細胞重組與克隆技術(shù).doc

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第7章 細胞重組與克隆技術(shù) 主要內(nèi)容：7.1細胞重組 7.2克隆技術(shù) 7.1 細 胞 重 組 7.1.1 細胞重組的定義 細胞重組（Cell Reconstruction）,又稱細胞拆合是指從活細胞中分離出細胞器及其組分，然后在體外一定條件下將不同細胞來源的細胞器及其組分進行重組，使其重新裝配成為具有生物活性的細胞或細胞器的一種實驗技術(shù)。 在探討真核細胞的起源時。馬吉利斯(MaRdls)曾于1972年提出了內(nèi)共生學(xué)說：真核細胞起源于原核細胞，是幾個原核細胞共生結(jié)合的結(jié)果。如藍陰滴蟲，細胞內(nèi)含葉綠體，就是藍藻在陰滴蟲內(nèi)共生的結(jié)果；綠草履蟲體內(nèi)的綠色物體，就是與之共生的一種小球藻。 這種不同細胞的結(jié)合過程類似于細胞的自然裝配。 細胞的生長過程包含著細胞器的自我裝配，但這是一種活體的自我裝配，而細胞重組則是離體的裝配過程。 7.1.2 細胞重組的意義 細胞重組技術(shù)是現(xiàn)代生物工程中的熱點課題，細胞重組與細胞融合技術(shù)是細胞工程中的細胞或細胞器水平上主要構(gòu)建手段，它與基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、干細胞技術(shù)等結(jié)合，可以人為地獲得新物種或使細胞表達新的性狀和新的產(chǎn)物。 7.1.3 細胞重組技術(shù)發(fā)展概況 7.1.4 幾個重要概念 胞質(zhì)體(Cytoplast)：是指除去細胞核后由膜包裹的無核細胞。 微細胞(Microcell)：是指只有一條或幾條染色體和一薄層細胞質(zhì)，外面包裹一層完整的細胞質(zhì)膜的核質(zhì)體。 核體(Karyoplast)：是指與胞質(zhì)分離得到的細胞核，帶有少量胞質(zhì)并圍有質(zhì)膜，稱為核體。 7.1.5 細胞重組的方式 胞質(zhì)體(Cytoplast)：與完整細胞重組形成胞質(zhì)雜種(Cybrid)。 微細胞(Microcell)：與完整細胞重組形成微細胞異核體(Heterokaryon)。 胞質(zhì)體與核體(Karyoplast)：重新組合形成重組細胞。 7.1.6 細胞重組技術(shù) 1、顯微操縱術(shù) 一般是在顯微解剖鏡下，把細胞放入消毒的培養(yǎng)液中，同時放入冷卻系統(tǒng)中以減慢細胞發(fā)育，然后借助一臺專門的裝置——顯微操作儀，用細微玻璃針或用微細管、微電極、微熱電偶等斜插入細胞中去，可以挑取細胞核，人工造就去核細胞；也可以進一步作移核實驗與電生理實驗。 用這種儀器能夠進行細胞各部分的解剖、細胞各部分物質(zhì)的抽取和移植、各物質(zhì)的注入、測量微電位的變化等等。 意義: 1、實現(xiàn)細胞的拆合 2、為研究細胞內(nèi)的基因表達與調(diào)控和改良動物品種提供了一種重要手段。 2、細胞分離技術(shù) 分離細胞主要是根據(jù)細胞本身的某些特殊性質(zhì)來選擇合適的分離技術(shù)來分離具有同一性狀的細胞群、這些性質(zhì)包括：細胞大小、密度、表面電荷、表面標(biāo)志、細胞中一個或多個成分的熒光強弱、細胞對其他介質(zhì)的吸附作用 經(jīng)常采用的細胞分離方法如下： （1）差速離心（differentialcentrifugation） 　　在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器 在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。（速度升高，樣品按大小先后沉淀） 　　由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)2～3次效果會好一些。 　　差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細胞，更多用于分離細胞器。對于精細的分離，則是密度梯度離心效果更好。 （2）梯度沉降分離法 主要是根據(jù)細胞大小不同分離細胞、細胞在單位重力作用下，通過密度介質(zhì)、或在低離心力作用下通過梯度密度溶液沉降，由于細胞大小不同，沉降速度不同。細胞大，沉降快。 常采用適當(dāng)?shù)姆蛛x介質(zhì)形成一定的梯度密度溶液．這此介質(zhì)主要有：血清、蔗糖等： （3）等密度沉降分離法 主要是根據(jù)細胞密度差異來分離細胞。 細胞在連續(xù)密度梯度分離介質(zhì)中、受強離心力的作用，最后到達與其密度相同的分離介質(zhì)層面，并保持平衡。 