基因工程的操作過程.ppt

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4基因工程的操作過程,C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）,B重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)、增）,ADNA的體外重組（切、接）,,4基因工程的操作過程,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,切,接,轉(zhuǎn),增,檢,ADNA的體外重組（切與接）,4基因工程的操作過程,同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接,,同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接,,,重組率,同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接,5,5,,EcoRI,,,,退火,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,,,,T4-DNAligase,5,,5,,,,5,,5,,同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接,BamHI,,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,,5,GATCA,T,5,,,退火,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,,,T4-DNAligase,5,,5,,BclI,,G,CCTAG,GATCC,G,,,5,GATCA,T,,,,5,,5,,重組率,重組率的定義,重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)在常規(guī)實驗條件下，重組率一般為25-75%重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標，較高的重組率可以大大簡化DNA重組的后續(xù)操作。,重組率,提高重組率的方法,提高外源DNA片段與載體的分子比：5:1-10:1,載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團：,5,5,,EcoRI,,,5,G,CTTAAp,AATTC,G,5p,5,,5,AATTC,G,5HO,,,退火,5,G-A-A-T-T-C,C-T-T-A-AG,,5,,GA-A-T-T-C,C-T-T-A-A-G,,,,,OH,HO,OH,HO,堿性磷酸單酯酶,堿性磷酸單酯酶,B重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)與增）,4基因工程的操作過程,轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù),,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化細胞的擴增,,,,轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù),Ca2+誘導(dǎo)的完整細菌細胞的轉(zhuǎn)化,Ca2+誘導(dǎo)的完整細胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài),,轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù),Ca2+誘導(dǎo)的完整細菌細胞的轉(zhuǎn)化,大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備：,100ml菌體培養(yǎng)至OD600=0.5，離心收集菌體,用10ml冰冷的20mMCaCl2溶液懸浮菌體，離心,用1ml冰冷的100mMCaCl2溶液懸浮菌體,冰浴放置12-24小時，備用,收集菌體,,,,,,轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù),Ca2+誘導(dǎo)的完整細菌細胞的轉(zhuǎn)化,大腸桿菌感受態(tài)細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：,取100ml感受態(tài)細胞，加入相當于50ng載體的重組,冰浴放置半小時,在42℃保溫2分鐘（熱脈沖）,快速將轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1-2分鐘,DNA連接液，混勻,,,,,加入1ml新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1小時（擴增）,涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選,,,轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù),細菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化,革蘭氏陽性細菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細胞壁，因而這類細菌通常采用原生質(zhì)體（細胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟MDNA分子,酵母菌、霉菌、植物細胞也可用原生質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù),電穿孔轉(zhuǎn)化,將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進入細胞內(nèi)電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y(jié)構(gòu)的受體細胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實驗,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率的定義,轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進入受體細胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實驗規(guī)模下，每個受體細胞最多只能接受一個載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細胞接納DNA的個數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時，未接納載體或重組子的受體細胞不長）,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率的定義,例如，pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有108個分子能進入受體細胞。