《紅腺忍冬組培快繁技術(shù)規(guī)程》征求意見(jiàn)稿編制說(shuō)明

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1 廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《 紅腺忍冬組培快繁技術(shù)規(guī)程 》 （征求意見(jiàn)稿）編制說(shuō)明 一、 工作簡(jiǎn)況 （一）任務(wù)來(lái)源 本標(biāo)準(zhǔn)是廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局下達(dá)的 2016 年 第 六 批廣西地方標(biāo) 準(zhǔn)制定（修訂）項(xiàng)目計(jì)劃 （桂質(zhì)監(jiān)函 [2016] 324 號(hào)文） ，項(xiàng)目編號(hào)為 2016由廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)提出，廣西衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口，廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 負(fù)責(zé) 起草。 （二）參與起草單位 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 。 （三）主要起草人員名單及職務(wù)或職稱 二、編制標(biāo)準(zhǔn)意義 紅腺忍冬（ ，是《中國(guó)藥典》山銀花的來(lái)源植物之一，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒，熱毒血痢，風(fēng)熱感冒，溫?zé)岚l(fā)病。紅腺忍冬為廣西地理標(biāo)志性物 種，開(kāi)發(fā)潛力巨大，其主根粗壯， 毛細(xì)根研 制 人 員 姓名 職務(wù) /職稱 現(xiàn)從事專業(yè) 所在單位 項(xiàng) 目 負(fù)責(zé)人 師鳳華 副研究員 生物技術(shù) 廣西藥用植物園 主 要 參 加 人 員 譚木秀 研究 實(shí)習(xí) 員 生物技術(shù) 廣西藥用植物園 蒲祖寧 主任技師 種質(zhì)資源保存 廣西藥用植物園 郭曉云 副研究員 生物技術(shù) 廣西藥用植物園 李翠 助理研究員 生理生化 廣西藥用植物園 2 密如蛛網(wǎng)，枝條多，萌蘗能力強(qiáng)，具有良好的蓄水保土效益，對(duì) 喀斯特地貌的恢復(fù)具有重要意義。 但近年來(lái)紅腺忍冬野生資源數(shù)量迅速減少，難以滿足需求，需加快發(fā)展人工種植。而種子繁殖和枝條扦插成活率均不高，因此有必要通過(guò)建立起完整、高效、實(shí)用的紅腺忍冬組培快繁技術(shù)體系，加快繁殖速度，提高繁殖系數(shù)，為推廣紅腺忍冬組織培養(yǎng)苗優(yōu)良種質(zhì)大面積生產(chǎn)提供技術(shù)參考。 經(jīng)查閱《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)批準(zhǔn)發(fā)布公告》、《中華人民共和國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)備案公告》和《中華人民共和國(guó)地方標(biāo)準(zhǔn)備案公告》， 紅腺忍冬組培快 繁技術(shù) 尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或地方標(biāo)準(zhǔn)，因此，特進(jìn)行 紅腺忍冬組培快繁 技術(shù)研究并據(jù)此制定 紅腺忍冬組培快繁技術(shù) 規(guī)程。 