如果是非連續(xù)密度梯度介質(zhì)中，細胞主要集中在介于其自身密度的兩種密度介質(zhì)交界面上，從而達到分離的目的。 目前常采用的分離介質(zhì)有蛋白等。密度分離劑應(yīng)該具有無刺激，對細胞無吸附作用，產(chǎn)生的滲透壓小等特點 （4）流式細胞儀分離法 這種方法是以免疫熒光法使熒光抗體與細胞膜表面抗原結(jié)合，然后用超聲波處理使其分散成單個細胞，再將細胞懸浮液通過一個直徑為50um的噴嘴變成極細小的微滴，每個微滴一般含有一個細胞，以l0m/s的速度噴出。經(jīng)激光照射是細胞上所帶熒光被激發(fā)而轉(zhuǎn)換成脈沖．通過測定脈沖數(shù)就可以換算出各種不同細胞表面抗原的情況。同時由于懸浮微滴中的細胞帶有不同程度的負電荷，這樣在施加電場后。移行偏斜的程度不同，而不帶電荷的細胞仍以直線流過、借此可以收集得到不帶電荷或帶電荷多少不同的各種細胞。 這種方法優(yōu)點是分離速度快，分離得到的細胞仍能保持其功能；缺點是需要專門的設(shè)備。 3、細胞破碎方法 細胞器的分離需要將組織細胞破碎，常用的方法有：超聲波破碎法；反復(fù)凍融法；化學(xué)裂解法；高速組織搗碎法。 （1）超聲波破碎法 原理是：超聲波發(fā)生器產(chǎn)生高強度超聲信號，經(jīng)換能器傳送至與其接觸的細胞溶液中，由聲波沖擊和振動產(chǎn)生的剪切力使細胞破碎。 缺點是破碎過程中會產(chǎn)熱，應(yīng)該注意冷卻。有些生物大分子不宜采用。 （2）反復(fù)凍融法 使細胞溶液或組織細胞漿在超低溫冰箱或液氮罐內(nèi)凍結(jié)后，在37℃復(fù)溫融化，重復(fù)3-4次操作使細胞壁破碎。 （3）化學(xué)裂解法 在細胞懸浮液中加入某些化學(xué)物質(zhì)如十二烷基硫酸鈉等使細胞膜裂解。在使用該方法的同時常要輔助以一些機械的方法才能使細胞在短時間內(nèi)完全破碎；由于化學(xué)裂解劑會干擾分析，在細胞裂解后應(yīng)注意清除化學(xué)裂解劑。 （4）高速組織搗碎法 主要借助高速組織搗碎機使細胞被高速旋轉(zhuǎn)的葉片破碎。 由于也會發(fā)熱，可能導(dǎo)致分離物的降解，因此不能時間過長．必要時可使用循環(huán)水冷卻 4、細胞器分離方法 為了研究細胞內(nèi)某種細胞器的生化組成、生理功能，或用于細胞重組，常需大量采集細胞的某些組分。常用的方法有：研磨、超聲振蕩和低滲等將組織制成勻漿，細胞中的一些亞組分就從細胞中釋放出來。然后采用以上介紹的沉降分離法實現(xiàn)分級分離。 【實驗】細胞器分離、制備與觀察 【目的】（1）掌握分離制備動物細胞線粒體的方法。（2）對分離得到的線粒體進行活性鑒定。 【原理】線粒體（mitochondria）是真核細胞特有的，司能量轉(zhuǎn)換的重要細胞器。細胞中的能源物質(zhì)——脂肪、糖、部分氨基酸在此進行最終的氧化，并通過耦聯(lián)磷酸化生成ATP，供給細胞生理活動之需。 將動植物組織制成勻漿，在適當(dāng)?shù)膽腋〗橘|(zhì)中用差速離心法可以分離細胞線粒體。在一定的離心場中(選用離心機的一定轉(zhuǎn)速)，球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的黏度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其他內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。 細胞器沉降先后順序是細胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。 懸浮介質(zhì)通常采用緩沖的蔗糖溶液，它較接近細胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性； pH7.2的條件下；亞細胞組分不容易重新聚集成團，有利于分離。 整個操作過程樣品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。 細胞器標(biāo)記酶的測定是評價細胞器內(nèi)膜組分和分離純度的主要依據(jù)，如線粒體內(nèi)膜上分布有細胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。 ******************************************************************************* 舉例：鼠肝線粒體的分離 1．制備肝細胞勻漿： 實驗前將鼠空腹12小時，擊頭處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干水，稱取肝組織2g，剪碎；用預(yù)冷的0.25 mol／L蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后按每克肝加4.5 mL預(yù)冷的0.25 mol／L蔗糖溶液的量，分數(shù)次添加蔗糖溶液，在0~4℃冰浴中用玻璃勻漿器將肝制成勻漿，用雙層紗布過濾。 