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1、熒光定量PCR技術(shù)在 臨床檢測中的應(yīng)用,黃少軍 市中心醫(yī)院,PCR與基因診斷技術(shù),基因診斷即通過核酸的分子生物學(xué)檢測直接檢測基因的存在狀態(tài)或缺陷對疾病作出診斷的方法。 Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶的作用，可在3個小時內(nèi)把特定的DNA片段擴(kuò)增1000萬倍。 九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面開展，1998年，熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4 基因診斷,3 免疫學(xué)診斷,臨床診斷,細(xì)胞膜,細(xì)
2、胞核,DNA,轉(zhuǎn)錄,mRNA,翻譯,蛋白質(zhì),1 形態(tài)學(xué)診斷,2 生化診斷,,概念,基本原理,以DNA為例 （1）DNA變性： （2）降溫退火： （3）引物延伸：,原理 第一步 加熱變性,預(yù)處理,第二步 引物與靶序列退火,,第三步 - 引物延伸,第1個 PCR 循環(huán)完成后 得到兩個拷貝的靶序列,PCRPCR.exe動畫,30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824,熒光PCR的原理,PCR技術(shù)的特點,靈敏度高 特異性強 快速簡便 應(yīng)
3、用范圍廣,Ct值的意義,Ct值與重復(fù)性 同一樣本在相同條件下同時進(jìn)行96次擴(kuò)增,FQ-PCR,Ct值與濃度 不同的模板達(dá)到熒光域值時的Ct值不同,,感染性疾病的診斷 母嬰傳播的控制與觀察 遺傳疾病的診斷 腫瘤的診斷 法醫(yī)學(xué)鑒定,熒光定量PCR的臨床應(yīng)用,早期診斷 病情評估和預(yù)后判斷 抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo) 新藥驗證,一 感染性疾病 1. 病原體含量與病情之間的關(guān)系 2. 病原體含量與用藥之間的關(guān)系 3. 藥物及療法的研究與開發(fā) 4. 新的病原體分子診斷標(biāo)準(zhǔn) 5. 新的愈后指標(biāo) 6. 傳染病發(fā)病的監(jiān)控、預(yù)測與預(yù)防,臨床應(yīng)用,臨床應(yīng)用,,二 腫瘤 1. 腫瘤標(biāo)志物：癌胚抗原、同功酶、抗體、激素
4、、細(xì)胞因子、受體等 2. 腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的檢測：包括癌基因抗癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因及轉(zhuǎn)移抑制基因,三 遺傳病 1. 等位基因檢測 2. 多基因遺傳病的突變檢測 3. 基因表達(dá)異常所致遺傳病檢測,1.親子鑒定 2.法醫(yī)物證 3.PCR-RFLP技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用 4.罪犯鑒定,法醫(yī)鑒定,免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學(xué)檢測存在較長的“窗口期”，不利于對疾病的早期診斷；PCR方法直接檢測病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測顯然也有利于疾病的早期診斷。,疾病的早期診斷,熒光定量PCR在病原體檢測中的應(yīng)用,一 肝炎病毒定
