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1、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是建立在貼壁培養(yǎng)法和 懸浮培養(yǎng)法基礎(chǔ)上，再融合了固定化細(xì)胞、流式 細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)器技術(shù)以及人工灌流 等技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的。主要包括懸浮培養(yǎng)、微載 體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、中空纖維法等。 如今這一技術(shù)已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物制藥的研究 和生產(chǎn)中。它的應(yīng)用大大減少了用于疾病預(yù)防、 治療和診斷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為生產(chǎn)疫苗、細(xì)胞因子 、生物產(chǎn)品乃至人造組織等產(chǎn)品提供了強(qiáng)有力的 工具。 1懸浮培養(yǎng)技術(shù) 基本操作 (1)將動(dòng)物培養(yǎng)材料分散成細(xì)胞懸浮液過(guò) 濾、離心、純化、漂洗后接種到有適宜 培養(yǎng)液的培養(yǎng)系統(tǒng)中。傳代時(shí)按比例稀 釋即可繼續(xù)培養(yǎng)。
2、對(duì)貼壁性細(xì)胞，最初采用在培養(yǎng)液中加 人一定數(shù)量的小滾瓶，增加細(xì)胞生長(zhǎng)的 貼壁面積。此方法構(gòu)造簡(jiǎn)單，成本低， 重復(fù)性好，放大過(guò)程可依靠滾瓶數(shù)量的 增加。但產(chǎn)率低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，占空間 大。微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，一定程 度上改變了以上這些不足。微載體是直 徑60250um的微珠。 2微載體培養(yǎng)技術(shù) 理想的細(xì)胞支持物應(yīng)該具備特征： (1)生物相容性 (2)簡(jiǎn)便的無(wú)毒害固定化過(guò)程。 (3)良好的傳質(zhì)特性。 (4)良好的機(jī)械穩(wěn)定性。 (5)最大的比表面積。 (6)適合細(xì)胞生長(zhǎng)的形狀和大小。 (7)粒徑分布均一。 (8)能高壓滅菌。 (9)可重復(fù)利用，易于清洗。 (10)能保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。 (11)
3、接種方便。 (12)能固定大部分細(xì)胞。 (13)適合大規(guī)模培養(yǎng)。 (14)易使細(xì)胞、載體與培養(yǎng)基分離。 (15)適合于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。 微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞的步驟是： (1)選擇合適的微載體類型 (2)浸泡水化及消毒 (3)接種 (4)培養(yǎng)觀察與細(xì)胞記數(shù) (5)消化 (通常用酶消化法)。 采用膠原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可獲 得更完整的細(xì)胞膜和更高的細(xì)胞活性。 膠原酶專一性好，不損傷細(xì)胞膜，效果 較好。 (6)分離細(xì)胞： 對(duì)于回收率要求不高的細(xì)胞種類，分組 沉降簡(jiǎn)單易行。 脫離微載體的培養(yǎng)液放入細(xì)長(zhǎng)容器，于上清液 中分離收集細(xì)胞，400rmin，2min離心加速 微載體沉淀。 (7
4、)傳代培養(yǎng)： 如果進(jìn)行放大培養(yǎng)，可在細(xì)胞脫離微載 體后，加入一些新的微載體以增大培養(yǎng) 體積，提高培養(yǎng)液的利用率，不過(guò)此法 比全部用新微載體的細(xì)胞得率要少。 盡量減少培養(yǎng)液中Ca2+濃度可促進(jìn)微載 體之間的細(xì)胞轉(zhuǎn)移。 除了交聯(lián)葡聚糖為基質(zhì)的微載體,還可采用以 下微載體： 1)纖維纖維 素為為基質(zhì)質(zhì)微載載體： 2)蛋白質(zhì)為基質(zhì)微載體：變性膠原微載體，蛋 黃色，表面特性好，易與細(xì)胞結(jié)合。 3)高分子材料為基質(zhì)微載體： 4)無(wú)機(jī)玻璃基質(zhì)微載體。 3 多孔載體培養(yǎng) 一優(yōu)點(diǎn) 降低血清用量，增加細(xì)胞固定性。大的生長(zhǎng)空間 ，免受機(jī)械損傷，可以提高攪拌強(qiáng)度和通氣量， 強(qiáng)化傳質(zhì)。 多孔載體不僅能培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，也適