2．差速離心： 將0.34 mol／L蔗糖溶液4.5mL放入離心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝勻漿覆蓋于上層。用冷凍控溫的高速離心按下圖順序進行差速離心。 分離細胞核： 活性鑒定： (1) 細胞核：取核沉淀1滴涂于載玻片，加入Carnoy固定液（甲醇：冰乙酸3:1）15 min，晾干。Giemsa染液染10 min，蒸餾水漂洗數(shù)秒，用濾紙吸干水、用顯微鏡(40×)檢查，細胞核呈紫紅色，混雜的胞質(zhì)為淺藍色碎片。 (2) 線粒體： 取線粒體沉淀滴在載玻片上，勿太密。滴加1％詹鈉斯綠溶液染液，10 min后用光學(xué)顯微鏡觀察，線粒體藍綠色，呈小棒狀或啞鈴狀。 ******************************************************************************* 5、胞質(zhì)體、核體、微細胞的制備（細胞重組常用的幾個原料，重點介紹） （1）胞質(zhì)體 方法：細胞松弛素B處理體外培養(yǎng)細胞能誘發(fā)其排核，結(jié)合高速離心得到了胞質(zhì)體。 影響制取胞質(zhì)體的因素：容器，有玻璃片、塑料片、離心管、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等，需在滅菌恒溫培養(yǎng)室中進行。適宜的溫度、細胞松弛素B的劑量、培養(yǎng)液濃度及其血清含量、離心速度、細胞密度等。 特點： 植物細胞的胞質(zhì)體內(nèi)的細胞器與完整細胞相同，具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系、線粒體、溶酶體、高爾基體和中心粒及微粒、微管等骨架系統(tǒng)，各細胞器仍占有固有的位置。線粒體的運動十分活躍，線粒體膜上各酶系的分布及氧化磷酸化過程都照樣存在。 胞質(zhì)體內(nèi)線粒體內(nèi)自主性的DNA復(fù)制尚能有限地進行著。蛋白質(zhì)的合成在去核后的一段時間內(nèi)持續(xù)進行。因此，去核細胞質(zhì)體是深入研究細胞質(zhì)作用的重要樣品。 （2）核體 與胞質(zhì)分離得到的細胞核，帶有少量胞質(zhì)并圍有質(zhì)膜，稱為“核體”。核體能重新再生其胞質(zhì)部分，繼續(xù)生長、分裂。 為了生產(chǎn)大量的核體，必須采用一系列的純化技術(shù)，以防夾雜完整細胞和胞質(zhì)體?？稍谌ズ颂幚砗?從離心管底部收集樣品,接種于培養(yǎng)皿內(nèi),溫育1-2h，由于核體的貼壁率大大低于殘留完整細胞的貼壁率，可從上清液中收集得到較純凈的核體。如此重復(fù)1-2次,可使核體的純度高達99％。 （3）微細胞 秋水仙素及其衍生物和長春新堿等有絲分裂阻斷劑能干擾微管的合成與裝配，而使染色體停滯在有絲分裂中期。 經(jīng)體外培養(yǎng)，在單個染色體或染色體周緣就會重現(xiàn)核膜而形成含有一個微核、一薄層細胞質(zhì)和一個完整質(zhì)膜的微細胞。這種微細胞僅含有一個或數(shù)個染色體的DNA，也是細胞拆合工程的一種有用材料。 （4）小結(jié) 用上述方法從活細胞中拆散出來的胞質(zhì)體、核體、微細胞為材料，通過顯微操縱術(shù)，在光學(xué)顯微鏡下用顯微操縱器把材料重新組合，加入病毒或化學(xué)物質(zhì)如聚乙二醇等融合因子，經(jīng)過一段時間的作用，可以把它們更新裝配成新的活細胞。 胞質(zhì)體、核體和微細胞的制備 6、細胞拆合的方法 （1）物理拆合法： 早期：使用的核、質(zhì)分離方法是用紫外線或激光將核破壞，再用微玻璃針或微吸管將其他細胞核吸入 后期：將細胞融合技術(shù)與顯微外科手術(shù)結(jié)合，作微吸管將細胞核連同周圍少量細胞質(zhì)吸出，再吸入等量的滅活的病毒懸液，一并注入已去核的細胞中，讓其發(fā)生融合 （2）化學(xué)拆合法 ①細胞松馳素效應(yīng)： 干擾細胞質(zhì)的分裂； 引起細胞表面形狀的改變和排出細胞核； 抑制細胞的運動； 阻礙細胞的吞噬或胞飲； 減低細胞的粘著程度； 阻止神經(jīng)細胞軸突的生長； 影響葡萄糖和核苷酸的攝??； 影響甲狀腺素的分泌和生長激素的釋放以及影響細胞質(zhì)的流動； 高濃度的細胞松馳素能使離體或活體的多種細胞發(fā)生明顯的表面形態(tài)的改變。其中之一是在細胞表面產(chǎn)生所謂的“皰疹” ②胞質(zhì)體和核體的制備 將細胞培養(yǎng)在玻璃或塑料平板上，一般培養(yǎng)2天以上脫核。