 藥品管理法 技術法規(guī) 技術標準 中國遏制艾滋病行動計劃（2006-2010）,技術體系,- 原料血漿控制 - 生產(chǎn)過程控制 - 病毒滅活/去除工藝,血液制品遵循的主要技術法規(guī),二、血液制品的分離純化技術和生產(chǎn)工藝,血液制品的分離純化技術,大體上可以分為5類: 1、利用蛋白質(zhì)的親水性和疏水性即溶解度不同進行分離的方法，包括：鹽析法、有機溶劑沉淀法、疏水層析法、凍融法、等電點沉淀法等。 2、根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同，形狀和密度差異進行分離的方法，包括
6、：凝膠過濾層析法、過濾和超過濾、離心和超離心、透析法等。,血液制品的分離純化技術,3、利用蛋白質(zhì)帶電性的分離方法：離子交換層析法、制備電泳法等。 4、利用蛋白質(zhì)的立體結構中的特定位點與配體的特異親和力進行分離、純化的親和層析法。 5、其它方法：利凡諾，聚乙二醇，硫酸鋁鉀等。 應多種方法組合 ，符合血漿綜合利用的原則。,蛋白質(zhì)在溶液中保持穩(wěn)定,根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同，即按蛋白質(zhì)親水性和疏水性的差異，進行分離的方法（鹽析法、等電點沉淀法）。 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、形狀和密度差異進行分離的方法（凝膠過濾層析法、透析法、超濾法、離心和超離心法等）。 根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電性的不同進行分離（離子交換層析法、制備電
7、泳法等）。 根據(jù)蛋白質(zhì)立體結構中的特定位點與某種特定配體的特異親和力進行分離（親和層析法）。,蛋白分離的基本原則 被分離和提純的蛋白質(zhì)應盡可能保持天然蛋白質(zhì)的各種理化和生物學特性。如白蛋白多聚體含量的控制、IVIG的Fc活性的檢測等； 分離過程最大程度地避免或排除微生物及其代謝產(chǎn)物的污染。如熱原質(zhì)檢測、無菌檢查等； 工藝技術應適應工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，分離步驟力求簡便、低消耗、高產(chǎn)出。如由Cohn氏法改良后的Kistler和Nitschmann法工藝，白蛋白的收率由20g/L增加到27g/L； 從血漿中可分離出多種蛋白質(zhì)成分，符合血漿綜合利用的原則。,血液制品的分離純化技術,血漿蛋白的分離制備方法：
8、 鹽析法（硫酸銨鹽析法） 低溫乙醇法 離子交換層析法、親和層析法 利凡諾沉淀法（已淘汰） 聚乙二醇沉淀法,低溫乙醇法五變因素,蛋白濃度 乙醇濃度 溫度 pH 離子強度 五種參數(shù)加以組合，可形成許多種反應條件,低溫乙醇法優(yōu)點,相對簡單的操作，產(chǎn)量高，適宜工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。 保持蛋白質(zhì)的天然特性。 抑菌作用。 同時分離多種血漿成分，適于血漿綜合利用。 乙醇作為主要原材料，價格低廉，易于獲得。,白蛋白生產(chǎn)工藝(1),混合血漿 FI+II+III上清 FIV上清 FV沉淀精制 超 濾配制巴氏消毒除菌過濾和分裝培育成品批簽發(fā)放行,白蛋白生產(chǎn)工藝(2),混合血漿 FI上清 FII+III上清 FIV上清
9、FV沉淀精制 超 濾配制巴氏消毒除菌過濾和分裝培育成品批簽發(fā)放行,現(xiàn)行生產(chǎn)工藝,現(xiàn)行生產(chǎn)工藝： 低溫乙醇法（Cohn法 / Kistler- Nitcschmann法） - 低溫乙醇法：離心法 / 壓濾法 - 低溫乙醇法 / 層析技術,柱層析法,離子交換層析、凝膠過濾和親和層析法。 離子交換層析法：采用不同的pH值和離子強度的緩沖液，使帶不同電荷的蛋白質(zhì)分離。PCC等凝血因子、白蛋白、免疫球蛋白的制備。 交換劑如： DEAE-Sephadex A-50； DEAE-Sepharose CL-6B； CM-Sepharose CL-6B； Lysine-Sepharose 4B ； S
