《紅腺忍冬組培快繁技術(shù)規(guī)程》征求意見稿編制說(shuō)明
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《紅腺忍冬組培快繁技術(shù)規(guī)程》征求意見稿編制說(shuō)明
1 廣西地方標(biāo)準(zhǔn) 紅腺忍冬組培快繁技術(shù)規(guī)程 (征求意見稿)編制說(shuō)明 一、 工作簡(jiǎn)況 (一)任務(wù)來(lái)源 本標(biāo)準(zhǔn)是廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局下達(dá)的 2016 年 第 六 批廣西地方標(biāo) 準(zhǔn)制定(修訂)項(xiàng)目計(jì)劃 (桂質(zhì)監(jiān)函 2016 324 號(hào)文) ,項(xiàng)目編號(hào)為 2016由廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)提出,廣西衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口,廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 負(fù)責(zé) 起草。 (二)參與起草單位 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 。 (三)主要起草人員名單及職務(wù)或職稱 二、編制標(biāo)準(zhǔn)意義 紅腺忍冬( ,是中國(guó)藥典山銀花的來(lái)源植物之一,具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效,用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒,熱毒血痢,風(fēng)熱感冒,溫?zé)岚l(fā)病。紅腺忍冬為廣西地理標(biāo)志性物 種,開發(fā)潛力巨大,其主根粗壯, 毛細(xì)根研 制 人 員 姓名 職務(wù) /職稱 現(xiàn)從事專業(yè) 所在單位 項(xiàng) 目 負(fù)責(zé)人 師鳳華 副研究員 生物技術(shù) 廣西藥用植物園 主 要 參 加 人 員 譚木秀 研究 實(shí)習(xí) 員 生物技術(shù) 廣西藥用植物園 蒲祖寧 主任技師 種質(zhì)資源保存 廣西藥用植物園 郭曉云 副研究員 生物技術(shù) 廣西藥用植物園 李翠 助理研究員 生理生化 廣西藥用植物園 2 密如蛛網(wǎng),枝條多,萌蘗能力強(qiáng),具有良好的蓄水保土效益,對(duì) 喀斯特地貌的恢復(fù)具有重要意義。 但近年來(lái)紅腺忍冬野生資源數(shù)量迅速減少,難以滿足需求,需加快發(fā)展人工種植。而種子繁殖和枝條扦插成活率均不高,因此有必要通過(guò)建立起完整、高效、實(shí)用的紅腺忍冬組培快繁技術(shù)體系,加快繁殖速度,提高繁殖系數(shù),為推廣紅腺忍冬組織培養(yǎng)苗優(yōu)良種質(zhì)大面積生產(chǎn)提供技術(shù)參考。 經(jīng)查閱中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)批準(zhǔn)發(fā)布公告、中華人民共和國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)備案公告和中華人民共和國(guó)地方標(biāo)準(zhǔn)備案公告, 紅腺忍冬組培快 繁技術(shù) 尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或地方標(biāo)準(zhǔn),因此,特進(jìn)行 紅腺忍冬組培快繁 技術(shù)研究并據(jù)此制定 紅腺忍冬組培快繁技術(shù) 規(guī)程。 