5、合懸浮細(xì)胞 的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)。 多孔載體固定細(xì)胞過(guò)程簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害和損 傷，細(xì)胞可從長(zhǎng)滿細(xì)胞的微載體中自動(dòng)轉(zhuǎn)移到未 長(zhǎng)細(xì)胞的新載體上生長(zhǎng)，接種方便，培養(yǎng)簡(jiǎn)單， 特別適合于反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。 多孔載體制備的材料選擇 主要考慮材料的生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn) (1）生物相容性：材料對(duì)細(xì)胞必須無(wú)毒害， 對(duì)貼壁細(xì)胞有良好的黏附作用。 (2)機(jī)械穩(wěn)定性：微載體在長(zhǎng)時(shí)間攪拌狀態(tài)下 不破碎；同時(shí)滿足微載體清洗處理、回收利用 的要求。 (3)熱穩(wěn)定性：在121 、蒸汽滅菌下不分解 、不破碎、不軟化。 4微囊化培養(yǎng)技術(shù) 微囊是一種用人造的半透膜制成的多孔微球體 ，小分子物質(zhì)可以自由透過(guò)，而各種酶、輔酶
6、 、離子交換劑、活性炭及蛋白等大分子物質(zhì)可 包裹在其中不能逸出，利用它們催化反應(yīng)底物 。微囊化培養(yǎng)是借鑒固定化技術(shù)將細(xì)胞包裹在 微囊中，在培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)在各 自的微小環(huán)境里受到一定的保護(hù)，細(xì)胞總的生 長(zhǎng)體積有了一定的增加，而且減少了攪拌對(duì)細(xì) 胞產(chǎn)生的剪切力。微囊化培養(yǎng)為單克隆抗體、 干擾素等生產(chǎn)提供了有效途徑。 5 中空纖維法 中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是理查德克瑞 克等在1972年發(fā)明的。最初使用的空心 纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素 混合組成的可透性膜，表面有許多海綿 狀多孔結(jié)構(gòu)。這樣，水分子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 和氣體可以透過(guò)，細(xì)胞也可在上面帖附 生長(zhǎng)。 中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)就是模擬細(xì)胞
7、在體內(nèi)生 長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用人工的“毛細(xì)血管”中 空纖維供給細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)等條件。培養(yǎng)系統(tǒng) 的核心部分由3-6層這樣的空心纖維組成，培養(yǎng) 時(shí)將待培養(yǎng)細(xì)胞接種于空心纖維的外腔。 培養(yǎng)一段時(shí)間后，逐漸用無(wú)血培養(yǎng)基代替含血 培養(yǎng)基。此時(shí)雖然細(xì)胞不再增殖，但能正常生 活并分泌所需的代謝產(chǎn)物。由手這種培養(yǎng)方法 在分離和純化分泌物時(shí)比較方便，因而在生產(chǎn) 激素和單抗時(shí)經(jīng)常采用。 九 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng) 91 生物反應(yīng)器的特點(diǎn)分析 由于動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁、非常脆弱、對(duì)剪切 敏感以及對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境有嚴(yán)格的要求，傳統(tǒng) 的微生物發(fā)酵反應(yīng)器不適用于動(dòng)物細(xì)胞的大量 培養(yǎng)，因而對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和 過(guò)程控制
8、提出了特殊的要求。細(xì)胞培養(yǎng)用生物 反應(yīng)器的種類越來(lái)越多，規(guī)模也越來(lái)越大，反 應(yīng)器的主要結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣升式和固 定床為主。 用于動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的 生物反應(yīng)器應(yīng)具備的基本要求： (1)混合系統(tǒng)設(shè)計(jì)應(yīng)能提供均勻、溫和的混合狀 態(tài)，剪切力小，保證良好的傳質(zhì)效果。 (2)反應(yīng)器內(nèi)空間利用率高，選用合適的載體系 統(tǒng)和材料。 (3)能嚴(yán)格保證無(wú)菌環(huán)境。 (4)能精確地控制溫度、酸堿度、溶解氧和C02 濃度等條件。 (5)能夠方便地實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液的連續(xù)添加、樣品的 采樣和觀察。 92 生物反應(yīng)器應(yīng)用概況 采用生物反應(yīng)器進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是一種有效 的途徑。但是，由于動(dòng)物細(xì)胞、組織的多樣性 ，使得在培養(yǎng)材
9、料、培養(yǎng)環(huán)境等方面千差萬(wàn)別 ，因此，如何根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象體內(nèi)生存環(huán)境的特 點(diǎn)，開發(fā)合適的生物反應(yīng)器模擬體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)與環(huán) 境進(jìn)行高效離體培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)條件、工藝等 進(jìn)行優(yōu)化將是重要的研究課題。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器一般有微載體 式、中空纖維式、灌注培養(yǎng)式、旋轉(zhuǎn)壁式等， 幾種新型的反應(yīng)器類型特點(diǎn)介紹如下： (一)柱狀中空纖維反應(yīng)器 中空纖維細(xì)胞反應(yīng)器主體是由微孔中空纖維 管束制成的，纖維束由外殼包裹，因此可分為 殼體空間及管體空間兩部分，每部分各有其進(jìn) 出口。一般講，細(xì)胞生長(zhǎng)在殼體部分，新鮮培 養(yǎng)液從殼體部分導(dǎo)人，氣體在管體部分通過(guò)， 其中一部分則均勻地?cái)U(kuò)散至殼體部分。殼體部 分的細(xì)胞如是附壁性的，則