5、量檢測 二 性病病原體檢測 三 結(jié)核桿菌及呼吸道病原體檢測 四 優(yōu)生優(yōu)育(TORCH)相關(guān)項目檢測,臨床應(yīng)用,肝炎病毒定量檢測 HBV HCV,臨床應(yīng)用,（一） 乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及特點,HBsAg：是HBV感染的主要標(biāo)志 HBsAb：保護(hù)性抗體 HBcAg：僅存于感染的肝細(xì)胞核內(nèi)， 一般不存在于血循環(huán)中 HBcAb: 非保護(hù)性抗體，HBcAb-IgM 提示HBV處于復(fù)制狀態(tài) HBeAg：HBV復(fù)制及強感染性的指標(biāo) HBeAb：有一定的保護(hù)作用，預(yù)后良好,HBV,HBV,（二） HBV-DNA與“兩對半”,1. “兩對半” ：機體的免疫反應(yīng)狀態(tài)；,2. “攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學(xué)
6、指標(biāo)不能 反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。,FQ-PCR：檢測的是HBV本身的遺傳物質(zhì)DNA，是 病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。,3. 血清學(xué)指標(biāo)()不能排除HBV感染。,HBV,（二） HBV-DNA與“兩對半”,,4. 也可能出現(xiàn)HBsAg()，HBV-DNA()。,5. HBsAb () 、 HBcAb () 、 HBeAb ()三抗體陽性 與HBV DNA 2.5 103 copy /ml 結(jié)果解釋。,HBV,(三)HBV-DNA定量檢測的臨床意義,3. HBV-DNA定量與預(yù)后 a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 b. 癌變的幾率明顯高于含量低者,1. HBV-
7、DNA定量與HBV復(fù)制水平及傳染性,2. HBV-DNA定量與乙肝藥物療效 a. 專家提出<103 copy /ml做為陰性或臨床治愈標(biāo)準(zhǔn) b. HBV-DNA定量分析與干擾素治療(前、中、后) c. 拉咪呋啶,HBV,(三)HBV-DNA定量檢測的臨床意義,4. HBV-DNA定量有助于指導(dǎo)懷孕與孕期，哺乳期檢查,6. 血液制品和獻(xiàn)血員的篩選,HBV DNA檢測的臨床意義,HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù) HBV DNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志 HBV DNA是患者具有傳染性的標(biāo)志 HBV DNA對乙肝兩對半起補充作用 HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)
8、HBV DNA可檢測出隱匿性慢性乙型肝炎,病毒特點： 1. 單正鏈RNA病毒 2. E1和E2區(qū)基因高度變異性,（一）丙型肝炎病毒特點,HCV,感染特點： HCV在血中含量極微 輸血后肝炎主要致病因子 免疫學(xué)標(biāo)志僅有抗-HCV，非中和抗體，產(chǎn)生時間不一 有一部分人感染HCV后，不產(chǎn)生抗-HCV 感染易于慢性化(50-85%) 疫苗研制尚不成功,單鏈RNA,,(二)HCV-RNA定量檢測的臨床意義,1. 早期診斷 a. 臨床以< 80 copy/ml做為無感染或治愈標(biāo)準(zhǔn)。 b. HCV感染1-3W，即可檢出HCV-RNA的存在。 c. 嚴(yán)格篩選獻(xiàn)血員 ,提高對窗口期感染者的檢出率。,H
9、CV,HCV,(二)HCV-RNA定量檢測的臨床意義,2. HCV-RNA載量與抗-HCV滴度、ALT水平之間的相關(guān)性。 抗-HCV滴度和ALT異常率隨著HCV-RNA載量升高而增加。,3. HCV-RNA是評價抗病毒治療效果的重要指標(biāo)。,4. 慢性丙型肝炎長期抗-HCV陽性，這時如果進(jìn)行HCV-RNA 定量檢測可以鑒別活動性、復(fù)制程度。,二常見性傳播疾病病原體,一淋球菌（NGH） 二沙眼衣原體（ CT ） 三解脲脲原體（UU） 四梅毒螺旋體（TP） 五單純庖疹病毒（HSV） 六乳頭瘤病毒（HPV） 七人類免疫缺陷病毒（HIV）,STD,NGH,淋球菌感染與致病,1. 人是淋球菌的惟一宿主