一微克pUC18共有3.4X1011個分子（6.02X1017/2686X660），也就是說，每3400個pUC18分子才有一個分子進入受體細胞另一方面，在實際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2ml感受態(tài)細胞，大約含有2X1010個大腸桿菌細胞，也就是說，每200個細胞只有一個細胞能接納pUC18DNA,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率的用途,利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計DNA重組實驗規(guī)模,例如，某一DNA重組實驗的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107/mg載體，,經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個,重組克隆，需投入多少載體DNA進行重組實驗？,若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個重組克隆需要：,104/107X10-2=0.1mg載體DNA,考慮到實驗系統(tǒng)的重組率為20%，所以實際投入載體應(yīng)為：,0.1/20%=0.5mg載體DNA,載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算,出（5mg），甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進行篩選,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率的影響因素,載體及DNA重組分子方面：,載體本身的性質(zhì)：,不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細胞，其轉(zhuǎn)化率不同,載體的空間構(gòu)象：,質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載,體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的,超螺旋質(zhì)粒低兩個數(shù)量級,插入片段的大?。?對質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率的影響因素,受體細胞方面：,受體細胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率的影響因素,轉(zhuǎn)化方法方面：,受體細胞的預(yù)處理：影響最大,供受體的比例：,Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化0.1ml感受態(tài)細胞50ngDNA,轉(zhuǎn)化方法：,Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化106-107/mgDNA,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化109個原生質(zhì)體50ngDNA,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-106/mgDNA,l-DNA轉(zhuǎn)染107-108/mgDNA,電穿孔轉(zhuǎn)化106-109/mgDNA,轉(zhuǎn)化細胞的擴增,擴增操作,轉(zhuǎn)化細胞的擴增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細胞的短時間培養(yǎng)。在實驗時，擴增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的37℃培養(yǎng)一個小時原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程l噬菌體轉(zhuǎn)染后的30℃培養(yǎng)等，均屬擴增操作,轉(zhuǎn)化細胞的擴增,擴增操作的目的,增殖轉(zhuǎn)化細胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細胞用于篩選程序,擴增和表達載體分子上的標記基因，便于篩選,表達外源基因，便于篩選和鑒定,,,,C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）,4基因工程的操作過程,載體遺傳標記檢測,,克隆DNA序列檢測,,外源基因產(chǎn)物檢測,,C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）,4基因工程的操作過程,由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子,,,,,,,,,,,轉(zhuǎn)化子,重組子,目的重組子,載體遺傳標記檢測,抗藥性篩選法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,ROP,,,,,,,,,ROI,,,,,,,,,,,,,,SalI,BamHI,Tc,r,,PvuI,PstI,PstI,EcoRI,ClaI,HindIII,HindII,BalI,Ap,r,抗藥性篩選法的基本原理：,pBR322,4363bp,ori,,,,,,,抗藥性篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非,轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子,將外源DNA片段插在EcoRI位點：,非重組子呈Apr、Tcr,重組子呈Apr、Tcr,將外源DNA片段插在BamHI位點：,非重組子呈Apr、Tcr,重組子呈Apr、Tcs,載體遺傳標記檢測,抗藥性篩選法,抗藥性篩選法的基本操作：,先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板,再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至,含有Ap和Tc的平板上,在Ap平板上生長、但在Ap和Tc,平板上不長的轉(zhuǎn)化子即為,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ap,Ap+Tc,,,影印,挑選,,,,重組子,載體遺傳標記檢測,營養(yǎng)缺陷型篩選法,營養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理：,營養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，一般不能區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子,載體遺傳標記檢測,營養(yǎng)缺陷型篩選法,常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標記：,哺乳