三、標(biāo)準(zhǔn)編制起草及研究過(guò)程 （一）前期 準(zhǔn)備 工作 2012 年至 2015 年，在廣西壯族自治區(qū)科技廳課題 “ 金銀花木犀草苷生物合成相關(guān)基因克隆和轉(zhuǎn)化山銀花的研究 ” （項(xiàng)目任務(wù)書(shū)編號(hào)： 2012資助下，完成了山銀花的生態(tài)環(huán)境條件調(diào)查，開(kāi)展了金銀花黃酮類生物合成途徑關(guān)鍵酶 和黃酮類化合物合成的影響研究、遺傳轉(zhuǎn)化體系研究等，在此基礎(chǔ)上，標(biāo)準(zhǔn)編制小組成員至今已完成 山銀花紅 腺忍冬種子發(fā)芽條件、 種子實(shí)生苗滅菌方法、培養(yǎng)基組分、激素水平、培養(yǎng)條件 、 不同組織芽誘導(dǎo)、 增殖繼代、芽誘導(dǎo)及 生根壯苗 等較優(yōu)的初代誘導(dǎo)技術(shù)方案等研究工作，基本掌握紅腺忍冬組培快繁技術(shù)，在核心期刊上發(fā)表相關(guān)文章1 篇： 紅腺忍冬種子沙培萌發(fā)條件和種子沙培苗滅菌方法的初步研究 [J]2015,38(5):899已申請(qǐng)相關(guān)專利 3 項(xiàng)：《紅腺忍冬無(wú)菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導(dǎo)的方法（ （ 2016 年 4 月 29 日已發(fā)受權(quán)通知書(shū)）、《一種華南忍冬葉片不定芽的誘導(dǎo)方法（ （已進(jìn)入答辯階段），《紅腺忍冬無(wú)菌組培苗葉柄不定芽誘導(dǎo)的方法（ 2015122400745570》已受理；為本標(biāo)準(zhǔn)的 制定實(shí)施奠 定了良好基礎(chǔ)。 （二 ）標(biāo)準(zhǔn) 編制起草 進(jìn)度 1、 2016 年 1 月，收到廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局為貫徹落實(shí)《廣西壯族自治區(qū)人民政府關(guān)于印發(fā)深化標(biāo)準(zhǔn)工作改革實(shí)施方案的通知》（桂政發(fā) [2015]51 號(hào)）精神而下達(dá)關(guān)于征集 2016 年廣西地方標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃項(xiàng)目的通知。 3 2、 2016 年 3 月，廣西壯族自治區(qū)藥用植物園向廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局遞交了制定廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《紅腺忍冬組培快繁技術(shù) 規(guī)程》的建議書(shū)和申請(qǐng)書(shū)。 3、 2016 年 5 月，廣西壯族自治區(qū)藥用植物園成立了以師鳳華為組長(zhǎng)，譚木秀、蒲祖寧、郭曉云、李翠等 5 人組成的標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組，該小組在前期研究工作的基礎(chǔ)上，對(duì) 紅腺忍冬組培快繁 關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)和集成，同時(shí)查閱了大量的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，確定了廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《紅腺忍冬組培快繁技術(shù)規(guī)程》的主要技術(shù)核心內(nèi)容，形成了標(biāo)準(zhǔn)的基本構(gòu)架。 4、 2016 年 6 月，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組的充分討論及多次修改完善，最終完成了廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《紅腺忍冬組培快繁技術(shù)規(guī)程（征求意見(jiàn)稿）》。 （三 ）標(biāo)準(zhǔn)研究過(guò)程 標(biāo)準(zhǔn)編制 小組成員多年從事 遺傳轉(zhuǎn)化及組培快繁 工作并熟練掌握其 技術(shù)， 成功 申請(qǐng)到 紅腺忍冬 相關(guān)項(xiàng)目并 做出一定的成績(jī) ， 經(jīng) 前期試驗(yàn) 已 成功 誘導(dǎo) 出 紅腺忍冬無(wú)菌 組培苗， 具備 一定的 工作基礎(chǔ)。 