10、。,2. 發(fā)病率最高，在所STD疾病中，高達(dá)60%左右。,3. 發(fā)病趨勢： a. 男性多于女性。 b. 城市走向農(nóng)村， c. 高收入階層向低收入階層擴(kuò)展,4. 人對淋球菌感染無天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。,5. 如母親為淋病患者，嬰兒出生時易患上淋球菌性結(jié)膜炎,CT,沙眼衣原體感染與致病,1. 嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生。,2. 不僅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要 病原體。,3. 近年來在歐美等國，沙眼衣原體的感染率和危害 性已超過淋球菌而居STD之首。,4. 在我國，在非淋球菌性尿道炎中，居首位。,5. 泌尿生殖道感染，妨礙妊娠。,6
11、. 盆腔感染，可致生殖能力損害。,UU,解脲脲原體感染與致病,合成尿素酶，分解尿素,2. 在非淋球菌性尿道炎其感染率僅次于衣原 體感染，居第二位。,3. 流產(chǎn)超過4次以上者，檢出率高達(dá)80%。,4. 有30-40%男性尿道炎是由感染UU所致。,5. 與男性不育相關(guān)。男性不育患者精液中，脲原體檢出率高達(dá)66.6。檢出率隨精子數(shù)減少和精子活動力下降而升高。,1. 非培養(yǎng)或形態(tài)學(xué)檢查的診斷技術(shù)，快速、特異、敏感。 2. 對無癥狀或癥狀輕者，可以早期確診。 3. 對NGH、CT、UU 等混合感染者，診斷和鑒別診斷。 4. 指導(dǎo)用藥、考核療效。,熒光定量PCR診斷NGH/CT/UU的意義,NGH/CT
12、/UU,NGH/CT/UU,熒光定量PCR診斷NGH/CT/UU的意義,5. 不孕不育、優(yōu)生優(yōu)育。 6. 流行病學(xué)調(diào)查，為性傳播疾病的監(jiān)控提供依據(jù)。,,CT、UU、NGH、 HPV、 TP 除NGH可培養(yǎng)外，其余難培養(yǎng)或者不能培養(yǎng)。 即使能培養(yǎng)，所需時間長48小時。,人乳頭瘤病毒感染與致病,1. HPV具有宿主和組織特異性，只能感染人的皮膚和黏膜上皮細(xì)胞，人是HPV的惟一宿主。 2. 有100多個型。 3. 低危型：HPV 6、11引起良性病變 (尖銳濕疣、喉乳頭瘤等),HPV,人乳頭瘤病毒感染與致病,HPV,4. 高危型：HPV 16、18引起惡性腫瘤 (宮頸癌、 肛門癌、口腔癌等) 5.
13、 免疫原性低，易形成持續(xù)性感染。 6. 新生兒產(chǎn)道感染。,看看這些英年早逝的藝人，她們死于宮頸癌宮頸癌的知曉率在不斷提高。,梅艷芳(40歲),國家一級演員 李媛媛(41歲),HPV,1. 對典型病例可以明確診斷。 2. 對臨床表現(xiàn)和組織病理改變都不典型的病例同樣可以做出診斷。 3. 對亞臨床和隱性HPV感染做出診斷。 4. 基因分型。 5. 考核療效與預(yù)后。 6. 病毒載量與患癌癥風(fēng)險。,HPV,,熒光定量PCR檢測HPV的意義,HPV,三結(jié)核桿菌與呼吸道病原體檢測,TB：Tubercle bacilli CP：Chlamydia pneumonia MP：Mycoplasmal pneumo
14、nia SARS：severe acute respiratory syndrome,結(jié)核桿菌流行現(xiàn)狀（1）,羅伯特科赫（），德國細(xì)菌學(xué)家，結(jié)核桿菌發(fā)現(xiàn)者 結(jié)核病是一個全球性的問題，近年來在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)流行，且呈增長的趨勢,TB,結(jié)核桿菌流行現(xiàn)狀（2）,我國結(jié)核病的疫情僅次于印度而居世界第二位 2000年，全國人口結(jié)核感染率為44.5%，其中1544歲人群占了53 ，每年約有25萬人死于結(jié)核病,結(jié)核桿菌引起的感染,肺部感染：原發(fā)性肺結(jié)核，開放性肺結(jié)核。 肺外感染：腦、腎、骨、關(guān)節(jié)、生殖結(jié)核、腸結(jié)核、結(jié)核性腹膜炎、全身性結(jié)核。,常規(guī)結(jié)核病實驗室診斷方法及不足,1. 痰涂片作抗酸染色：陽性率低