10、P-Sephadex C-50； Q-Sepharose FF；,血漿蛋白分離純化的工業(yè)化生產(chǎn)技術,血漿蛋白分離純化的工業(yè)化生產(chǎn)技術,血漿蛋白分離純化的工業(yè)化生產(chǎn)技術,無菌灌裝技術,巴氏病毒滅活和低pH孵放病毒滅活技術,,三、血液制品的安全性和病毒滅活,血漿相關病毒的概念 原料血漿篩查及檢疫期管理 血液制品生產(chǎn)工藝去除病毒能力 血液制品病毒滅活/去除工藝 保證血液制品病毒安全性的其他措施,,原料血漿的特殊性 具有潛在的病毒風險，若獲得起始原材料的過程和生產(chǎn)過程控制不嚴密，可能導致血源性傳染病感染： 甲型肝炎病毒（HAV） 乙型肝炎病毒（HBV） 丙型肝炎病毒（HCV） 丁型肝炎病毒（HDV）
11、 艾滋病病毒（HIV） 巨細胞病毒（CMV） 人類細小病毒（HPV） 朊病毒（CJDV） 其他可通過血液傳播的病毒,單采血漿站及單采血漿,血液制品是以人血漿為原料生產(chǎn)的。 原料血漿來自單采血漿站采集的血漿。 單采血漿站由血液制品生產(chǎn)企業(yè)設置和管理，應遵守血液制品管理條例、單采血漿站基本標準、單采血漿站管理辦法和單采血漿站質(zhì)量管理規(guī)范等法律法規(guī)的相關規(guī)定。,血漿運輸和貯存,血漿采集后，應在6小時內(nèi)凍結，置 -20以下保存，保存期不超過3年。 血漿用專用冷藏車在-15 以下運輸。,檢驗,用國家中檢所檢定合格的批批檢試劑測定HBsAg、HIV抗體、HCV抗體、ALT、梅毒、血漿蛋白、抗-HBs等其他
12、抗體含量。,原料血漿血清學的檢測： HBsAg 抗HCV 抗HIV ALT 梅毒,,原料血漿檢疫期, 2008年6月31日后建立原料血漿投料前的“檢疫期”制度. 血漿采集復檢合格后放置90天等獻漿員第二次獻漿檢測合格后投產(chǎn)。減少窗口期傳染。 若用NAT/PCR 檢測，“窗口期”可由90天縮短至60天.,三種病毒的窗口期平均天數(shù),ELISA NAT HCV 82 23 HIV 22 11 HBV 59 34,,,原料血漿采集管理流程（漿站）,* 檢測用試劑經(jīng)國家批批檢和入廠確認 * 采漿耗材經(jīng)入廠檢驗合格,原料血漿管理（血液制品生產(chǎn)廠
13、家）,檢測試劑SFDA放行 檢測試劑使用前蓉生確認,保留樣品,血漿采集流程圖,冷鏈運輸,血液制品的病毒安全性控制,Cohns低溫乙醇血漿組分法低溫乙醇沉淀法生產(chǎn)工藝中可去除一定量的病毒； 過濾法包括用于IVIG的深層過濾，經(jīng)確證能大量除去脂包膜和非包膜病毒，模型病毒為HBV、HIV、ParvovirusB19、HAV。,工藝技術去病毒能力,白蛋白三步沉淀病毒Log減少數(shù),工藝技術去病毒能力,IVIG三步沉淀病毒Log減少數(shù),工藝技術去病毒能力,血液制品的病毒滅活,血液制品安全控制 原料血漿安全控制 - 不同層次的病原體檢測方法 - 檢疫期制度：排除潛在危險的血漿 病毒滅活 / 去除工藝及其效果
14、驗證 生產(chǎn)與質(zhì)量管理：cGMP 質(zhì)量標準與質(zhì)量控制,現(xiàn)行原料血漿的安全控制方法,原料血漿： 單采血漿站提供 排查：詢問病史、體檢、獻漿員管理系統(tǒng) 采漿站 / 血清學檢測（初篩）：HBsAg、HCV抗體、HIV-1/2抗體、梅毒和ALT 血液制品生產(chǎn)企業(yè)/ 血清學復檢：HBsAg、HCV抗體、HIV-1/2抗體、 梅毒和ALT 檢測試劑：國家藥品管理當局批準的、中國藥品生物制品檢定所逐批檢定合格的產(chǎn)品,原料血漿病毒安全控制體系,血源性疾病傳播的潛在危險/ 艾滋病等血源性疾病的控制 現(xiàn)行原料血漿病毒檢測方法的靈敏度限制 - 獻漿員管理：有效的身份識別系統(tǒng) 病原體篩選 ： 高靈敏度方法（NAT） 原