標(biāo)準(zhǔn)編制項(xiàng)目下達(dá)后，按照廣西區(qū)質(zhì)監(jiān)局關(guān)于編制標(biāo)準(zhǔn)工作的要求， 標(biāo)準(zhǔn) 編制小組 依照標(biāo)準(zhǔn)主題、要求對(duì)材料進(jìn)行整理、收集和調(diào)研。 根據(jù)各 人研究方向進(jìn)行分工 合作 ，開(kāi)展 紅腺忍冬 資源的調(diào)查和采集 ， 針對(duì)試驗(yàn)中出現(xiàn)的 紅腺忍冬帶腋芽莖段誘導(dǎo)無(wú)菌組培苗 難，及此初代誘導(dǎo)苗不易進(jìn)行繼代 培養(yǎng) 、 組培苗繁殖系數(shù)低、易褐化、 易 死亡等問(wèn)題 ， 在 不斷 試驗(yàn)的同時(shí)咨詢了 相關(guān) 同行專家，反復(fù) 思考總結(jié) 、多方位 進(jìn)行試驗(yàn)篩選 ，確保標(biāo)準(zhǔn) 數(shù)據(jù) 準(zhǔn)確 可靠性。 標(biāo)準(zhǔn)研究的試驗(yàn)材料 來(lái) 自廣西 馬山 縣 弄拉 景區(qū)的 紅腺忍冬成熟漿果 ， 撥取其中成熟飽滿的種子進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)，獲取種子實(shí)生苗，對(duì) 此實(shí)生苗進(jìn)行外植體滅菌處理獲得無(wú)菌組培苗，進(jìn)一步 進(jìn)行 相關(guān) 篩選 試驗(yàn)獲 得 不同組織 外植體 芽誘導(dǎo)、增殖 繼代 及生根 壯苗 的較佳試驗(yàn)方案 ，建立 起 紅腺忍冬 組培苗快速繁殖技術(shù)體系。 四、標(biāo)準(zhǔn)編制原則、依據(jù) （一）制定本標(biāo)準(zhǔn)的目的是 規(guī)范 紅腺忍冬 組培苗 組培快繁 技術(shù)、 拓寬組培苗誘導(dǎo)來(lái)源、 提高 組培苗 繁殖系數(shù) 質(zhì)量 ， 實(shí)現(xiàn) 紅腺忍冬 組培苗 組培快繁 標(biāo)準(zhǔn)化。 （二）本標(biāo)準(zhǔn)的格式和編 寫(xiě)方法執(zhí)行 規(guī)定。 （三）本標(biāo)準(zhǔn)的制定力求科學(xué)、準(zhǔn)確、系統(tǒng)，內(nèi)容與當(dāng)前廣西 紅腺忍冬組培快繁 的實(shí)際和社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況緊密結(jié)合，可操作性強(qiáng)。 （四）本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了 紅腺忍冬 組培 快繁的術(shù)語(yǔ)和定義、取材與處理、 外植體不定 芽 4 誘導(dǎo) 、 繼代 增殖、生根壯苗、培養(yǎng)條件、信息記錄 。適用于組培苗生產(chǎn)公司和企業(yè)通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范化生產(chǎn) 紅腺忍冬無(wú)菌 組培苗。 （五）本標(biāo)準(zhǔn)的編寫(xiě)以 廣西壯族自治區(qū)科技廳課題 “ 金銀花木犀草苷生物合成相關(guān)基因克隆和轉(zhuǎn)化山銀花的研究 ” （項(xiàng)目任務(wù)書(shū)編號(hào)： 2012為研 究基礎(chǔ)， 紅腺忍冬 組 織 培 養(yǎng)技術(shù)相關(guān) 試驗(yàn) 數(shù)據(jù)為基本 參考 依據(jù) 進(jìn)行 編制 。 五、標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容 的確定 （一）范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了紅腺忍冬（ 組培快繁的 術(shù)語(yǔ)和定義、取材與處理、外植體不定芽誘導(dǎo)、繼代增殖、生根壯苗、培養(yǎng)條件、信息記錄。 （二）規(guī)范性引用文件 下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用必不可少。