將經(jīng)37℃預(yù)溫的CB溶液（含CB10μg/mL和小牛血清5%）5mL加入50mL離心管內(nèi)，把生長有細胞的塑膠板面朝下，水平放入CB溶液中，在圓板上壓上一個圓形的栓，以防止圓板移動位置。蓋好離心管后，放入經(jīng)37℃預(yù)溫過的轉(zhuǎn)頭內(nèi)進行離心。多數(shù)細胞株在11000-15000r/min離心15-30min，有80%的細胞脫核 按上述去核過程，即可得到無核的胞質(zhì)體和細胞核，但在被分離出的核中帶有少量胞質(zhì)并圍有質(zhì)膜，稱為“核體” 去核前作預(yù)離心，可去除貼壁不牢的完整細胞。 去核以后一般用貼壁法純化，即可利用核體貼壁附著性弱、完整細胞附著性強的特點進行純化。重復(fù)兩次，可把大部分完整細胞除掉 ③微核體的制備 秋水仙素及其衍生物和長春新堿等有絲分裂阻斷劑能干擾微管的合成與裝配，而使染色體停滯在有絲分裂中期。動物細胞受秋水仙堿作用，形成了大小不同的多個微核，用CB使微核從細胞分離出來。 制備微核體的時候，用0.1μg/mL秋水仙堿長時間（48h以上）處理細胞，細胞分裂就被控制在分裂中期，此時染色體動力終止，在單個染色體或染色體群之周緣重現(xiàn)核膜，形成了大小不同的多數(shù)微核，此時的細胞就叫微核化細胞。一般用14000r/min離心20min 即可脫核80-90%。 7、細胞重組及細胞質(zhì)雜交 （1）動物細胞重組及細胞質(zhì)雜交 ①進行細胞重組時，在融合環(huán)圓板上放入核體(0.2mL)和仙臺病毒(HVJ)0.1mL以及緩沖液0.5mL進行融合。 ②進行細胞質(zhì)雜交時，向圓板上加入完整細胞懸液0.5mL(一個圓板上約有細胞2-3×105個)，放置15min以便細胞質(zhì)體和完整細胞接觸，然后吸除懸液，再加PEG 0.25mL作用30s。 ③細胞融合處理后，加培養(yǎng)液洗融合環(huán)內(nèi)的圓培養(yǎng)液反復(fù)4次吸引洗凈后，加入10%-15%小牛血清培養(yǎng)液1-2h。最后用0.1%胰酶使融合細胞從板上脫落，移入新平皿內(nèi)培養(yǎng)。 ④融合后重組細胞株的分離。 （2）植物的細胞重組 使胞質(zhì)體與核懸浮并沉淀在硝酸鈣溶液中，除去上清液，先把它們懸浮，然后以適當(dāng)比例使核與胞質(zhì)體在試管中混合，離心，隨后加入PEG處理使它們凝集，再慢慢加入硝酸鈣溶液，促使核的攝入，其后洗滌、培養(yǎng)，把異核的原生質(zhì)體培養(yǎng)成新的植株。 （3）微生物的細胞核與原生質(zhì)體融合 核體的分離：降低原生質(zhì)體滲透壓使質(zhì)膜破裂，同時保護核體和核膜的穩(wěn)定使細胞核分離出來，經(jīng)過蔗糖梯度離心純化可得到提純的核樣品 把核與營養(yǎng)缺陷互補的受體菌原生質(zhì)體混合，在PEG的誘導(dǎo)作用下得到核與原生質(zhì)體的融合產(chǎn)物 7.2 克隆技術(shù) 7.2.1 克隆的定義 克隆(Clone)原指遺傳上完全相同的分子、細胞或來自同一祖先的生物個體的無性繁殖群體，現(xiàn)在也指一種實現(xiàn)無性繁殖的操作。克隆是指一種實現(xiàn)無性繁殖的操作，而不是一般意義上的無性繁殖。 7.2.2 克隆的理論基礎(chǔ)——細胞全能性。 克隆在植物界已有上千年的歷史。理論的上的突破在20世紀(jì)。 1902年德國植物學(xué)家哈伯蘭德提出，植物的體細胞具有母體全部的遺體信息，具有發(fā)育成為完整個體的潛能。因而每個植物細胞都可像胚胎細胞那樣，經(jīng)離體培養(yǎng)再生成為完整植株。這就是所謂的細胞全能性。 理論上，任何一個細胞都含有其生物體系基因組的全部基因，都可以被克隆。實際上，動植物細胞克隆結(jié)果差別很大?？寺‖F(xiàn)象在植物界普遍存在。既可以是自然的，也可以是人工的。 7.2.2 克隆的理論基礎(chǔ) 與植物細胞不同，在動物發(fā)育過程中分化了的細胞不再產(chǎn)生完整的充分分化的個體，然而，動物胚胎的生長、分化和發(fā)育是否造成體細胞基因組的不可逆性修飾，即在發(fā)育過程中分化了的細胞是否具有與受精卵相同的核等價性或基因組連續(xù)性、一直是發(fā)育生物學(xué)要解決的問題 早在20世紀(jì)30年代，著名的胚胎學(xué)家斯佩爾曼就已經(jīng)提出了分化了的細胞核移入卵子中能否指導(dǎo)胚胎發(fā)育這樣的設(shè)想。用兩棲類動物進行的一些克隆實驗表明，早期胚胎細胞核經(jīng)移植可產(chǎn)生成熟的動物個體。也就是說尚未分化的胚胎細胞具有全能性?；谶@種認知、人們采用胚胎分割及胚胎細胞核移植技術(shù)成功克隆出了許多動物。 