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1、 Genetic Recombination and Genetic Engineering第第 十十 四四 章章目 錄第第 一一 節(jié)節(jié)DNA的重組的重組 DNA RecombinationDNA重組重組接合作用接合作用 (conjugation)轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 (transformation)轉(zhuǎn)導作用轉(zhuǎn)導作用 (transduction)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 座座 (transposition)同源重組同源重組 (homologous recombination)位點特異的重組位點特異的重組(site-specific recombination)發(fā)生在同源序列間的重組稱為發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重
2、組同源重組(homologous recombination)，又稱，又稱基本重組基本重組。是最基本的。是最基本的DNA重組方式，重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。鏈或雙鏈片段的交換。 以以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。模型。一、同源重組Holliday模型中，同源重組主要模型中，同源重組主要4個關鍵步驟個關鍵步驟 兩個同源染色體兩個同源染色體DNA排列整齊排列整齊一個一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個的一條鏈斷裂、并與另一個
3、DNA對應的鏈連接，對應的鏈連接，形成形成Holliday中間體中間體通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNAHolliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：分別為：片段重組體片段重組體(patch recombinant)拼接重組體拼接重組體(splice recombinant) 片段重組體片段重組體 （見模型圖左邊產(chǎn)物）：（見模型圖左邊產(chǎn)物）： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體拼接重
4、組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：（見模型圖右邊產(chǎn)物）： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本自不同親本DNA。 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵擾侵擾(recA)分支遷移分支遷移 (recA) 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶連接酶53 5 3 5 3 5 35 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 目 錄Holiday中間體中間體53535353535553
5、335 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶連接酶 DNA連接酶連接酶片段重組體片段重組體拼接重組體拼接重組體目 錄二、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移至另一細胞（細菌）的從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移至另一細胞（細菌）的DNA轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移稱為稱為接合作用接合作用(conjugation)?？山雍腺|(zhì)粒如可接合質(zhì)粒如 F 因子因子(F fact
6、or) 質(zhì)粒質(zhì)粒 細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子分子（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動獲取或人為地供給外源通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 (transformation)。 例：例：溶菌時，裂解的溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。片段被另一細菌攝取。目 錄（三）轉(zhuǎn)導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的
7、DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導作用轉(zhuǎn)導作用(transduction)。噬菌體的生活史噬菌體的生活史溶菌生長途徑溶菌生長途徑(lysis pathway)溶源菌生長途徑溶源菌生長途徑(lysogenic pathway)例目 錄目 錄三、位點特異重組三、位點特異重組位點特異重組位點特異重組(site-specific recombination) 是由整合酶催化，是由整合酶催化，在兩個在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。序列的特異位點間發(fā)生的整合。例例 （一）一）噬菌體噬菌體DNA的整合的整合噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色
8、體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識別、整合反發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的的長末端重復序列長末端重復序列(long terminal repeat, LTR)。 例例（二）細菌的特異位點重組（二）細菌的特異位點重組沙門氏菌沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變 hix為反向重復序列，它們之間的為反向重復序列，它們之間的H片段可在片段可在Hin控制控制下進行特異位點重組下進行特異位點重組(倒位倒位)。H片段上有兩個啟動子片段上有兩個啟動子P，其，其一驅(qū)動一驅(qū)動hin基因表達，另一正向時驅(qū)動基因表達，另一正向時驅(qū)
9、動H2和和rH1基因表達，基因表達，反向反向(倒位倒位)時時H2和和rH1不表達。不表達。rH1為為H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重組酶重組酶轉(zhuǎn)位片段轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA啟動序列啟動序列H1啟動序列啟動序列沙門氏菌沙門氏菌H H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變例例（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈，由兩條輕鏈(L鏈鏈)和兩條重鏈和兩條重鏈(H鏈鏈)組組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個
10、編碼輕鏈( 和和 )，一個編碼重鏈。，一個編碼重鏈。 輕鏈的基因片段：輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C 重鏈重鏈(IgH)基因的基因的V-D-J重排和輕鏈重排和輕鏈(IgL)基因的基因的V-J重排均重排均發(fā)生在特異位點上。在發(fā)生在特異位點上。在V片段的下游，片段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號序列的兩側(cè)均存在保守的重組信號序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基因。此重排的重組酶基因rag (recombination activating gene
11、)共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重組信號序列基因片段V片段片段J片段片段RSSRSS間插間插DNAOHOHVJ單鏈切開單鏈切開RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應單鏈切開單鏈切開轉(zhuǎn)移核苷酸轉(zhuǎn)移核苷酸修復、連接修復、連接免疫球蛋白基因重排過程免疫球蛋白基因重排過程目 錄四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導的基因移位或重排稱為由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座(transposition)。插入序列插入序列(insertion sequences, IS