三、標(biāo)準(zhǔn)編制起草及研究過(guò)程 (一)前期 準(zhǔn)備 工作 2012 年至 2015 年,在廣西壯族自治區(qū)科技廳課題 “ 金銀花木犀草苷生物合成相關(guān)基因克隆和轉(zhuǎn)化山銀花的研究 ” (項(xiàng)目任務(wù)書編號(hào): 2012資助下,完成了山銀花的生態(tài)環(huán)境條件調(diào)查,開展了金銀花黃酮類生物合成途徑關(guān)鍵酶 和黃酮類化合物合成的影響研究、遺傳轉(zhuǎn)化體系研究等,在此基礎(chǔ)上,標(biāo)準(zhǔn)編制小組成員至今已完成 山銀花紅 腺忍冬種子發(fā)芽條件、 種子實(shí)生苗滅菌方法、培養(yǎng)基組分、激素水平、培養(yǎng)條件 、 不同組織芽誘導(dǎo)、 增殖繼代、芽誘導(dǎo)及 生根壯苗 等較優(yōu)的初代誘導(dǎo)技術(shù)方案等研究工作,基本掌握紅腺忍冬組培快繁技術(shù),在核心期刊上發(fā)表相關(guān)文章1 篇: 紅腺忍冬種子沙培萌發(fā)條件和種子沙培苗滅菌方法的初步研究 J2015,38(5):899已申請(qǐng)相關(guān)專利 3 項(xiàng):紅腺忍冬無(wú)菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導(dǎo)的方法( ( 2016 年 4 月 29 日已發(fā)受權(quán)通知書)、一種華南忍冬葉片不定芽的誘導(dǎo)方法( (已進(jìn)入答辯階段),紅腺忍冬無(wú)菌組培苗葉柄不定芽誘導(dǎo)的方法( 2015122400745570已受理;為本標(biāo)準(zhǔn)的 制定實(shí)施奠 定了良好基礎(chǔ)。 (二 )標(biāo)準(zhǔn) 編制起草 進(jìn)度 1、 2016 年 1 月,收到廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局為貫徹落實(shí)廣西壯族自治區(qū)人民政府關(guān)于印發(fā)深化標(biāo)準(zhǔn)工作改革實(shí)施方案的通知(桂政發(fā) 201551 號(hào))精神而下達(dá)關(guān)于征集 2016 年廣西地方標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃項(xiàng)目的通知。 3 2、 2016 年 3 月,廣西壯族自治區(qū)藥用植物園向廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局遞交了制定廣西地方標(biāo)準(zhǔn)紅腺忍冬組培快繁技術(shù) 規(guī)程的建議書和申請(qǐng)書。 3、 2016 年 5 月,廣西壯族自治區(qū)藥用植物園成立了以師鳳華為組長(zhǎng),譚木秀、蒲祖寧、郭曉云、李翠等 5 人組成的標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組,該小組在前期研究工作的基礎(chǔ)上,對(duì) 紅腺忍冬組培快繁 關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)和集成,同時(shí)查閱了大量的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料,確定了廣西地方標(biāo)準(zhǔn)紅腺忍冬組培快繁技術(shù)規(guī)程的主要技術(shù)核心內(nèi)容,形成了標(biāo)準(zhǔn)的基本構(gòu)架。 4、 2016 年 6 月,經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組的充分討論及多次修改完善,最終完成了廣西地方標(biāo)準(zhǔn)紅腺忍冬組培快繁技術(shù)規(guī)程(征求意見稿)。 (三 )標(biāo)準(zhǔn)研究過(guò)程 標(biāo)準(zhǔn)編制 小組成員多年從事 遺傳轉(zhuǎn)化及組培快繁 工作并熟練掌握其 技術(shù), 成功 申請(qǐng)到 紅腺忍冬 相關(guān)項(xiàng)目并 做出一定的成績(jī) , 經(jīng) 前期試驗(yàn) 已 成功 誘導(dǎo) 出 紅腺忍冬無(wú)菌 組培苗, 具備 一定的 工作基礎(chǔ)。 標(biāo)準(zhǔn)編制項(xiàng)目下達(dá)后,按照廣西區(qū)質(zhì)監(jiān)局關(guān)于編制標(biāo)準(zhǔn)工作的要求, 標(biāo)準(zhǔn) 編制小組 依照標(biāo)準(zhǔn)主題、要求對(duì)材料進(jìn)行整理、收集和調(diào)研。 