這種對動物細胞全能性的認識自1997年后得到改變，體細胞克隆動物“多利”羊的成功證明成熟的體細胞也具有全能性；后來，體細胞克隆小鼠、牛及山羊的成功，更充分證明高度分化的細胞核仍具有全能性。 因此，人們對細胞全能性有了全新的認識。 7.2.3 克隆的技術(shù)方法 目前，克隆技術(shù)最成功的應(yīng)用體現(xiàn)在克隆動物的培育上。下面主要介紹以細胞核移植為核心的無性繁殖技術(shù)。 （一）定義 細胞核移植技術(shù)（Cell nuclear transplantation technology)是指利用顯微操作技術(shù)將一個細胞的細胞核移植到另一個細胞中，或者將兩個細胞的細胞核（或細胞質(zhì)）進行交換，從而可能創(chuàng)造無性雜交生物新品種的一項技術(shù)。 **細胞核移植技術(shù) 由于主要的遺傳物質(zhì)存在于細胞核中，因此，核移植的受體將具有與核移植供體完全相同的遺傳基礎(chǔ)，因此，細胞核移植技術(shù)在動物育種工作中具有十分重要的意義。 因為它像植物中的組織培養(yǎng)那樣，可以利用一頭優(yōu)質(zhì)的動物(例如高產(chǎn)的奶牛)復(fù)制出與它生得完全一樣的成千上萬的細胞核移植系動物。 細胞核移植技術(shù)是克隆技術(shù)的關(guān)鍵。 細胞核移植所得到的雜種稱為核質(zhì)雜種。 根據(jù)細胞核移植對象的不同可分為胚胎細胞核移植、體細胞核移植等。 開始時，進行細胞核移植主要是為了研究胚胎發(fā)育進程中細胞核和細胞質(zhì)功能及兩者之間的關(guān)系，探索有關(guān)遺傳、發(fā)育和細胞分化等方面的理論問題。后來發(fā)現(xiàn)，這項技術(shù)可以實現(xiàn)不同細胞核和細胞質(zhì)的組配，從而培育出新物種。 （二）發(fā)展歷史 1、提出思想 第一個提出對動物進行細胞核移植實驗的人是諾貝爾獎獲得者德國胚胎學(xué)家漢斯?施佩曼博士， 他構(gòu)想了一個“奇異的實驗”：把一個卵細胞的細胞核取出，然后把取自另一個發(fā)育到后期的胚胎的細胞核放入這個卵細胞中。 但由于技術(shù)等方面的原因使他沒能找到將細胞核導(dǎo)入卵細胞的方法。 2、建立技術(shù)及低等動物試驗 1952（美）羅伯特.布里格斯和T．J．金首先利用兩棲類卵細胞建立了細胞核移植技術(shù)。 3、高等動物試驗 經(jīng)過大量低等動物實驗之后，研究人員開始進行哺乳動物的移核試驗。最早用來作移核試驗的哺乳動物是小鼠。 1977（美）杰克遜實驗室用“亞無性繁殖”的方式，培育出7只單親小鼠。因為此種小鼠的體細胞中只有母體一方的染色體，故稱之為單親小鼠。 隨著技術(shù)發(fā)展，哺乳動物的細胞核移核實驗開始進入一個令人囑目的新階段。 1981，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)的卡爾?伊爾門澤和美國杰克遜實驗室的必得?霍普首次對小鼠卵進行移核試驗獲得成功。他們將囊胚內(nèi)細胞團細胞的核移入去核的受精卵中，經(jīng)培養(yǎng)移核卵發(fā)育到囊胚期、再將此胚胎植入同步孕小鼠的子宮內(nèi)，最后產(chǎn)下兩雌一雄仔鼠，并發(fā)育成了可育的個體。 我國的細胞核移植技術(shù)工作開始于20世紀(jì)50年代，主要是在兩棲類和魚類上進行的。 1961，童第周等以金魚和鳑被魚為材料，進行魚類不同亞科間的細胞核移植獲得成功，用以研究雜交細胞核與純種細胞核在發(fā)育功能上的差異以及細胞質(zhì)對細胞核的影響。 1980.4，中國科學(xué)院武漢水生生物研究所用鯽魚做移核試驗，成功培育出兩尾無性繁殖的幼魚。 1989，童第周、牛滿江將鯽魚胚胎細胞核移入鯉魚去核的未受精卵中，實現(xiàn)了不同種間的核質(zhì)雜交，成功地?zé)o性繁殖了“鯉鯽核魚”新品種，這個新品種的“鯉鯽核魚”既具有鯽魚的鮮美味道，又具有鯉魚的生長快速。 細胞核移植技術(shù) 2008，鯉鯽移核魚是采用無性雜交的細胞工程技術(shù)，將荷包紅鯉的囊胚細胞核移植到鯽魚的去核卵中而發(fā)育形成的后代。 其魚體呈紅色，外形特征與鯉魚相似，但也同時具有一些鯽魚的特征，具有比較穩(wěn)定的遺傳性狀。F1～F4代（1～4子代），基本性狀趨于一致。其生長速度明顯快于鯽魚，并且比荷包紅鯉快35％左右。 用鯉鯽移核魚F2雄性與鏡鯉雜交而獲得的雜交一代被稱為穎鯉。穎鯉具有明顯的生長優(yōu)勢，其生長速度比 雙親快42％左右。 4、限制條件 細胞核移植必須有一個前提，就是要盡量保證核供體和受體細胞處于同樣的細胞周期，高等細胞發(fā)展到一定階段時都要進行有絲分裂，而各種細胞的有絲分裂周期是各不相同的。 在哺乳動物核移植實驗中的核供體細胞和核受體細胞可能處在細胞周期的不同階段上?，F(xiàn)在可以通過采用“饑餓技術(shù)”來減慢細胞活動、迫使供體細胞處于某種休眠狀態(tài)，以期獲得與受體細胞同步的狀態(tài)，便于兩者的結(jié)合。 