15、料血漿“檢疫期”存放：排除病毒檢測的窗口期 - 原料血漿跟蹤系統(tǒng)：獻漿后追蹤,血漿的檢疫期制度,血漿的檢疫期制度是對混漿投料前的原料血漿進行固定時間放置和回顧檢驗的血漿處理方法。 - 使投料血漿的病毒污染程度降至最低 - 國外企業(yè)通常將原料血漿在混漿投料前冷凍放置90天 - 電腦化血漿跟蹤系統(tǒng)：跟蹤檢測結果,血液制品的病毒滅活 / 去除工藝,病毒滅活的必要性 病毒的窗口期 試劑靈敏度限制導致漏檢 人為差錯引起漏檢 已知經(jīng)血傳播尚未檢測的病毒：細小病毒B19、巨細胞病毒（CMV） 可能經(jīng)血傳播但尚未檢測的病毒,病毒滅活 / 去除工藝,國家藥監(jiān)局規(guī)定：血液制品生產(chǎn)工藝必須包括病毒滅活/去除步驟 血
16、漿蛋白制品的生產(chǎn)：包括一步或兩步病毒滅活/去除工藝步驟 病毒滅活/去除方法： 須經(jīng)國家藥品管理部門批準后方可使用,經(jīng)血液傳播的病毒,HBV：雙鏈DNA ；脂包膜 ；40-45 nm HCV：單鏈RNA ；脂包膜 ；40-50 nm HIV：單鏈RNA；脂包膜；80-130nm HAV：單鏈RNA ；非脂包膜28-30nm 細小病毒B19：單鏈DNA；非脂包膜；18-26nm,病毒滅活方法：1、巴氏消毒法,巴氏消毒法（60/10h） 即在600.5連續(xù)加熱10-11小時。 白蛋白采用這個方法進行病毒滅活，通常是在除菌過濾、分裝到最終容器以后進行加熱處理。通常，為防止蛋白質(zhì)變性，在除菌過濾前要加
17、入低濃度的辛酸鈉或辛酸鈉與N-乙酰色氨酸作為保護劑。 幾十年的臨床使用情況證明，采用低溫乙醇法和巴氏滅活方法生產(chǎn)的白蛋白對肝炎病毒和HIV是安全的。,2、干熱法 (80/72h),凍干品加熱法 蛋白質(zhì)凍干除去水分以后可以耐受60-80或更高溫度。在80以上加熱可以產(chǎn)生令人滿意的對HBV、HCV、HIV和HAV的病毒滅活效果。 凍干品加熱法一般多用于凝血因子類產(chǎn)品。由于凍干后病毒也更穩(wěn)定，因此，必須進行在規(guī)定條件下的病毒滅活驗證。 凍干品加熱法的病毒滅活效果受產(chǎn)品的水分殘留量、組成成分如蛋白質(zhì)、糖、鹽和氨基酸的含量以及冰凍與凍干時間的影響。 由于病毒滅活對水分殘留量特別敏感，因此要根據(jù)驗證結果
18、設置允許的水分殘留限度，并保持瓶間殘留水分的差異處于限度內(nèi)。,3、S/D法,S/D法 TNBP(0.3%)/Cholate(0.2%)（30/6h） TNBP(0.3%)/Tween-80(1%)（24/6h） TNBP(0.3%)/Triton-100(1%)（24/46h） 有機溶劑與去污劑的混合物（S/D）能夠破壞包膜病毒的脂膜結構，導致受到破壞的病毒無法與感染細胞結合。但該方法不能滅活非脂包膜病毒。,4、低pH法（pH：.000.20;24,21天）,低pH法 在某些酸性條件下, 脂包膜病毒可以被滅活。免疫球蛋白經(jīng)低pH如pH4）處理，可以有效滅活幾種脂包膜病毒。如在免
19、疫球蛋白生產(chǎn)中，通常采用20-22，pH4.1培育21天。 滅活條件如pH值、孵放時間和溫度、胃酶含量、蛋白質(zhì)濃度、溶質(zhì)含量等因素，可能影響滅活效果，應確定這些參數(shù)允許變化的幅度。,5、（亞甲基藍）法,M MB在白色熒光45000lux照射小時。 MB法已用于臨床血漿的病毒滅活,6、熒光法,補骨脂S-59(150M)結合UVA(3J/cm2),7、納米膜過濾法,使用20nm或50nm的膜過濾。 8、射線法,病毒去除方法,沉淀 層析（離子交換或親和層析） 納米膜過濾,血液制品常用病毒滅活方法,1.人血白蛋白：巴氏消毒法 （60 / 10小時） 2.IVIG / IMIG（包括特異性
20、免疫球蛋白）： - 低pH孵放法 （pH4） - 巴氏消毒法 - 低pH孵放法加納米膜過濾 - 巴氏消毒法加低pH孵放法 - S/D法 3. 人凝血因子: - S / D法 （有機溶劑 / 去污劑） - S/D法 / 100 、30分鐘， 干熱法：80 、72小時。,四、血液制品的質(zhì)量 標準和質(zhì)量控制,質(zhì)量控制體系, - 國家批簽發(fā)管理 - 檢測實驗室認證體系,質(zhì)量標準體系,國家標準 -- 中國藥典 -- SFDA標準 企業(yè)標準 -- 注冊標準 -- 申報標準 -- 內(nèi)部考核和放行標準 參考標準 - WHO、 USP、BP、EP,安全性 有效性