凡是注明日期的引用文獻(xiàn)，僅所注日期的版本適用于本文件；凡是不注明日期的引用文件，以其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 無(wú) （三）主要技術(shù)內(nèi)容 1、材料與方法 材料 ： 廣西 馬山縣 中國(guó) 弄拉景區(qū)的紅腺忍冬成熟漿果 。 方法： （ 1）不同處理方式對(duì)紅腺忍冬種子發(fā)芽的影響 將當(dāng)年 10 月底 11 月初采 集 的成熟漿果 一半直接將種子剝出進(jìn)行播種，另一半漿果經(jīng) 4 ℃ 低溫貯藏 5 d 后 將 種子 剝出 ，經(jīng)發(fā)芽處理后進(jìn)行播種，播種后均覆蓋一層 0.3 0 目篩的細(xì)河砂。種子的發(fā)芽處理如下：不浸泡 ， 清水浸泡 24 h， 自來(lái)水流水沖洗 24 h， 200 泡 24 h， 400 泡 24 h。 每一處理設(shè) 3 次重復(fù)，每一重復(fù)播種 50 粒種子， 每 天觀察并統(tǒng)計(jì)各處理種子發(fā)芽等相關(guān)情況。 種子發(fā) 芽能力指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)：萌發(fā) 以胚軸突破種皮為準(zhǔn)，此時(shí)即為初次計(jì)數(shù)時(shí)間。自發(fā)芽開(kāi)始之日起，每 天記錄萌發(fā)的正常幼苗數(shù)，挑出霉變種子，至無(wú)新萌發(fā)種子的天數(shù)為末次計(jì)數(shù)時(shí)間。以萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間、萌發(fā)結(jié)束時(shí)間、萌芽持續(xù)時(shí)間、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)作為種子萌發(fā)試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)，具體算法如下： 萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間：從播 種之日起至開(kāi)始萌發(fā)之日所經(jīng)歷的天數(shù)。 5 萌發(fā)結(jié)束時(shí)間：從播 種之日起，經(jīng)過(guò)萌發(fā)期，至無(wú)新萌發(fā)種子 時(shí) 所經(jīng)歷的天數(shù)。 萌芽持續(xù)天數(shù)：從種子開(kāi)始萌發(fā)之日起，至萌發(fā)結(jié)束之日，之間所經(jīng)歷的天數(shù)。 發(fā)芽率（ =（ n/N） ×100%（ n 為最終發(fā)芽數(shù)， N 為供試種子數(shù)）。 發(fā)芽勢(shì)（ =（ ） ×100%（ i 天種子發(fā)芽達(dá)到高峰時(shí)正常發(fā)芽的種子數(shù)，N 為供試種子數(shù)）。 （ 2）種子 實(shí)生 苗消毒滅菌處理 具 3 片以上真葉的種子實(shí)生苗 經(jīng)過(guò)消毒滅菌 處理 后轉(zhuǎn)接入培養(yǎng)基 1/2糖 30 g/L+瓊脂 6g/L +（ ） 中培養(yǎng) 。 消毒滅菌 設(shè) 6 個(gè)處理，每一處理 設(shè) 3 次重復(fù)，每一重復(fù) 接種 3 瓶，每瓶接種 2 株 ， 7d 后統(tǒng)計(jì)污染率和成活率等相關(guān)數(shù)據(jù)。 處理見(jiàn)表 1。 表 1 不同滅菌方法對(duì)紅腺忍冬種子實(shí)生 苗滅菌效果的影響 前處理方式 滅菌劑種類及 滅菌時(shí)間 75%酒精 (S)+苗原培養(yǎng)條件 滅菌方式 于超凈臺(tái)上直接用無(wú)菌水沖洗 0+ 0 密閉培養(yǎng)瓶中 連根整株取出，不滅菌，連根轉(zhuǎn)接 30+ 5 密閉培養(yǎng)瓶中 連根整株取出，僅對(duì)下胚軸以下部分進(jìn)行滅菌，連根轉(zhuǎn)接 30+ 5 密閉培養(yǎng)瓶中 連根整株取出，整株全部滅菌，連根轉(zhuǎn)接 30+ 5 密閉培養(yǎng)瓶中 棄根，整體滅菌，整體轉(zhuǎn)接 