10、附著在纖維外側(cè)， 在培養(yǎng)結(jié)束后用胰蛋白酶消化液將其消化并沖 出：若是非附壁性的應(yīng)采用微濾材料將其截留 在殼體內(nèi)而讓廢培養(yǎng)液排出。 (二)板框式中空纖維反應(yīng)器 因柱狀中空纖維反應(yīng)器中營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和代 謝產(chǎn)物會(huì)存在濃度梯度，所以細(xì)胞分布 受到影響而不均勻。 人們開發(fā)出板框式中空纖維反應(yīng)器。該 反應(yīng)器的中心是一束中空纖維淺床，置 于兩個(gè)不銹鋼微孔濾板之間。 板框式中空纖維反應(yīng)器 液營(yíng)養(yǎng) 中空纖維板 三、中心灌流式反應(yīng)器 四、灌流微載體生物反應(yīng)器 (五)旋轉(zhuǎn)壁式反應(yīng)器 一般由水平放置的內(nèi)外兩個(gè)同心圓柱組 成。靜態(tài)的內(nèi)柱由半透膜構(gòu)成，使氣體 可以通過(guò)該膜進(jìn)行交換。旋轉(zhuǎn)的外柱由 非通透性材料制成。 10生物反
11、應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 1.病毒疫苗 2.非抗體免疫調(diào)節(jié)劑 3.多肽生長(zhǎng)因子 4.酶類 5.激素 6.腫瘤特異性抗原 7.單克隆抗體 8.病毒殺蟲劑 注意幾個(gè)問(wèn)題： (一)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境 (1)氨離子：細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是 提高細(xì)胞密度的主要限制因素。(2)乳酸： (3)二氧化碳：二氧化碳積聚，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性 作用或者改變細(xì)胞代謝水平。 (4)甲基乙二醛(Mc)：(5)滲透壓： (6)載體：可考慮采用多孔敬載體替代容易使 細(xì)胞受機(jī)械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。 (二)細(xì)胞死亡與凋亡 大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的后期，維持細(xì)胞高的活力是 個(gè)富有挑戰(zhàn)性的課題。最初的研究似乎表明細(xì) 胞死亡大多由于壞死，而
12、人們逐漸認(rèn)識(shí)到至少 是一些細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中死亡主要原因是 細(xì)胞凋亡。 用基因工程方法將bcl2基因這種細(xì)胞凋亡 抑制基因?qū)爰?xì)胞。bcl2基因的過(guò)量表達(dá)能 抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)量 。 大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，可通過(guò)“細(xì)胞靜止” 過(guò)程來(lái)降低營(yíng)養(yǎng)成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生。 (三) 培養(yǎng)基與細(xì)胞系 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞賴以生長(zhǎng)、增殖的重 要因素。天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無(wú)血清 培養(yǎng)基開發(fā)成為當(dāng)今細(xì)胞領(lǐng)域的一大課題。 無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)在于避免血清的批次、質(zhì) 量、成分等對(duì)細(xì)胞造成的污染、毒性和不利于 產(chǎn)品純化等不良影響。 在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物 制品的應(yīng)用領(lǐng)域
13、中，優(yōu)化無(wú)血清培養(yǎng)基的成分 可使不同的細(xì)胞在最有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和表達(dá)目 的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。 (四)過(guò)程監(jiān)控 測(cè)量在線氧吸收速率確定從細(xì)胞生長(zhǎng)期 生產(chǎn)病毒到病毒感染期和細(xì)胞死亡后終 止感染的轉(zhuǎn)換時(shí)間；用在線葡萄糖分析 儀的測(cè)定調(diào)整灌流速度；測(cè)定氧消耗估 計(jì)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)率的代謝負(fù)荷；測(cè)定氧吸收 速率估測(cè)ATP的形成；測(cè)量在線氧化還 原能力作為活細(xì)胞濃度的指標(biāo)等均得以 應(yīng)用。 測(cè)定在線氧吸收速率并用質(zhì)譜儀分析廢 氣中二氧化碳呼出率計(jì)算呼吸商。一般 來(lái)說(shuō)，呼吸商應(yīng)接近1.0，這就要求細(xì)胞 培養(yǎng)中盡量降低氧消耗和二氧化碳排出 。 用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進(jìn)行在線 蛋白質(zhì)含量測(cè)定。另外，用在線蛋