動物細胞中存在兩條dTTP的合成途徑：,用于大腸桿菌的營養(yǎng)標記基因常選用色氨酸生物合成基因trp+,用于高等哺乳動物細胞的營養(yǎng)標記基因常使用胸腺嘧啶核苷激,酶基因tk，相應(yīng)的受體細胞則選擇tk-缺陷型,dCDP,,dTDP,,dTTP,TR,dTMP,dTDP,dTTP,AP,,,,,TK,AP氨基喋呤,TK胸腺嘧啶核苷激酶,載體遺傳標記檢測,顯色篩選法,顯色篩選法的基本原理：,顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產(chǎn)物能使細胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應(yīng)）等,載體遺傳標記檢測,顯色篩選法,顯色篩選法的基本操作：,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ap+X-gal,,重組子（Apr+lacZ-）,將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標記基因內(nèi)部，使之滅活，此時重組子呈Apr、lacZ-，淡黃色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍色菌落,克隆DNA序列檢測,限制性酶切圖譜法,所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入的外源DNA片段進行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時，工作量極大，實驗成本也高。,克隆DNA序列檢測,限制性酶切圖譜法,全酶解圖譜法：,,,,,,,,B,B,E,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,區(qū)分重組子與非重組子,用BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA,電泳觀察酶解產(chǎn)物片段,重組子：2.7kb+4.0kb,非重組子：2.7kb,如果外源DNA片段也是2.7kb，最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然,后通過其長度來鑒定其是否為重組子,克隆DNA序列檢測,限制性酶切圖譜法,全酶解圖譜法：,,,,,,,S,S,B,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,區(qū)分重組子與非重組子,如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位點處，原則上也可用SphI酶解鑒定，但這樣做很不經(jīng)濟，因為SphI非常昂貴（每100單位50美元）。用HindIII和EcoRI聯(lián)合酶解同樣可以達到目的，但這兩種酶的價格只及SphI的1/50,,克隆DNA序列檢測,限制性酶切圖譜法,全酶解圖譜法：,,,,,,,,B,B,E,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,區(qū)分目的重組子與非目的重組子,用EcoRI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA,目的重組子：3.0kb+3.7kb,或者：1.0kb+5.7kb,用PstI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA,目的重組子：3.2kb+3.5kb,或者：0.8kb+5.9kb,克隆DNA序列檢測,限制性酶切圖譜法,全酶解圖譜法：,,,,,,,B,B,E,4.0kb,2.0kb,2.0kb,區(qū)分目的重組子與非目的重組子,對圖示的克隆片段，轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA用EcoRI酶切開后，只出現(xiàn)2.0kb和2.7kb兩條帶子，實際上2.0kb的條帶中含有兩種不同的分子,,,,,,2.7kb,2.0kb,,E,克隆DNA序列檢測,限制性酶切圖譜法,部分酶解圖譜法：,該重組質(zhì)粒經(jīng)酶解后，分別得到下列幾組數(shù)據(jù)：,BamHI全酶解：0.60.81.83.4kb,BamHI+EcoRI全酶解：0.60.81.81.22.2kb,其中，1.2kb片段的存在表明該片段位于一端,BamHI部分酶解：1.42.64.0kb,其中，1.4kb的片段必為0.6kb和0.8kb兩片段，表,明兩者是連在一起的；同理，2.6kb的片段必為0.8,kb和1.8kb兩片段，表明兩者是連在一起的；最后，,4.0kb的片段必為0.6kb和3.4kb兩片段，表明兩者,是連在一起的,克隆DNA序列檢測,菌落噬菌斑原位雜交法,菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設(shè)計并合成探針，以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子。其中，DNA同源序列之間的特異性互補雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù),,克隆DNA序列檢測,菌落噬菌斑原位雜交法,菌落原位雜交法的基本操作：,影印,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板,洗滌,雜交,感光,用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜,用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜,80℃烘干固定影印薄膜,薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫,用SSC-SDS液洗滌雜交薄膜,用X光膠片覆蓋薄膜感光,克隆DNA序列檢測,菌落噬菌斑原位雜交法,雜交探針的制備：,用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條件：,單鏈結(jié)構(gòu)（雙鏈DNA可用堿變性）,足夠長度（至少12個堿基）,內(nèi)部不含互補區(qū),探針的制備方法或來源包括：,人工合成,cDNA合成,同源序列,mRNA,,,,,,,,克隆DNA序列檢測,菌落噬菌斑原位雜交法,雜交探針的標記：T4-PNP介導(dǎo)的末端標記,,5‘HO,,3‘HO,OH3‘,OH5‘,,T4-PNP,Mg2+pppATP（g-32P-ATP）,,5‘p,,3‘HO,OH3‘,p5‘,克隆DNA序列檢測,菌落噬菌斑原位雜交法,雜交探針的標記：逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄標記,3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT,5’mRNA,,反轉(zhuǎn)錄酶,Mg2+dNTP+pppdATP（a-32P-dATP）,5’TTTTTTTTTTT,5’mRNA,3’cDNA,3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT,5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGGCTTGACTAAATCCGA,克隆DNA序列檢測,菌落噬菌斑原位雜交法,雜交探針的標記：ABC熒光標記,,,,,,,,,,,,GCTTGAGCAGTAACCTG,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,熒光胺,,Biotin生物素,,Avidin,生物素結(jié)合蛋白,,烷烴連接臂,克隆DNA序列檢測,菌落噬菌斑原位雜交法,雜交探針的標記：ABC顯色酶標記,,,,,,GCTTGAGCAGTAACCTG,顯色酶,,Biotin生物素,,Avidin生物素結(jié)合蛋白,,烷烴連接臂,,,,,,,,,,,,,生色底物,顏色產(chǎn)物,克隆DNA序列檢測,菌落噬菌斑原位雜交法,雜交探針的標記：地高辛系統(tǒng)標記,,,,,,dUTP-連接臂-甾醇半抗原,digoxigeninDIG,抗體-顯色酶交聯(lián)復(fù)合物,克隆DNA序列檢測,DNA序列分析法,雙脫氧末端終止測序法的基本原理：,,,DNA序列測定是精確鑒定目的基因的重要手段，目前國際上流行采用Sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法測定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反應(yīng)的進程中，通過位點特異性終止測定DNA序列其關(guān)鍵技術(shù)有：,DNA鏈聚合反應(yīng)時的定點隨機中斷（ddNTP）,聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨率（600bp/601bp）,電腦自動檢測、記錄、編輯程序,用于DNA測序的專一性試劑盒（Kit）,,,,,克隆DNA序列檢測,DNA序列分析法,雙脫氧末端終止測序法的基本操作：,,,,,,,DNA聚合反應(yīng),聚丙烯酰胺凝膠電泳,,,,克隆DNA序列檢測,DNA序列分析法,雙脫氧末端終止測序法的基本反應(yīng)：,,,,,Klenow,OH3,5P,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,T,dNTP+ddATP,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,T,T,T,T,T,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,OH3,5P,,,,,,,,,,,,A,G,T,C,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA,外源基因產(chǎn)物檢測,蛋白質(zhì)生物功能測定法,淀粉酶目的基因的鑒定：,淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。將難溶,淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。將難溶于水,的淀粉加入固體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基呈混濁狀。將,待鑒定的重組克隆涂布在此培養(yǎng)基上，含目的基因的目的重組子可,其表達的淀粉酶分泌出胞外，并均勻擴散，同時降解淀粉為可溶性,的多糖或單糖。因此，目的重組子菌落周圍會形成透明圈。如果透,明圈不明顯，還可往培養(yǎng)板上噴碘，使淀粉所在區(qū)域呈藍色本底，,易于辨認。,蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用類似的方法進行鑒定,外源基因產(chǎn)物檢測,蛋白質(zhì)生物功能測定法,抗菌素抗性基因的鑒定：,抗菌素抗性基因表達的蛋白質(zhì)能使受體細胞產(chǎn)生對該抗生素的抗性。據(jù)此，只需往培養(yǎng)板中加入適量抗生素，理論上長出的菌落即是含有目的基因的目的重組子在實際操作過程中，由于抗生素有時會誘導(dǎo)受體細胞產(chǎn)生抗性，因此必須從抗性重組克隆中抽出重組質(zhì)粒，二次轉(zhuǎn)化受體細胞。如果此時轉(zhuǎn)化平板上出現(xiàn)大量的抗性菌落，即可認為這種抗性確由目的基因的編碼產(chǎn)物產(chǎn)生,外源基因產(chǎn)物檢測,蛋白質(zhì)生物功能測定法,抗菌素抗性基因的鑒定：,,,,,,,,,,,,,,,,,,,目的重組子,,誘導(dǎo)抗性,,,,抽取重組質(zhì)粒,再次轉(zhuǎn)化,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,外源基因產(chǎn)物檢測,蛋白質(zhì)生物功能測定法,DNA結(jié)合蛋白編碼基因的鑒定：,,影印,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,用聚乙烯薄膜影印裂解平板,洗滌,雜交,感光,輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定,80℃烘干固定影印薄膜,與探針溶液中雜交,洗滌、干燥、感光,用氯仿蒸汽或烈性噬菌體噴灑克隆平板,聚乙烯膜,探針選用能與,目標蛋白特異,性結(jié)合的DNA,片段,外源基因產(chǎn)物檢測,蛋白質(zhì)生物功能測定法,雜交釋放轉(zhuǎn)譯鑒定：,,,,,,,,,合并,變性,掛柱,制備,上樣,淋洗,洗脫,翻譯,測活,重組DNA,單鏈DNA,mRNA,雜交的mDNA,蛋白質(zhì),蛋白質(zhì),無細胞體外翻譯系統(tǒng)：麥胚提取物、網(wǎng)織紅細胞提取物,外源基因產(chǎn)物檢測,蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法,放射免疫原位雜交鑒定：,,影印,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,用固定了特異性抗體的聚乙烯薄膜影印,洗滌,與I125標記的IgG保溫,感光,輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定,與I125標記的IgG保溫,洗滌、干燥、感光,用氯仿蒸汽或烈性噬菌體噴灑克隆平板,含抗體的聚乙烯膜,裂解平板,,外源基因產(chǎn)物檢測,蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法,免疫沉淀鑒定：,在瓊脂培養(yǎng)基中加入目標蛋白的特異性抗體,,然后涂布轉(zhuǎn)化液,,,37℃培養(yǎng),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,經(jīng)培養(yǎng)后，目的重組子菌落變會分泌出目標,蛋白，后者與特異性抗體發(fā)生免疫沉淀,反應(yīng)，在菌落周圍形成白色的圓斑,此法簡便快速，但靈敏度低，抗體消耗量大,外源基因產(chǎn)物檢測,聚丙烯酰胺凝膠電泳法,如果待篩選鑒定的目標蛋白既不能測定生物活性，又無現(xiàn)成的抗體使用，則可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行粗略的篩選,,