洗潔精水刷洗 30+5 密閉培養(yǎng)瓶中 棄根，整體滅菌，整體轉(zhuǎn)接 30+ 5 開(kāi)放花盆中 棄根，整體滅菌，整體轉(zhuǎn)接 （ 3） 不同種類細(xì)胞分裂素對(duì)紅腺忍冬不同部位愈傷組織誘導(dǎo)及成芽的影響 以苗齡為 40 生長(zhǎng)健壯的 無(wú)菌 組培 生根苗的葉片、葉柄及 無(wú)芽 莖段三部位 為材料， 以 糖 30g/L+瓊脂 6g/L+ 為基本培養(yǎng)基，分別添加 、、 、 ， 共 12 個(gè)處理，每一處理 設(shè) 3 次重復(fù)，每一重復(fù) 接種 3 瓶，每瓶接種 8 個(gè)外植體，每周觀察一次 ， 于接種后起第 30 天、 60 天及 90天統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。 （ 4） 繼代 增殖培養(yǎng) 試驗(yàn)一：不同濃度 6紅腺忍冬芽增殖 繼代及節(jié)間伸長(zhǎng)的影響 以苗齡為 40 生長(zhǎng)健壯的 無(wú)菌組培 生根 苗芽為材料， 以 糖 30g/L+瓊脂6g/L+ 為基本培養(yǎng)基，分別添加 60、 ， 6 另設(shè) 糖 30g/L+瓊脂 6g/L+ 6 + 為平行對(duì)照 ； 每一處理 設(shè) 3 次重復(fù)，每一重復(fù) 接種 3 瓶，每瓶接種 2 株芽苗 ， 于接種后 第 30 天、 60 天及 90 天統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。 試 驗(yàn)二 ：不同濃度 紅腺忍冬無(wú)菌苗繼代增殖及節(jié)間伸長(zhǎng)的影響 以苗齡為 40 生長(zhǎng)健壯的 無(wú)菌組培 生根 苗芽為 材料， 以 糖 30g/L+瓊脂6g/L++6 為基本培養(yǎng)基，分別添加 0、 ，共 9 個(gè)處理 ， 每一處理 設(shè) 3 次重復(fù)，每一重復(fù) 接種 3 瓶，每瓶接種 2 株芽苗 ， 于接種后 第 30 天、 60 天及 90 天統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。 （ 5）不同種類生長(zhǎng)素對(duì)不同來(lái)源材料的紅腺忍冬生根壯苗的影響 以苗齡為 40 生長(zhǎng)健壯的 無(wú)菌組培 生根 苗芽為 材料， 以 1/2糖 30g/L +瓊脂 6g/L 為基本培養(yǎng)基，分別添加 、 、 ， 未 添加生長(zhǎng)素的組合為對(duì)照，同時(shí)以從帶腋芽莖段為外植體誘導(dǎo)出的初代無(wú)菌誘導(dǎo)苗接入 處理為平行對(duì)照， 共 5 個(gè)處理， 每一處理 設(shè) 3 次重復(fù)，每一重復(fù) 接種 3 瓶，每瓶接種 2株芽苗 ， 于接種第 30d 及第 60d 時(shí)統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。 2、結(jié)果與分析 （ 1）不同處理方式對(duì)紅腺忍冬種子發(fā)芽的影響 由 下表 2 可 知 ， 不同處理方對(duì)紅腺忍冬種子的萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間、萌發(fā)結(jié)束時(shí)間、發(fā)芽持續(xù)時(shí)間、發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)的影響程度均不同。 低溫處理的種子平均發(fā) 芽率及平均發(fā)芽勢(shì)優(yōu)于未經(jīng)低溫 的 處理， 并且 種子發(fā)芽持續(xù)時(shí)間 縮短 ； 溶液浸 泡的處理 種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)均高于其它處理，發(fā)芽持續(xù)時(shí)間縮短明顯 ， 以處理 00 浸泡的平均發(fā)芽率和平均發(fā)芽勢(shì)最 高， 發(fā)芽早，發(fā)芽持續(xù)時(shí)間短 ； 是否經(jīng)過(guò) 清水浸泡或流水沖洗對(duì)種子平均發(fā)芽率的影響不大 ，但 流水沖洗 能縮短 種子發(fā)芽持續(xù)時(shí)間 。 