根據(jù)各 人研究方向進(jìn)行分工 合作 ,開展 紅腺忍冬 資源的調(diào)查和采集 , 針對(duì)試驗(yàn)中出現(xiàn)的 紅腺忍冬帶腋芽莖段誘導(dǎo)無(wú)菌組培苗 難,及此初代誘導(dǎo)苗不易進(jìn)行繼代 培養(yǎng) 、 組培苗繁殖系數(shù)低、易褐化、 易 死亡等問(wèn)題 , 在 不斷 試驗(yàn)的同時(shí)咨詢了 相關(guān) 同行專家,反復(fù) 思考總結(jié) 、多方位 進(jìn)行試驗(yàn)篩選 ,確保標(biāo)準(zhǔn) 數(shù)據(jù) 準(zhǔn)確 可靠性。 標(biāo)準(zhǔn)研究的試驗(yàn)材料 來(lái) 自廣西 馬山 縣 弄拉 景區(qū)的 紅腺忍冬成熟漿果 , 撥取其中成熟飽滿的種子進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn),獲取種子實(shí)生苗,對(duì) 此實(shí)生苗進(jìn)行外植體滅菌處理獲得無(wú)菌組培苗,進(jìn)一步 進(jìn)行 相關(guān) 篩選 試驗(yàn)獲 得 不同組織 外植體 芽誘導(dǎo)、增殖 繼代 及生根 壯苗 的較佳試驗(yàn)方案 ,建立 起 紅腺忍冬 組培苗快速繁殖技術(shù)體系。 四、標(biāo)準(zhǔn)編制原則、依據(jù) (一)制定本標(biāo)準(zhǔn)的目的是 規(guī)范 紅腺忍冬 組培苗 組培快繁 技術(shù)、 拓寬組培苗誘導(dǎo)來(lái)源、 提高 組培苗 繁殖系數(shù) 質(zhì)量 , 實(shí)現(xiàn) 紅腺忍冬 組培苗 組培快繁 標(biāo)準(zhǔn)化。 (二)本標(biāo)準(zhǔn)的格式和編 寫方法執(zhí)行 規(guī)定。 (三)本標(biāo)準(zhǔn)的制定力求科學(xué)、準(zhǔn)確、系統(tǒng),內(nèi)容與當(dāng)前廣西 紅腺忍冬組培快繁 的實(shí)際和社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況緊密結(jié)合,可操作性強(qiáng)。 (四)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了 紅腺忍冬 組培 快繁的術(shù)語(yǔ)和定義、取材與處理、 外植體不定 芽 4 誘導(dǎo) 、 繼代 增殖、生根壯苗、培養(yǎng)條件、信息記錄 。適用于組培苗生產(chǎn)公司和企業(yè)通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范化生產(chǎn) 紅腺忍冬無(wú)菌 組培苗。 (五)本標(biāo)準(zhǔn)的編寫以 廣西壯族自治區(qū)科技廳課題 “ 金銀花木犀草苷生物合成相關(guān)基因克隆和轉(zhuǎn)化山銀花的研究 ” (項(xiàng)目任務(wù)書編號(hào): 2012為研 究基礎(chǔ), 紅腺忍冬 組 織 培 養(yǎng)技術(shù)相關(guān) 試驗(yàn) 數(shù)據(jù)為基本 參考 依據(jù) 進(jìn)行 編制 。 五、標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容 的確定 (一)范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了紅腺忍冬( 組培快繁的 術(shù)語(yǔ)和定義、取材與處理、外植體不定芽誘導(dǎo)、繼代增殖、生根壯苗、培養(yǎng)條件、信息記錄。 (二)規(guī)范性引用文件 下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用必不可少。凡是注明日期的引用文獻(xiàn),僅所注日期的版本適用于本文件;凡是不注明日期的引用文件,以其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。 無(wú) (三)主要技術(shù)內(nèi)容 1、材料與方法 材料 : 廣西 馬山縣 中國(guó) 弄拉景區(qū)的紅腺忍冬成熟漿果 。 