5、 我國在細胞核移植技術(shù)選育魚類新品種方面處于世界領(lǐng)先地位，以魚類細胞核移植為例，詳細介紹一下細胞核移植技術(shù)要點： (1)供體和受體的準(zhǔn)備 供體通常為魚類的囊胚細胞或成體細胞。 受體為成熟的卵細胞。該受體卵一般可通過人工催產(chǎn)的方法得到。卵子在接受供體核之前要先激活來獲得發(fā)育能力。 對于魚卵而言，當(dāng)它被擠入水中即可被激活。對于兩棲類動物的卵可采用針刺方法。最關(guān)鍵的是供體和受體在發(fā)育時間上要配合好，保證在受體成熟卵剛產(chǎn)出時,供體受精卵發(fā)育至囊胚期。 (2)去卵膜和卵核 可用小鑷子在解剖顯微鏡下仔細剝?nèi)ヂ涯?，或用適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌溉芤很浕涯?，?jīng)過輕輕晃動，使卵子從中脫出。 魚卵----極細的玻璃微針借助第二極體標(biāo)志(卵核位于極體下方)挑出細胞核。 兩棲類----紫外線照射受體卵達到去核目的。 (3)供體細胞制備 將發(fā)育至囊胚期的胚胎或組織器官進行機械切割，置于胰蛋白酶溶液中處理幾分鐘，直至分離出單個細胞。也可將囊胚細胞或得到的離體細胞短期培養(yǎng)后用作供體。 (4)移核 由于細胞核極小，而且脆弱，因此需要極其小心，防止損傷細胞核或傷害到細胞質(zhì)。 實際上核移植時，核周圍的少量細胞質(zhì)也一起注射進了去核后的受體細胞中了。30-40min中內(nèi)完成，溫度：16-18℃ （三）克隆動物一般制備技術(shù) 克隆可以通過不同來源的細胞核移植來實現(xiàn)，如胚胎細胞、干細胞、成纖維細胞、體細胞等。 其中以胚胎細胞克隆的應(yīng)用比較普遍，以體細胞克隆的意義最大。 1、移植細胞核的來源不同分為 胚胎細胞核移植法 胚胎干細胞核移植 胎兒成纖維細胞核移植 體細胞克隆技術(shù) （1）胚胎細胞核移植法 將未著床的早期胚胎分散成單個的細胞，在電流的作用下，使單個細胞與去除染色體的未受精的卵母細胞融合。發(fā)育成胚胎后，移入受體妊娠產(chǎn)仔。 原則上，一枚早期胚胎有多少個細胞，通過這種方法就可以克隆出多少個個體。還可將細胞反復(fù)克隆出更多的胚胎，產(chǎn)生更多克隆動物。 哺乳動物的胚胎細胞在分裂成8細胞以前，所有的單卵裂球均為全能細胞，即每個卵裂球均能表達此個體的全部基因。理論上這時的每個卵裂球經(jīng)過核移植，都能發(fā)育成遺傳性狀完全相同的個體。 這些工作為進一步研究細胞核和細胞質(zhì)的相互關(guān)系建立了很好的模型。 （2）胚胎干細胞核移植 將胚胎或胎兒的原始生殖細胞經(jīng)過抑制分代培養(yǎng)后，細胞數(shù)量增多，單細胞卻不分化。因此，每個細胞仍然具有細胞全能性而發(fā)育成個體的能力，這樣的細胞被稱為胚胎干細胞系。 再利用細胞核移植技術(shù)，可以比胚胎核移植生產(chǎn)出更多的動物個體。 目前僅有小鼠分離克隆出其胚胎干細胞系并成功克隆出成體鼠。 （3）胎兒成纖維細胞核移植 從妊娠早期胎兒分離出胎兒成纖維細胞，采用細胞核移植方法克隆出胚胎，經(jīng)移植受體后，妊娠產(chǎn)仔，克隆出動物個體。 （4）體細胞克隆技術(shù) 將動物體細胞經(jīng)過抑制培養(yǎng)，使其處于休眠狀態(tài)，利用細胞核移植技術(shù)將其導(dǎo)入去核卵母細胞，發(fā)育成胚胎后移植至受體，妊娠產(chǎn)仔，克隆出成體動物。 ******************************************************************************* 克隆羊多莉——培育過程： 克隆羊多利是由英國愛丁堡大學(xué)羅斯林學(xué)院 (Edinburgh’s Roslin Institute)的胚胎學(xué)家伊恩·威爾馬特 (Ian Wilmut)領(lǐng)導(dǎo)的科研小組從一只成年綿羊的乳腺細胞克隆出來的。 1. 取處于后三分之一妊娠期的6歲母綿羊的乳腺細胞作核供體細胞，用“饑餓法”時期進入休眠狀態(tài)而使全部基因具有活性。 2. 從蘇格蘭黑面母綿羊摘取卵細胞，通過手術(shù)去除其細胞核（DNA的載體）作為受體細胞。 3. 把白羊的乳腺細胞放入黑羊的已去除細胞核的卵細胞中，以一種弗蘭肯斯坦（Frankensfein）式的技巧，用電脈沖使這些細胞的膜不僅結(jié)合在一起，而且，兩個細胞即刻合而為一。 4. 將新的卵細胞植入羊的的結(jié)扎的輸卵管內(nèi)，6天后發(fā)育成桑椹期胚胎或囊胚，再移入假孕母羊子宮內(nèi)。 5. 產(chǎn)下多莉即為6歲母羊的復(fù)制品，也為白色。 **克隆動物成功與否的關(guān)鍵問題 首先是核移植過程中要分離得到供體細胞和作為受體細胞的卵細胞 。 