綜合可知，以溶液 對(duì) 經(jīng) 4℃ 低溫 儲(chǔ)藏 5 子 浸泡 24 子發(fā)芽 的較佳 處理 。 表 2 不同處理方式對(duì)紅腺忍冬種子發(fā)芽 的影響 處理方式 萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間 / d 萌發(fā)結(jié)束時(shí) 間 / d 發(fā)芽持續(xù)時(shí)間 / d 平均發(fā)芽率 / % 平均發(fā)芽勢(shì) / % 未經(jīng) 4℃ 儲(chǔ)藏 不浸泡 4℃ 低 溫 儲(chǔ) 不浸泡 7 藏 5d 自來(lái)水流水沖洗 24h 浸泡 24h 00 浸泡 24h 00 浸泡 24h 2）不同滅菌方法對(duì)紅腺忍冬種子實(shí)生苗滅菌效果的影響 由 下 表 3 可知， 6 個(gè)處理的種子 實(shí)生 苗成活率均為 100%，但不同滅菌方式對(duì)紅腺忍冬種子沙培 實(shí)生 苗滅菌效果差異顯著： 經(jīng) 洗潔精水刷洗 ；棄根轉(zhuǎn)接的效果優(yōu)于連根轉(zhuǎn)接， 經(jīng) 開(kāi)放式沙基培養(yǎng) 的實(shí)生苗外植體轉(zhuǎn)接的平均污染率和苗生長(zhǎng)狀況均 優(yōu)于封閉式的沙基培養(yǎng)。 由此可 知 ，對(duì)開(kāi)放沙基培養(yǎng)的 實(shí)生 種子 苗下胚軸以上部分用洗潔精水刷洗 沖洗之后進(jìn)行 75%酒精 (30 S)+ 菌處理的滅菌效果最好。 表 3 不同滅菌方法對(duì)紅腺忍冬種子沙培苗滅菌效果的影響 清潔 方式 滅菌及轉(zhuǎn)接 方式 平均污染率 / % 平均成活率 / % 苗生長(zhǎng)狀況 于超凈臺(tái)上直接用無(wú)菌水沖洗 連根整株取出，不滅菌，連根轉(zhuǎn)接 連根整株取出，僅對(duì)下胚軸以下部分進(jìn)行滅菌，連根轉(zhuǎn)接 連根整株取出，整株全部滅菌，連根轉(zhuǎn)接 棄根，整體滅菌，整體轉(zhuǎn)接 + 洗潔精水刷洗 棄根，整體滅菌，整體轉(zhuǎn)接 + 棄根，整體滅菌，整體轉(zhuǎn)接 ++ 注：同列不同小寫(xiě)字母表示有顯著性差異， P﹤ 列不同大寫(xiě)字母表示有極顯著性差異，P﹤ -：差； +：好； ++：較好； +++：最好 （ 3） 不同種類細(xì)胞分裂素對(duì)紅腺忍冬 不同部位愈傷組織 誘導(dǎo)及 成芽的影響 據(jù)下表 4 可知， 愈傷組織誘導(dǎo)效果： 、 、 、 4 種細(xì)胞分裂素中均可將 紅腺忍冬葉片、葉柄及無(wú)腋芽莖段 3 種外植體 誘導(dǎo)出愈傷組織 ； 在細(xì)胞分裂素 、 及 3 個(gè)處理中 ， 3種外植體 愈傷組織 誘導(dǎo)率 均 為：無(wú)腋芽莖段＞葉柄＞ 葉片 ， 在 L 處理 ：葉片＞無(wú)腋芽莖段 ＞ 葉柄 ； 就同一部位 不同細(xì)胞分裂素 而言 ， 各 部位 愈傷組織誘導(dǎo)率高低為 8 （以 3 次統(tǒng)計(jì)的平均數(shù) 為依據(jù) ） ：葉片： 柄和無(wú)腋芽莖段均為： 愈傷 組織 不定芽誘導(dǎo) 效果： 除 ，其它 3 種細(xì)胞分裂素 能誘導(dǎo)出不定芽。 3 種細(xì)胞分裂素對(duì) 3 部位不定芽誘導(dǎo)率高低及芽質(zhì)量效果均為： 及 2 個(gè)處理 均能將 這 3 種外植體 誘導(dǎo)出不定芽 ， 且這 3 部位誘導(dǎo)率大小 及芽質(zhì)量 高低 均為無(wú)腋芽莖段＞葉柄＞葉片 ； 3 部位 在各 時(shí)期 芽誘導(dǎo)率均 表現(xiàn) 為 處理只能將葉片和無(wú)腋芽莖段 導(dǎo)出不定芽 ， 其中葉片 的芽 誘導(dǎo)率 較高 。 另外， 葉片、葉柄及不帶芽莖段 3 部位在 4 種培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的愈組均為顆粒狀、質(zhì)地硬、無(wú)水漬；愈傷組織顏色變化趨勢(shì)均隨著培養(yǎng)時(shí)間遞增而呈米白色 深綠色 褐化現(xiàn)象。 