方法: ( 1)不同處理方式對(duì)紅腺忍冬種子發(fā)芽的影響 將當(dāng)年 10 月底 11 月初采 集 的成熟漿果 一半直接將種子剝出進(jìn)行播種,另一半漿果經(jīng) 4 低溫貯藏 5 d 后 將 種子 剝出 ,經(jīng)發(fā)芽處理后進(jìn)行播種,播種后均覆蓋一層 0.3 0 目篩的細(xì)河砂。種子的發(fā)芽處理如下:不浸泡 , 清水浸泡 24 h, 自來(lái)水流水沖洗 24 h, 200 泡 24 h, 400 泡 24 h。 每一處理設(shè) 3 次重復(fù),每一重復(fù)播種 50 粒種子, 每 天觀察并統(tǒng)計(jì)各處理種子發(fā)芽等相關(guān)情況。 種子發(fā) 芽能力指標(biāo) 統(tǒng)計(jì):萌發(fā) 以胚軸突破種皮為準(zhǔn),此時(shí)即為初次計(jì)數(shù)時(shí)間。自發(fā)芽開始之日起,每 天記錄萌發(fā)的正常幼苗數(shù),挑出霉變種子,至無(wú)新萌發(fā)種子的天數(shù)為末次計(jì)數(shù)時(shí)間。以萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間、萌發(fā)結(jié)束時(shí)間、萌芽持續(xù)時(shí)間、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)作為種子萌發(fā)試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo),具體算法如下: 萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間:從播 種之日起至開始萌發(fā)之日所經(jīng)歷的天數(shù)。 5 萌發(fā)結(jié)束時(shí)間:從播 種之日起,經(jīng)過(guò)萌發(fā)期,至無(wú)新萌發(fā)種子 時(shí) 所經(jīng)歷的天數(shù)。 萌芽持續(xù)天數(shù):從種子開始萌發(fā)之日起,至萌發(fā)結(jié)束之日,之間所經(jīng)歷的天數(shù)。 發(fā)芽率( =( n/N) ×100%( n 為最終發(fā)芽數(shù), N 為供試種子數(shù))。 發(fā)芽勢(shì)( =( ) ×100%( i 天種子發(fā)芽達(dá)到高峰時(shí)正常發(fā)芽的種子數(shù),N 為供試種子數(shù))。 ( 2)種子 實(shí)生 苗消毒滅菌處理 具 3 片以上真葉的種子實(shí)生苗 經(jīng)過(guò)消毒滅菌 處理 后轉(zhuǎn)接入培養(yǎng)基 1/2糖 30 g/L+瓊脂 6g/L +( ) 中培養(yǎng) 。 消毒滅菌 設(shè) 6 個(gè)處理,每一處理 設(shè) 3 次重復(fù),每一重復(fù) 接種 3 瓶,每瓶接種 2 株 , 7d 后統(tǒng)計(jì)污染率和成活率等相關(guān)數(shù)據(jù)。 處理見表 1。 表 1 不同滅菌方法對(duì)紅腺忍冬種子實(shí)生 苗滅菌效果的影響 前處理方式 滅菌劑種類及 滅菌時(shí)間 75%酒精 (S)+苗原培養(yǎng)條件 滅菌方式 于超凈臺(tái)上直接用無(wú)菌水沖洗 0+ 0 密閉培養(yǎng)瓶中 連根整株取出,不滅菌,連根轉(zhuǎn)接 30+ 5 密閉培養(yǎng)瓶中 連根整株取出,僅對(duì)下胚軸以下部分進(jìn)行滅菌,連根轉(zhuǎn)接 30+ 5 密閉培養(yǎng)瓶中 連根整株取出,整株全部滅菌,連根轉(zhuǎn)接 30+ 5 密閉培養(yǎng)瓶中 棄根,整體滅菌,整體轉(zhuǎn)接 洗潔精水刷洗 30+5 密閉培養(yǎng)瓶中 棄根,整體滅菌,整體轉(zhuǎn)接 30+ 5 開放花盆中 棄根,整體滅菌,整體轉(zhuǎn)接 ( 3) 不同種類細(xì)胞分裂素對(duì)紅腺忍冬不同部位愈傷組織誘導(dǎo)及成芽的影響 以苗齡為 40 生長(zhǎng)健壯的 無(wú)菌 組培 生根苗的葉片、葉柄及 無(wú)芽 莖段三部位 為材料, 以 糖 30g/L+瓊脂 6g/L+ 為基本培養(yǎng)基,分別添加 、 、 , 共 12 個(gè)處理,每一處理 設(shè) 3 次重復(fù),每一重復(fù) 接種 3 瓶,每瓶接種 8 個(gè)外植體,每周觀察一次 , 于接種后起第 30 天、 60 天及 90天統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。 ( 4) 繼代 增殖培養(yǎng) 試驗(yàn)一:不同濃度 6紅腺忍冬芽增殖 繼代及節(jié)間伸長(zhǎng)的影響 以苗齡為 40 生長(zhǎng)健壯的 無(wú)菌組培 生根 苗芽為材料, 以 糖 30g/L+瓊脂6g/L+ 為基本培養(yǎng)基,分別添加 60、 , 6 另設(shè) 糖 30g/L+瓊脂 6g/L+ 6 + 為平行對(duì)照 ; 每一處理 設(shè) 3 次重復(fù),每一重復(fù) 接種 3 瓶,每瓶接種 2 株芽苗 , 于接種后 第 30 天、 60 天及 90 天統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。 試 驗(yàn)二 :不同濃度 紅腺忍冬無(wú)菌苗繼代增殖及節(jié)間伸長(zhǎng)的影響 以苗齡為 40 生長(zhǎng)健壯的 無(wú)菌組培 生根 苗芽為 材料, 以 糖 30g/L+瓊脂6g/L+6 為基本培養(yǎng)基,分別添加 0、 ,共 9 個(gè)處理 , 每一處理 設(shè) 3 次重復(fù),每一重復(fù) 接種 3 瓶,每瓶接種 2 株芽苗 , 于接種后 第 30 天、 60 天及 90 天統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。 ( 5)不同種類生長(zhǎng)素對(duì)不同來(lái)源材料的紅腺忍冬生根壯苗的影響 以苗齡為 40 生長(zhǎng)健壯的 無(wú)菌組培 生根 苗芽為 材料, 以 1/2糖 30g/L +瓊脂 6g/L 為基本培養(yǎng)基,分別添加 、 、 , 未 添加生長(zhǎng)素的組合為對(duì)照,同時(shí)以從帶腋芽莖段為外植體誘導(dǎo)出的初代無(wú)菌誘導(dǎo)苗接入 處理為平行對(duì)照, 共 5 個(gè)處理, 每一處理 設(shè) 3 次重復(fù),每一重復(fù) 接種 3 瓶,每瓶接種 2株芽苗 , 于接種第 30d 及第 60d 時(shí)統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。 2、結(jié)果與分析 ( 1)不同處理方式對(duì)紅腺忍冬種子發(fā)芽的影響 由 下表 2 可 知 , 不同處理方對(duì)紅腺忍冬種子的萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間、萌發(fā)結(jié)束時(shí)間、發(fā)芽持續(xù)時(shí)間、發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)的影響程度均不同。 低溫處理的種子平均發(fā) 芽率及平均發(fā)芽勢(shì)優(yōu)于未經(jīng)低溫 的 處理, 并且 種子發(fā)芽持續(xù)時(shí)間 縮短 ; 溶液浸 泡的處理 種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)均高于其它處理,發(fā)芽持續(xù)時(shí)間縮短明顯 , 以處理 00 浸泡的平均發(fā)芽率和平均發(fā)芽勢(shì)最 高, 發(fā)芽早,發(fā)芽持續(xù)時(shí)間短 ; 是否經(jīng)過(guò) 清水浸泡或流水沖洗對(duì)種子平均發(fā)芽率的影響不大 ,但 流水沖洗 能縮短 種子發(fā)芽持續(xù)時(shí)間 。 綜合可知,以溶液 對(duì) 經(jīng) 4 低溫 儲(chǔ)藏 5 子 浸泡 24 子發(fā)芽 的較佳 處理 。 