21、穩(wěn)定性,血液制品生產(chǎn)的質(zhì)量控制,安全性 原材料的質(zhì)量控制 生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制 成品的質(zhì)量控制 外源性污染的控制,,安全性 原材料的質(zhì)量控制 供應商的質(zhì)量審核 原材料的質(zhì)量檢驗,,安全性 生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制 生產(chǎn)工藝驗證 防止污染和交叉污染 防腐劑和穩(wěn)定劑 中間品保存和效期 血液制品生產(chǎn)中應注意的問題,,安全性 成品的質(zhì)量控制 成品外觀檢測 鑒別試驗 無菌試驗 熱原質(zhì)試驗 異常毒性試驗,,外源性污染的控制 產(chǎn)品單支污染的控制 熱原的控制 Al3+含量的控制 不溶性微粒的控制,,單支污染的控制 自動灌裝系統(tǒng) 嚴格的檢疫孵放過程 分裝車間良好的凈化控制,,,熱原的控制 鱟試驗的應用生產(chǎn)過程，原液
22、，成品 微生物限度控制 主要原材料 助濾劑，濾板的吸附作用 過濾分離的去熱原作用 全封閉的分離系統(tǒng)降低熱原二次污染的機會,,Al3+含量的控制 鋁離子的來源： 原材料：助濾劑、濾板 內(nèi)包材：膠塞、瓶子 鋁離子的去除：超濾 2005年版中國藥典：人血白蛋白鋁離子200ug/L,,不溶性微粒的控制 微粒污染的危害 注射液中常出現(xiàn)的微粒有：炭黑、碳酸鈣、橡膠屑、纖維素、玻璃屑、紙屑、細菌、真菌及芽孢、結晶等。 微粒污染的危害：異物微粒引起的病理現(xiàn)象： （1）肺肉芽腫和肺水腫； （2）靜脈炎； （3）過敏反應； （4）局部組織栓塞與壞死 （5）腫瘤形成或腫瘤樣反應。,,不溶性微粒的控制
23、 微粒污染的來源及控制 潔凈室內(nèi)的發(fā)塵量，90左右來自人員，為此，必須采取隔離人體污染的衛(wèi)生措施。 室內(nèi)微粒的其他污染源 空氣 室內(nèi)墻體、地面 設備、容器 物料 進入潔凈室的物品,,靜脈輸注產(chǎn)品滲透壓的控制 人血白蛋白：滲透壓摩爾濃度應為210360 mOsmol/kg。 以成品中蛋白濃度為5%25%（滲透壓理論值約為1070 mOsmol/kg）、鈉離子不得過160mmol/L（含氯化鈉、辛酸鈉，n均以1.84計的滲透壓理論值為294mOsmol/kg）計算，本品滲透壓理論值最大約360 mOsmol/kg， 靜注人免疫球蛋白（pH4）：滲透壓摩爾濃度不得低于240 mOsmol/kg。
24、（參考EP）,,有效性 免疫球蛋白抗體效價：抗HBs每克蛋白質(zhì)應不低于6.0IU;白喉抗體每克蛋白質(zhì)應不低于3.0HAU; IVIG: Fc活性、IgG亞類齊全； 凝血因子活性：凝血因子特異活性應1.0IU/mg蛋白； 效價或蛋白含量的限量要求: 如IVIG的IGg含量應50g/L；白蛋白蛋白總量應標示量；特免的抗體效價應100IU/ml;,,1.保持天然的分子結構和完整的識別、 效應功能 2. IgG亞類齊全，符合正常人血漿配比。 3. 具有廣譜抗體。 4. Ig G完整性和Fc段活性的測定,如何評價IVIG的有效性,,穩(wěn)定性 指在規(guī)定的制劑有效期內(nèi)，或經(jīng)過運輸、貯存等環(huán)境因素影響后，任能到達原規(guī)定的合格指標。,,不同制劑的特殊要求 白蛋白類：多聚體（5%）、引起降壓反應的物質(zhì)（細菌內(nèi)毒素<1.67EU/ml、PKA 35IU/ml）、外源性污染物（鋁離子 200ug/L ）； 免疫球蛋白類：裂解物含量(分子大小分布95%)、抗補體活性( 50%)、降壓物質(zhì)（PKA 35.0IU/ml） 、血型抗體（抗A、抗B血凝素 1:64）、IgA含量； 凝血因子類制劑：病毒安全性（必須有兩步病毒滅活工藝）。,,血液制品的質(zhì)量標準和檢驗,謝謝大家！,
血液制品的質(zhì)量控制和安全性