其次要取處在適當(dāng)發(fā)育階段及細胞周期的受體和供體細胞，受體細胞和供體細胞處于細胞周期中的同一時期 ，核移植成功的幾率最大。 受體細胞在細胞周期中所處的時間對轉(zhuǎn)核實驗成功與否的影響要大于供體細胞所處的時間的影響，一般取G2期進行核移植的效果都較好。 另外，細胞誘導(dǎo)分裂成熟的因子（MPF）的活性有關(guān)。 ******************************************************************************* 7.2.4 克隆技術(shù)的應(yīng)用與意義 能使異種動物借腹妊娠、產(chǎn)仔，加快珍稀動物繁殖，搶救瀕危動物(如大熊貓)； 建立重要疾病的基因模型，生產(chǎn)生物活性藥物。 為了解細胞發(fā)育的潛能性、細胞核和細胞質(zhì)之間相互關(guān)系、胚胎發(fā)生死亡及其調(diào)控研究提供了新視角，因此對揭示生命科學(xué)重大基礎(chǔ)理論問題具有重要的科學(xué)價值。 動物克隆近幾年取得的一些突破性進展，為動物發(fā)育過程中基因表達的調(diào)控及發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展必將產(chǎn)生深遠的影響。盡管目前這種方法尚不成熟，但它已顯示出誘人的應(yīng)用的前景。 1、檢驗動物細胞的全能性 在多莉羊誕生之前，普遍認為低等生物和高等植物的細胞具有全能性，而高等動物的體細胞沒有全能性。 目前克隆技術(shù)取得的結(jié)果，為再生、修復(fù)、治療組織器官缺損等奠定了理論基礎(chǔ)，也增加了采用高度分化的體細胞克隆各種動物的信心。 2、加速動物繁殖、優(yōu)良育種、保護珍貴動物 由于體細胞數(shù)量巨大和易于獲得，因此動物克隆技術(shù)有助于加速動物育種的進程。 利用優(yōu)良動物品種的體細胞作核供體克隆動物，可以避免自然條件下選種所受到的動物生育周期和生育效率的限制，從而大大縮短育種年限，提高育種效率。（大熊貓交配的季節(jié)在春季三至五月份，通常不超過2－4天。 ） 也可以結(jié)合基因工程技術(shù)將具有特殊功能的基因(如具有一些經(jīng)濟性狀、抗蟲、抗病等)導(dǎo)入體細胞，然后用克隆技術(shù)培育出人們希望的動物新品種。 2001.4，一種具有極高科學(xué)價值的商品—利用克隆技術(shù)培育的金魚由美國一家基因復(fù)制公司投放市場，這標(biāo)志著克隆動物已經(jīng)開始了商業(yè)化歷程。 3、克隆瀕危物種 2002年4月27日,中國農(nóng)業(yè)大學(xué)成功克隆了第一頭優(yōu)質(zhì)中國黃牛, 這標(biāo)志著中國在動物體細胞克隆領(lǐng)域取得了重要進展。這頭名為“波娃”的體細胞克隆中國黃牛所使用的核供體細胞來源于一頭不足六個月的冀南牛純種小母牛的耳朵皮膚組織,而使用的卵母細胞取自于屠宰場宰殺后的母牛卵巢?！安ㄍ蕖迸c其供體細胞的遺傳物質(zhì)完全相同,而與其代孕母親———荷斯坦奶牛在遺傳上分屬不同來源。該次克隆成功屬國際首次,此次克隆中國優(yōu)質(zhì)黃牛的成功使目前挽救瀕臨滅絕的優(yōu)良黃牛品種成為可能。 4、克隆寵物 2004年8月6日美聯(lián)社報道:美國加州“遺傳儲存與克隆”公司近日正式宣布,他們成功地培育出了世界上首對克隆寵物貓,今后,他們將在世界范圍內(nèi)推廣寵物克隆業(yè)務(wù),需要交納5萬美元的“克隆費”,你家的寵物就可以有個一模一樣的伙伴了。 5、醫(yī)藥領(lǐng)域 由于克隆動物的遺傳背景相同，因此它們是模擬疾病、基因治療、器官移植等研究的良好實驗材料，具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。 利用克隆技術(shù)，可以用患者本人細胞培育出新組織，用來治療糖尿病、帕金森氏癥、神經(jīng)損傷等多種疾病。用這種方法培育出的組織不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，具有與患者正常組織完全相同的基因構(gòu)成。 隨著人類胚胎干細胞培養(yǎng)技術(shù)的完善，科學(xué)家已開始研究利用克隆技術(shù)培育人胚胎，希望大批量生產(chǎn)治療疾病的干細胞 。 移植器官來源不足是各國存在的普遍問題，所以人們開始致力于異種器官移植和克隆器官移植的研究。利用克隆動物的胚胎干細胞作異源移植，以解決人類移植器官供求矛盾。 目前我國的年器官移植數(shù)量已經(jīng)位居世界第二，其種類和成功率也都達到或接近國際先進水平。 但還存在著基礎(chǔ)研究薄弱、研究體系分散和社會捐獻活體器官意識不強、數(shù)量較低以及相應(yīng)立法不完備等問題。 