表 2 不同處理方式對(duì)紅腺忍冬種子發(fā)芽 的影響 處理方式 萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間 / d 萌發(fā)結(jié)束時(shí) 間 / d 發(fā)芽持續(xù)時(shí)間 / d 平均發(fā)芽率 / % 平均發(fā)芽勢(shì) / % 未經(jīng) 4 儲(chǔ)藏 不浸泡 4 低 溫 儲(chǔ) 不浸泡 7 藏 5d 自來(lái)水流水沖洗 24h 浸泡 24h 00 浸泡 24h 00 浸泡 24h 2)不同滅菌方法對(duì)紅腺忍冬種子實(shí)生苗滅菌效果的影響 由 下 表 3 可知, 6 個(gè)處理的種子 實(shí)生 苗成活率均為 100%,但不同滅菌方式對(duì)紅腺忍冬種子沙培 實(shí)生 苗滅菌效果差異顯著: 經(jīng) 洗潔精水刷洗 ;棄根轉(zhuǎn)接的效果優(yōu)于連根轉(zhuǎn)接, 經(jīng) 開放式沙基培養(yǎng) 的實(shí)生苗外植體轉(zhuǎn)接的平均污染率和苗生長(zhǎng)狀況均 優(yōu)于封閉式的沙基培養(yǎng)。 由此可 知 ,對(duì)開放沙基培養(yǎng)的 實(shí)生 種子 苗下胚軸以上部分用洗潔精水刷洗 沖洗之后進(jìn)行 75%酒精 (30 S)+ 菌處理的滅菌效果最好。 表 3 不同滅菌方法對(duì)紅腺忍冬種子沙培苗滅菌效果的影響 清潔 方式 滅菌及轉(zhuǎn)接 方式 平均污染率 / % 平均成活率 / % 苗生長(zhǎng)狀況 于超凈臺(tái)上直接用無(wú)菌水沖洗 連根整株取出,不滅菌,連根轉(zhuǎn)接 連根整株取出,僅對(duì)下胚軸以下部分進(jìn)行滅菌,連根轉(zhuǎn)接 連根整株取出,整株全部滅菌,連根轉(zhuǎn)接 棄根,整體滅菌,整體轉(zhuǎn)接 + 洗潔精水刷洗 棄根,整體滅菌,整體轉(zhuǎn)接 + 棄根,整體滅菌,整體轉(zhuǎn)接 + 注:同列不同小寫字母表示有顯著性差異, P 列不同大寫字母表示有極顯著性差異,P -:差; +:好; +:較好; +:最好 ( 3) 不同種類細(xì)胞分裂素對(duì)紅腺忍冬 不同部位愈傷組織 誘導(dǎo)及 成芽的影響 據(jù)下表 4 可知, 愈傷組織誘導(dǎo)效果: 、 、 、 4 種細(xì)胞分裂素中均可將 紅腺忍冬葉片、葉柄及無(wú)腋芽莖段 3 種外植體 誘導(dǎo)出愈傷組織 ; 在細(xì)胞分裂素 、 及 3 個(gè)處理中 , 3種外植體 愈傷組織 誘導(dǎo)率 均 為:無(wú)腋芽莖段葉柄 葉片 , 在 L 處理 :葉片無(wú)腋芽莖段 葉柄 ; 就同一部位 不同細(xì)胞分裂素 而言 , 各 部位 愈傷組織誘導(dǎo)率高低為 8 (以 3 次統(tǒng)計(jì)的平均數(shù) 為依據(jù) ) :葉片: 柄和無(wú)腋芽莖段均為: 愈傷 組織 不定芽誘導(dǎo) 效果: 除 ,其它 3 種細(xì)胞分裂素 能誘導(dǎo)出不定芽。 3 種細(xì)胞分裂素對(duì) 3 部位不定芽誘導(dǎo)率高低及芽質(zhì)量效果均為: 及 2 個(gè)處理 均能將 這 3 種外植體 誘導(dǎo)出不定芽 , 且這 3 部位誘導(dǎo)率大小 及芽質(zhì)量 高低 均為無(wú)腋芽莖段葉柄葉片 ; 3 部位 在各 時(shí)期 芽誘導(dǎo)率均 表現(xiàn) 為 處理只能將葉片和無(wú)腋芽莖段 導(dǎo)出不定芽 , 其中葉片 的芽 誘導(dǎo)率 較高 。 另外, 葉片、葉柄及不帶芽莖段 3 部位在 4 種培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的愈組均為顆粒狀、質(zhì)地硬、無(wú)水漬;愈傷組織顏色變化趨勢(shì)均隨著培養(yǎng)時(shí)間遞增而呈米白色 深綠色 褐化現(xiàn)象。 綜合可 見 , 愈傷組織誘導(dǎo)效果:優(yōu)選組合為:無(wú)腋芽莖段在培養(yǎng)基 糖 30g/L+瓊脂 6g/L+ 中的 愈傷組織 誘導(dǎo)效果最佳 ,培養(yǎng)至第 30d 時(shí),誘導(dǎo)率高達(dá) 培養(yǎng)至第 90d 時(shí),愈傷組織直徑達(dá) 不定芽誘導(dǎo)效果:以無(wú) 腋芽 莖段 在培養(yǎng)基 糖 30g/L+瓊脂 6g/L+ 中的 不定芽誘導(dǎo) 效果最佳 ,培養(yǎng)至第 60d 時(shí),平均芽數(shù)達(dá) 質(zhì)量最佳 , 培養(yǎng)至第 90d 時(shí), 不定芽誘導(dǎo)率 可 達(dá) 表 4 