14、白分解與 反相色譜監(jiān)測(cè)重組蛋白的糖基化以了解產(chǎn)品 的一致性。 計(jì)數(shù)法(細(xì)胞運(yùn)輸) 當(dāng)前培養(yǎng)細(xì)胞既在國(guó)內(nèi)進(jìn)行寄贈(zèng)、交換和購(gòu)買， 也在國(guó)際交流，為此需要裝運(yùn)細(xì)胞的 方法。 一種是用液氮或干冰貯存運(yùn)輸，需要特殊容器 ，較麻煩，且不適于長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行。另一方法為充液法 ，方便當(dāng)行，是當(dāng)前多采用的方法。 具體方法： 選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，待培養(yǎng)近單 層后，去掉培養(yǎng)液充滿新培養(yǎng)液。液量要達(dá)培養(yǎng) 瓶頸部，擰緊螺帽或塞一吸塞，保留微量空氣?？諝?留量過(guò)多，運(yùn)輸時(shí)大氣泡來(lái)回流動(dòng) 對(duì)細(xì)胞有干擾 作用。 一般經(jīng)45天運(yùn)輸對(duì)細(xì)胞活力無(wú)大影響。時(shí)間過(guò) 長(zhǎng),細(xì)胞活力下降。 到達(dá)后，倒出大部分培養(yǎng)液 ，保留維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需的液
15、體量。置37攝氏度培養(yǎng) ， 次日傳代。 十一 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例 腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)與建系過(guò)程 體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的歷史一定程度上代表了 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的發(fā)展歷史。 1952年，蓋爾(Gey)首先成功地建立世界上 第一個(gè)細(xì)胞系子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系，并 且使惡性腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)從間葉組織源性的細(xì) 胞轉(zhuǎn)向上皮源性細(xì)胞。 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展成就主要體 現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： (1)在培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞類型上，從間充質(zhì)源性的細(xì)胞 轉(zhuǎn)向上皮源性細(xì)胞，再由神經(jīng)外胚層源性到造血 細(xì)胞源性的發(fā)展歷程。 (2)在方法上，從原代培養(yǎng)到傳代培養(yǎng)、再到細(xì)胞系 的建立的發(fā)展過(guò)程。 (3)培養(yǎng)液成分上，由純血清培養(yǎng)基到含血清、再
16、到 無(wú)血清培養(yǎng)基三個(gè)階段。 (4) 生物學(xué)特性上，經(jīng)歷了從細(xì)胞水平到亞細(xì)胞水平 ，再到酶和分子水平的發(fā)展。 原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代后，能在體外 繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖的細(xì)胞即為細(xì)胞系。然而 ，這并不意味著細(xì)胞能永久生長(zhǎng)?？赡?過(guò)了若干代后，由于微生物污染、細(xì)胞 分化成熟、細(xì)胞不適應(yīng)外界環(huán)境等因素 影響而喪失分裂能力。根據(jù)細(xì)胞分裂能 力，可分為有限細(xì)胞系與無(wú)限細(xì)胞系兩 類。一般認(rèn)為，如果細(xì)胞能在體外培養(yǎng) 超過(guò)50代，培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)一年，而且細(xì) 胞的倍增時(shí)間保持穩(wěn)定時(shí)，就可以認(rèn)為 建系成功。 人上皮型鼻咽癌CNE-2細(xì)胞系為例 建系過(guò)程： (1)取材 (2)原代培養(yǎng) (3)建系過(guò)程 組織塊在接種1周后，上皮細(xì)胞從組織塊周圍向外迅速 遷移和生長(zhǎng)。2周后，可見成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。8周后， 上皮細(xì)胞生長(zhǎng)開始明顯加快. 細(xì)胞在傳代三次后 貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)上皮狀 。2周后細(xì)胞形成群落。第4代后細(xì)胞開始呈單層生長(zhǎng), 命名為CNE-2。經(jīng)生物學(xué)特性分析后確定細(xì)胞系建立 成功.
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