未來人類器官移植治療將集中在人對人的同體器官移植、動物對人的異體器官移植和克隆人體器官移植等方面。 其中克隆人體器官更具有光明的前景，將解決一系列移植方面的關(guān)鍵問題，不過目前其實際運用還為時過早，因為雖然現(xiàn)在可以復(fù)制具有機械功能的臟器，但如何還原其生化作用還有待于探索。 7.2.5 正確看待克隆技術(shù) 1、技術(shù)尚不成熟 現(xiàn)階段克隆動物等技術(shù)尚不成熟，還處于探索階段。目前所得到的克隆動物具有極大的偶然性和隨機性。迄今為止，克隆試驗的成功率始終很低。（在培育多莉的過程中，科學(xué)家共克隆出277個綿羊胚胎，最終成功使母羊受孕并生產(chǎn)的只有多莉一個。此外，克隆動物夭折率高，不少克隆動物天生患有疾病或體形過大。） 2、克隆動物的體細胞突變、壽命及其他遺傳問題 基因突變與DNA復(fù)制次數(shù)緊密相關(guān)。分裂越多的體細胞發(fā)生突變的可能性就越大，這與通過克隆迅速獲得大量動物個體的目的相矛盾，是克隆動物材料來源不可避免的問題。 同時，由于克隆是無性繁殖，克隆動物沒有遺傳物質(zhì)的交流和互補，將會加劇一些遺傳疾病的發(fā)生。 此外，出于體細胞分裂代數(shù)是有限的，因此克隆動物的壽命是否會受到體細胞分裂代數(shù)的影響，也尚不清楚。 2002年1月， “多莉”被診斷患有嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎，這是科學(xué)家對克隆生命的前景表示出擔(dān)擾。 綿羊的平均壽命為為13年，多莉5歲半就患關(guān)節(jié)炎顯然過早。 在多莉誕生后的3年多時間內(nèi)，已獲得了許多成活的體細胞克隆動物。但是，在大多數(shù)研究中，都出現(xiàn)了高頻率的出生體重增加，以及胎兒或新生兒的死亡。因此、就目前的研究來看，動物克隆技術(shù)要實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化是非常困難的。 3、是否是完全的“復(fù)制” 就遺傳的角度而言。克隆動物的性狀可能與其來源的親本完全相同，但是至少以下一些因素會影響克隆動物的遺傳性狀： (1)細胞突變 (2)受體卵細胞的細胞膜和細胞質(zhì)差異 (3)受體遺傳上或生理上的差異 (4)后期生長的環(huán)境與馴化 大多數(shù)人認為，克隆是復(fù)制的同義詞，復(fù)制品與原件是完全一樣的。DNA的復(fù)制結(jié)果就是如此，所以復(fù)制用于DNA的合成是一個非常確切的術(shù)語。 克隆則是一個過程，克隆產(chǎn)生的個體還需進行胚胎發(fā)育和胎后發(fā)育，克隆個體與原件之間有一段年齡差異。由于發(fā)育過程既受基因主宰又受環(huán)境調(diào)控，而克隆與其原本盡管基因相同，所處環(huán)境卻絕不會相同，所以，克隆與其原本不可能像復(fù)制品與原件那樣完全一樣的。 再者，雖然克隆個體是由核移植產(chǎn)生的，但由于重建細胞的細胞質(zhì)并非來自原本，而我們知道細胞質(zhì)中也有遺傳物質(zhì)，它們必然會對個體產(chǎn)生影響，所以不能把克隆個體看成是原本的復(fù)制品。 盡管從遺傳結(jié)構(gòu)上看克隆個體和原本是姐妹(兄弟)關(guān)系，但從年齡上看它們卻是親子關(guān)系。無性繁殖的生物仍然有”代”的概念，克隆個體也應(yīng)有”代”的概念。 而且，克隆個體和原本是可以同時存在。因此，準(zhǔn)確地說，克隆個體可以看成是原本的再生，但不是原本的復(fù)活。 4、克隆動物可應(yīng)用型的思考 有性生殖是生物在長期進化過程中的自我選擇、適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果，是一種有利于種族繁衍和生存的生殖方式。 從這個角度來講，用克隆動物繁殖生物可能給生物的生存和自然界帶來意想不到的后果，同時，最關(guān)鍵的是，這種繁殖方式會造成基因的丟失，不利于遺傳物質(zhì)和生物多樣性的保護。于是，有學(xué)者認為，克隆動物是違反生物進化規(guī)律的，是一種倒退。 5、總之，克隆技術(shù)的低效率以及克隆動物后代出現(xiàn)的體重增加、體弱多病等事實，使得單獨的克隆技術(shù)在近期內(nèi)難以得到推廣應(yīng)用。在克隆技術(shù)還不成熟的今天，人類要克隆出健康的動物是相當(dāng)困難的，克隆技術(shù)在實踐中真正應(yīng)用還有相當(dāng)長的路要走。 **克隆人問題 克隆不能產(chǎn)生相同的人 人類克隆自己是不道德的 許多國家都立法禁止克隆人 “科學(xué)是一柄雙刃劍”，如果有人利用克隆技術(shù)來克隆人，那會給人類帶來無窮的災(zāi)難。