不同種類細(xì)胞分裂素對(duì)紅腺忍冬不同部位愈傷組織誘導(dǎo)及成芽的影響 培養(yǎng)基種類及濃度( ) 接種部位及接種量(個(gè)) 培養(yǎng)天數(shù)( d) 出愈率( %) 成活率( %) 愈組大小(芽誘導(dǎo)率( %) 總芽數(shù)(個(gè)) 平均芽數(shù) 芽質(zhì)量 片 30 60 90 葉柄 30 60 90 + 無(wú)腋芽莖段 30 60 + 90 + 片 30 60 + 9 90 + 葉柄 30 60 + 90 + 無(wú)腋芽莖段 30 60 + 90 + 片 30 60 90 葉柄 30 60 90 無(wú)腋芽莖段 30 60 90 片 30 60 90 葉柄 30 60 90 無(wú)腋芽莖段 30 60 + 90 + 注:平均芽數(shù) =芽總數(shù)(個(gè)) /出芽的外植體總數(shù)(個(gè)) ;芽質(zhì)量: +:一般, +:較好, +:最佳 ( 4)繼代增殖培養(yǎng) 試驗(yàn)一:不同濃度 6紅腺忍冬芽增殖繼代及節(jié)間伸長(zhǎng)的影響 據(jù)下表 5 可知, 同一處理中,隨著 培養(yǎng) 時(shí)間的增加,芽增殖倍數(shù)、芽平均高度、芽節(jié)間長(zhǎng)度及芽平均葉片數(shù)均呈逐漸上升趨勢(shì), 接種后第 30d、 60d、和 90d 這 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示, 芽增殖倍數(shù)均以處理 + 6 最高,分別為: 及 ;對(duì) 芽平均高度、芽節(jié)間平均長(zhǎng)度及芽平均葉片數(shù)誘導(dǎo)較好的處理為 + 6 及 + 6 , 6 的處 10 理 芽健壯度最佳; 的 芽增殖誘導(dǎo)及芽高度有明顯的促進(jìn)作用。 表 5 不同濃度 6紅腺忍冬芽增殖繼代及節(jié)間伸長(zhǎng)的影響 ) 6) 培養(yǎng)時(shí)間( d) 芽增殖倍數(shù)( t) 芽平均高度 (芽節(jié)間平均長(zhǎng)度( 芽平均葉片數(shù) (p) 顏色 健壯度 30 綠 + 60 + 90 綠 + 0 1 40 綠 + 60 + 90 + 0 綠 + 60 綠 + 90 + 0 綠 + 60 綠 + 90 綠 + 0 綠 + 60 綠 + 90 + 0 綠 + 60 綠 + 90 + 0 綠 + 60 ,00 綠 + 90 + 0 綠 + 60 綠 + 90 + 注: +:一般, +:較好, +:最好 實(shí)驗(yàn)二:不同濃度 紅腺忍冬無(wú)菌苗繼代增殖及節(jié)間伸長(zhǎng)的影響 由下表 6 可見, 在 范圍內(nèi), 隨著 度的升高,紅腺忍冬芽增殖倍數(shù)呈上升趨勢(shì), 處理 + 的芽增殖倍數(shù)最高,為 1 倍( 30d)、 ( 60d)、 ( 90d)。 同濃度對(duì)紅腺忍冬節(jié)間平均長(zhǎng)度和芽平均葉片數(shù) 的影響不大。 表 6 不同濃度 紅腺忍冬無(wú)菌苗繼代增殖及節(jié)間伸長(zhǎng)的影響 ) 培養(yǎng)時(shí)間( d) 芽增殖倍數(shù)( t) 芽平均高度 (芽節(jié)間平均長(zhǎng)度( 芽平均葉片數(shù) (p) 顏色 健壯度 ( 30 綠 + 60 + 90 綠 + 0 綠 + 60 + 90 綠 + 0 綠 + 60 + 90 綠 + 0 綠 + 60 + 90 綠 + 0 綠 + 60 + 90 綠 + 0 綠 + 60 + 90 綠 + 0 綠 + 60 + 90 綠 + 0 綠 + 60 + 90 綠 + 0 綠 + 60 + 90 綠 + 注: +:一般, +:較好, +:最好。 12 ( 6)不同種類生長(zhǎng)素對(duì) 不同 來(lái)源 材料 的 紅腺忍冬生根壯苗的影響 據(jù)下表 7 可知, 生長(zhǎng)素對(duì)紅腺忍冬組培苗生根效果起 不可或缺的 關(guān)鍵 作用, 未添加生長(zhǎng)素的 處理 培養(yǎng)至第 60d 時(shí)仍未 生根 ,繼續(xù)追蹤觀察,未見生根 ; 就 同一濃度不同種類生長(zhǎng)素培養(yǎng) 種子 繼 代組培 苗而言, 生根率、平均根數(shù)及平均根長(zhǎng)等各方面生根效果優(yōu)略次序均為: , 且 處理能在短期內(nèi)促進(jìn)生根,培養(yǎng) 30d 生根率可達(dá) 100%,優(yōu)于其它處理,但 卻不利于 腋芽初代誘導(dǎo)苗的生根,培養(yǎng)至第 60d 時(shí) 腋芽初代誘導(dǎo)苗 仍未生根, 繼續(xù)培養(yǎng) 則 出現(xiàn)底端愈傷組織膨大,葉片及頂芽泛黃最終 導(dǎo)致枯萎死亡。 