15、、費時 2. 細(xì)胞培養(yǎng)“金標(biāo)準(zhǔn)”：周期太長(3-4W) 3. 血清學(xué)診斷： a. 接種BCG可出現(xiàn)陽性 b. 不能區(qū)分活動性結(jié)核病和治愈后留下?lián)p傷灶的病人 c. 交叉反應(yīng)，假陽性 不能早期診斷！容易漏診、誤診！,TB,熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義,1. 能穩(wěn)定檢測10copy的TB-DNA ，靈敏度高 ，特異性強 2. 早期、快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病。 痰液、肺及支氣管灌洗液肺結(jié)核 血液播散性結(jié)核和各臟器的結(jié)核病 腦脊液中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病 宮頸拭子、尿道拭子泌尿生殖道結(jié)核病,TB,3. 熒光定量PCR檢出結(jié)核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。 4
16、. TB-DNA濃度可用于判斷療效： 痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌的數(shù)量呈逐漸下降趨勢 ，TB-DNA拷貝數(shù)下降。根據(jù)病原體DNA濃度，對藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù),TB,熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義,四TORCH感染特點與檢測,TOX : Toxoplasma gondii RV: Rubella virus CMV: Human cytomegalovirus HSV: Herpes simplex virus,TORCH,TORCH感染特點,1. 母-胎傳播的主要病原體 2. 引起胎兒畸形新生兒缺陷的重要原因 3. 自然狀態(tài)下呈隱性感染 4. 懷孕、多次輸血、AIDS等易
17、發(fā)生顯性感染 5. 可致多發(fā)性、全身性感染 6. 只有風(fēng)疹可獲得長久的免疫力，可用疫苗預(yù)防,TORCH,(一) 弓形蟲感染與致病,滋養(yǎng)體如弓形 ，廣泛分布，人獸共患。 寄生在有核細(xì)胞中，貓和貓科動物是終宿主 易感者多，免疫者少 我國智力低下兒的弓形蟲感染率28 畸形兒的弓形蟲抗體IgM陽性率12.25 艾滋病患者約有2080合并弓形蟲感染 ，造成艾滋病死亡的一個重要并發(fā)病,TORCH TOX,人群自然感染率達(dá)到60-90%，多為隱性感染 免疫功能低下(懷孕、多次輸血、器官移植、AIDS)發(fā)生顯性感染 可發(fā)生垂直傳播，是宮內(nèi)感染和胎兒畸形的主要病毒之一 圍生期感染 血、尿、乳汁、精液、分
18、泌物中都可檢出病毒,(二) 人巨細(xì)胞病毒感染與致病,TORCH-CMV,風(fēng)疹是一種世界性的病毒傳染病， 是造成畸胎及先天性疾病的病毒之一 出疹前1周至出疹后5天均有傳染性 人是風(fēng)疹病毒的唯一宿主 風(fēng)疹感染后可獲得持久的免疫力，臨床顯性再感染并不多見。,(三) 人風(fēng)疹病毒感染與致病,TORCH-RV,先天性風(fēng)疹感染往往發(fā)生在母體初次感染之時，可致先天性風(fēng)疹綜合癥(CRS) 三聯(lián)癥：白內(nèi)障、耳聾、心臟病。 妊娠時體內(nèi)皮質(zhì)類固醇激素的增加以及細(xì)胞免疫功能的減弱，這種對正常人無害的再感染有可能造成病毒蔓延以至影響胎兒。,TORCH-RV,(三) 人風(fēng)疹病毒感染與致病,HSV原發(fā)感染多為隱性，大多無臨床