綜合可 見(jiàn) ， 愈傷組織誘導(dǎo)效果：優(yōu)選組合為：無(wú)腋芽莖段在培養(yǎng)基 糖 30g/L+瓊脂 6g/L++ 中的 愈傷組織 誘導(dǎo)效果最佳 ，培養(yǎng)至第 30d 時(shí)，誘導(dǎo)率高達(dá) 培養(yǎng)至第 90d 時(shí)，愈傷組織直徑達(dá) 不定芽誘導(dǎo)效果：以無(wú) 腋芽 莖段 在培養(yǎng)基 糖 30g/L+瓊脂 6g/L++ 中的 不定芽誘導(dǎo) 效果最佳 ，培養(yǎng)至第 60d 時(shí)，平均芽數(shù)達(dá) 質(zhì)量最佳 ， 培養(yǎng)至第 90d 時(shí)， 不定芽誘導(dǎo)率 可 達(dá) 表 4 不同種類細(xì)胞分裂素對(duì)紅腺忍冬不同部位愈傷組織誘導(dǎo)及成芽的影響 培養(yǎng)基種類及濃度（ ） 接種部位及接種量（個(gè)） 培養(yǎng)天數(shù)（ d） 出愈率（ %） 成活率（ %） 愈組大小Φ(芽誘導(dǎo)率（ %） 總芽數(shù)（個(gè)） 平均芽數(shù) 芽質(zhì)量 片 30 60 90 葉柄 30 60 90 ++ 無(wú)腋芽莖段 30 60 + 90 + 片 30 60 + 9 90 ++ 葉柄 30 60 + 90 ++ 無(wú)腋芽莖段 30 60 ++ 90 ++ 片 30 60 90 葉柄 30 60 90 無(wú)腋芽莖段 30 60 90 片 30 60 90 葉柄 30 60 90 無(wú)腋芽莖段 30 60 ++ 90 ++ 注：平均芽數(shù) =芽總數(shù)（個(gè)） /出芽的外植體總數(shù)（個(gè)） ；芽質(zhì)量： +：一般， ++：較好， +++：最佳 （ 4）繼代增殖培養(yǎng) 試驗(yàn)一：不同濃度 6紅腺忍冬芽增殖繼代及節(jié)間伸長(zhǎng)的影響 據(jù)下表 5 可知， 同一處理中，隨著 培養(yǎng) 時(shí)間的增加，芽增殖倍數(shù)、芽平均高度、芽節(jié)間長(zhǎng)度及芽平均葉片數(shù)均呈逐漸上升趨勢(shì)， 接種后第 30d、 60d、和 90d 這 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示， 芽增殖倍數(shù)均以處理 + 6 最高，分別為： 及 ；對(duì) 芽平均高度、芽節(jié)間平均長(zhǎng)度及芽平均葉片數(shù)誘導(dǎo)較好的處理為 + 6 及 + 6 ， 6 的處 10 理 芽健壯度最佳； 的 芽增殖誘導(dǎo)及芽高度有明顯的促進(jìn)作用。 表 5 不同濃度 6紅腺忍冬芽增殖繼代及節(jié)間伸長(zhǎng)的影響 ) 6) 培養(yǎng)時(shí)間（ d） 芽增殖倍數(shù)（ t） 芽平均高度 (芽節(jié)間平均長(zhǎng)度（ 芽平均葉片數(shù) (p) 顏色 健壯度 30 綠 + 60 + 90 綠 ++ 0 1． 40 綠 + 60 + 90 ++ 0 綠 + 60 綠 ++ 90 ++ 0 綠 ++ 60 綠 ++ 90 綠 + 0 綠 ++ 60 綠 +++ 90 +++ 0 綠 +++ 60 綠 +++ 90 +++ 0 綠 + 60 ,00 綠 ++ 90 +++ 0 綠 +++ 60 綠 +++ 90 ++ 注： +：一般， ++：較好， +++：最好 實(shí)驗(yàn)二：不同濃度 紅腺忍冬無(wú)菌苗繼代增殖及節(jié)間伸長(zhǎng)的影響 由下表 6 可見(jiàn)， 在 范圍內(nèi)， 隨著 度的升高，紅腺忍冬芽增殖倍數(shù)呈上升趨勢(shì)， 處理 ++ 的芽增殖倍數(shù)最高，為 1 倍（ 30d）、 （ 60d）、 （ 90d）。 同濃度對(duì)紅腺忍冬節(jié)間平均長(zhǎng)度和芽平均葉片數(shù) 的影響不大。 表 6 不同濃度 紅腺忍冬無(wú)菌苗繼代增殖及節(jié)間伸長(zhǎng)的影響 ) 培養(yǎng)時(shí)間（ d） 芽增殖倍數(shù)（ t） 芽平均高度 (芽節(jié)間平均長(zhǎng)度（ 芽平均葉片數(shù) (p) 顏色 健壯度 （ 30 綠 ++ 60 +++ 90 綠 ++ 0 綠 + 60 ++ 90 綠 ++ 0 綠 ++ 60 +++ 90 綠 ++ 0 綠 ++ 60 ++ 90 綠 ++ 0 綠 + 60 ++ 90 綠 ++ 0 綠 ++ 60 ++ 90 綠 ++ 0 綠 ++ 60 ++ 90 綠 ++ 0 綠 + 60 +++ 90 綠 ++ 0 綠 + 60 ++ 90 綠 ++ 注： +：一般， ++：較好， +++：最好。 