綜上, 紅腺忍冬組培 無(wú)菌 生根 苗 的優(yōu)選 材料 : 種子實(shí)生無(wú)菌 組培 苗芽,優(yōu)選生根培養(yǎng)基: 1/2糖 30g/L+瓊脂 6g/L+。 表 7 不同種類生長(zhǎng)素對(duì)不同 來(lái)源材料 的紅腺忍冬生根壯苗的影響 生長(zhǎng)素種類及濃度 () 材料來(lái)源 培養(yǎng)天數(shù)( d) 生根率( %) 平均根數(shù) (條 /株) 平均根長(zhǎng) ( 根生長(zhǎng)狀況 種子繼代組培苗 30 60 芽初代誘導(dǎo)苗 30 60 子繼代組培苗 30 白 深綠 ,較粗壯,側(cè)根多,質(zhì)量較佳 60 子繼代組培苗 30 白 深綠,較細(xì)長(zhǎng),側(cè)根少,質(zhì)量好 60 子繼代組培苗 30 白 深綠,較細(xì)長(zhǎng),側(cè)根少,質(zhì)量一般 60 、與現(xiàn)行法律法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn) 關(guān)系 本標(biāo)準(zhǔn)(征求意見稿)是依據(jù)中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化法、中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范、 廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)等國(guó)家相關(guān)的法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上結(jié)合地方實(shí)際情況制定出來(lái)的,因此與現(xiàn)行法律、法規(guī)及強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)無(wú)沖突。 七、 實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)的要求和建議 13 標(biāo)準(zhǔn)必須是在遵循法律法規(guī)及國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的前提下,綜合 組培 生產(chǎn)企業(yè)的實(shí)際要求制定,標(biāo)準(zhǔn)必須具有法律依據(jù)及可操作性。 八、 參考文獻(xiàn) 1 285 農(nóng)藥安全使用標(biāo)準(zhǔn) 2 國(guó)家藥典委員會(huì) 一部 S化學(xué)工業(yè)出版社 , 2005. 3 8321(所有部分)農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則 . 4 賈瑞豐,尹光天,楊錦昌,等 . 紅厚殼種子發(fā)芽 試驗(yàn)的初步研究 J. 林業(yè)實(shí)用技術(shù),2011,(7):245 劉千,羅浩,蔡文國(guó),等 . 川牛膝種子發(fā)芽試驗(yàn)與生活力測(cè)定方法的研究 J. 種子,2011,30(7): 206 周婧,楊美純,岑秀芬,等 . 紅腺忍冬外植體滅菌與芽誘導(dǎo)研究 J011, 42(2):1247 鄒永梅,黃雪方 . 不同消毒劑對(duì)萬(wàn)壽菊外植體滅菌效果的影響 J然科學(xué)), 2011,27( 4): 258 吳敏 , 吳悅 . 不同煉苗方式對(duì)煙草品質(zhì)的 影響 J2012, 6( 2): 219 譚木秀 , 曾雯雯 , 韋鵬霄 , 莫喬程 , 蒲祖寧 , 岑秀芬 , 師鳳華 . 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