19、癥狀或呈亞臨床表現(xiàn) HSV-1主要引起口唇皰疹，皰疹性結(jié)膜炎、腦炎，皮膚性皰疹 HSV-2主要引起原發(fā)性生殖器皰疹 (80%) 。 HSV感染后大多數(shù)個體不能徹底消滅病毒，也不能阻止復(fù)發(fā)，病毒以潛伏狀態(tài)長期存在宿主體內(nèi)。,TORCH-HSV,(四) 人單純皰疹病毒感染與致病,妊娠期婦女因HSV-1被激活，可通過胎盤感染胎兒，引起胎兒畸形、智力低下、流產(chǎn)等。 圍產(chǎn)期感染可引發(fā)新生兒皰疹，死亡率高達(dá)50%以上。 HSV常與HIV-1同時感染，并能促進(jìn)病情發(fā)展，引起嚴(yán)重的局部和播散性感染。目前認(rèn)為HSV是一種調(diào)節(jié)因素，能激活HIV復(fù)制 與宮頸癌關(guān)系密切。,TORCH-HSV,(四) 人單純皰疹病毒感
20、染與致病,常規(guī)TORCH檢測方法與不足,組織培養(yǎng)或病原體分離：慢，費力，陽性率低。 血清學(xué)診斷： IgG： 人群自然感染率高達(dá)60-90%。 IgG()不能區(qū)別既住感染與現(xiàn)癥感染； 新生兒IgG()不能說明有感染。 IgM： IgM()可能是原發(fā)性感染； IgM()不能排除感染。,TORCH,局限性： 1. 不能定量分析 2. 抗體的產(chǎn)生受多種因素的影響 3. 交叉反應(yīng)，假陽性,熒光探針檢測TORCH的優(yōu)勢,原理：直接檢測TORCH病原體的核酸 優(yōu)點：靈敏、快速，特異 意義：早期診斷，婦幼保健、優(yōu)生優(yōu)育 1. 篩選TORCH患者，提高出生人口素質(zhì)。 2. 有利于預(yù)測胎兒宮內(nèi)感染狀況及
21、妊娠結(jié)局。 3. TORCH感染孕婦的治療效果觀察。 4. 器官移植、免疫系統(tǒng)疾病等病人監(jiān)控。 5. 建立TORCH的分子診斷標(biāo)準(zhǔn),TORCH,TORCH,,TORCH檢測核酸與檢測標(biāo)本的比較,檢驗結(jié)果解析,HBV--DNA定量結(jié)果 定量測定，測定的是病毒量的“多”或“少”； 結(jié)果報告方式： 多少？，<多少？具體值？,舉例,例如：試劑盒檢測范圍是103108IU/ml,我們測定的陰性結(jié)果應(yīng)報告 103 IU/ml；（無、含量低）。中間值報告具體數(shù)據(jù)；當(dāng)含量高于最高檢測限時，報告108 IU/ml。 （ 108 IU/ml； 109 IU/ml ..） 參考范圍?,,IU/ml與COP/m
22、lD的換算---咨詢廠家 3.5E+05 IU/ml----表示一毫升血清中有350，000個HBV病毒微粒。,HBVDNA的變化,在患者治療過程中檢測HBVDNA定量，一般認(rèn)為：其結(jié)果相差5倍屬正常波動，結(jié)果相差降低10倍以上才算治療有效。,例如1,有一患者治療前檢測HBV-DNA定量為8.8E+06 IU/ml，治療一月后復(fù)查為2.3E+07 IU/ml，兩結(jié)果相差2.6倍。（不一定是高了？） 如何向病人解釋： 屬正常波動或者檢測誤差（允許誤差）,例如2,一患者治療前檢測HBV-DNA定量為9.2E+06 IU/ml；治療一月后復(fù)查為2.8E+06 IU/ml，兩結(jié)果相差3.3倍，不能說明治療有效，需要繼續(xù)觀察。要有明顯的下降趨勢。,檢驗報告單結(jié)果讀取,3.637E+06 檢測下限: 1000拷貝/毫升 3.637106 1.000E+03 copy/ml,如果是標(biāo)本量是可以定量的，如血液、腦脊液等，則檢測結(jié)果報告為：copy/ml 如果是標(biāo)本量不能定量，如分泌物等，則結(jié)果只能報告為：copy,Thank You !,
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