12 （ 6）不同種類生長(zhǎng)素對(duì) 不同 來(lái)源 材料 的 紅腺忍冬生根壯苗的影響 據(jù)下表 7 可知， 生長(zhǎng)素對(duì)紅腺忍冬組培苗生根效果起 不可或缺的 關(guān)鍵 作用， 未添加生長(zhǎng)素的 處理 培養(yǎng)至第 60d 時(shí)仍未 生根 ，繼續(xù)追蹤觀察，未見(jiàn)生根 ； 就 同一濃度不同種類生長(zhǎng)素培養(yǎng) 種子 繼 代組培 苗而言， 生根率、平均根數(shù)及平均根長(zhǎng)等各方面生根效果優(yōu)略次序均為： ＞ ＞ ， 且 處理能在短期內(nèi)促進(jìn)生根，培養(yǎng) 30d 生根率可達(dá) 100%，優(yōu)于其它處理，但 卻不利于 腋芽初代誘導(dǎo)苗的生根，培養(yǎng)至第 60d 時(shí) 腋芽初代誘導(dǎo)苗 仍未生根， 繼續(xù)培養(yǎng) 則 出現(xiàn)底端愈傷組織膨大，葉片及頂芽泛黃最終 導(dǎo)致枯萎死亡。 綜上， 紅腺忍冬組培 無(wú)菌 生根 苗 的優(yōu)選 材料 ： 種子實(shí)生無(wú)菌 組培 苗芽，優(yōu)選生根培養(yǎng)基： 1/2糖 30g/L+瓊脂 6g/L+。 表 7 不同種類生長(zhǎng)素對(duì)不同 來(lái)源材料 的紅腺忍冬生根壯苗的影響 生長(zhǎng)素種類及濃度 () 材料來(lái)源 培養(yǎng)天數(shù)（ d） 生根率（ %） 平均根數(shù) （條 /株） 平均根長(zhǎng) （ 根生長(zhǎng)狀況 — 種子繼代組培苗 30 60 芽初代誘導(dǎo)苗 30 60 子繼代組培苗 30 白 深綠 ，較粗壯，側(cè)根多，質(zhì)量較佳 60 子繼代組培苗 30 白 深綠，較細(xì)長(zhǎng)，側(cè)根少，質(zhì)量好 60 子繼代組培苗 30 白 深綠，較細(xì)長(zhǎng)，側(cè)根少，質(zhì)量一般 60 、與現(xiàn)行法律法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn) 關(guān)系 本標(biāo)準(zhǔn)（征求意見(jiàn)稿）是依據(jù)《中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化法》、《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》、《 廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》等國(guó)家相關(guān)的法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上結(jié)合地方實(shí)際情況制定出來(lái)的，因此與現(xiàn)行法律、法規(guī)及強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)無(wú)沖突。 七、 實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)的要求和建議 13 標(biāo)準(zhǔn)必須是在遵循法律法規(guī)及國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的前提下，綜合 組培 生產(chǎn)企業(yè)的實(shí)際要求制定，標(biāo)準(zhǔn)必須具有法律依據(jù)及可操作性。 八、 參考文獻(xiàn) [1] 285 農(nóng)藥安全使用標(biāo)準(zhǔn) [2] 國(guó)家藥典委員會(huì) 一部 [S]化學(xué)工業(yè)出版社 , 2005. 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