12、)組成：組成：二個分離的反向重復二個分離的反向重復(inverted repeats, IR)序列序列特有的正向重復序列特有的正向重復序列 一個轉(zhuǎn)座酶（一個轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因編碼基因 IRTransposase GeneIR發(fā)生形式：發(fā)生形式：保守性轉(zhuǎn)座保守性轉(zhuǎn)座(conservative transposition)復制性轉(zhuǎn)座復制性轉(zhuǎn)座(duplicative transposition)（一）插入序列轉(zhuǎn)座插入序列的復制性轉(zhuǎn)座插入序列的復制性轉(zhuǎn)座目 錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子(transposons) 可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復序列。點
13、的分散重復序列。 轉(zhuǎn)座子組成：轉(zhuǎn)座子組成：反向重復序列反向重復序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene有用基因有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導的轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導的轉(zhuǎn)座目 錄第第 二二 節(jié)節(jié) 重組重組DNA技術技術DNA Recombination Technique 重組重組DNA技術的發(fā)展史技術的發(fā)展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗的豌豆雜交試驗1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗1973年年 美國斯坦福大學的科學家構建美國斯坦福大學的科學家構建第一個第一個重組重
14、組DNA分子分子1977年年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遺傳工程公司，專門應用重遺傳工程公司，專門應用重組組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年年 開始建造開始建造第一家第一家應用重組應用重組DNA技術生產(chǎn)胰島素的工廠技術生產(chǎn)胰島素的工廠1997年年 英國羅林研究所成功的克隆了英國羅林研究所成功的克隆了多莉多莉 相關概念相關概念 DNA克隆克隆 工具酶工具酶 目的基因目的基因 基因載體基因載體 基本原理基本原理 重組重組DNA技術與醫(yī)學的關系技術與醫(yī)學的關系本節(jié)主要內(nèi)容本節(jié)主要內(nèi)容克隆克隆(clone)來
15、自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為獲取同一拷貝的過程稱為克隆化克隆化(cloning)，即，即無性繁殖無性繁殖。（一） DNA克隆技術水平：技術水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 細胞克隆細胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮﹤€體克隆（動物或植物）DNA克隆克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體）與載體DNA接接合成一具有自我復制能力的合成一具有
16、自我復制能力的DNA分子分子復制子復制子(replicon)，繼而，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱分子，也稱基因克隆或重組基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。 生物技術工程生物技術工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程等工程等目的目的 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程基因工程
17、(genetic engineering) 實現(xiàn)基因克隆所用的方實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱法及相關的工作稱基因工程，又稱重組重組DNA工藝學工藝學。（二）工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶重組重組DNA技術中常用的工具酶技術中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸二酯鍵
18、，使羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切切口封合或使兩個口封合或使兩個DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補填補3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活外切活性，而無性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標記末端標記等等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進行填補，標
19、記或進行填補，標記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標記探針羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3 羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶定義定義限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是是識別識別DNA的的特異序列特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBa
20、m H作用作用與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源外源DNA， 保護自身保護自身DNA。分類分類、（基因工程技術中常用（基因工程技術中常用型）型）第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名命名Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種
21、酶類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回文結構回文結構(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口同功異源酶同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱酶稱同功異源酶同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同尾酶同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割有些限制性內(nèi)
22、切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶同尾酶。這兩個相同的。這兩個相同的粘性末端稱為粘性末端稱為配伍未端配伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A（三）目的基因 cDNA (complementary DNA) 基因組基因組DNA (genomic DNA)（四）基因載體定義定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。分子。常
23、用載體常用載體質(zhì)粒質(zhì)粒DNA噬菌體噬菌體DNA病毒病毒DNA克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體克隆載體。表達載體表達載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為計的載體稱為表達載體表達載體。載體的選擇標準載體的選擇標準 能自主復制；能自主復制； 具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定； 有克隆位點（外源有克隆位點（外
24、源DNA插入點），常具有多個單一酶切插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；位點，稱為多克隆位點； 分子量小，以容納較大的外源分子量小，以容納較大的外源DNA。1. 1. 質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)特點特點 能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息, , 會賦會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。予宿主細胞一些遺傳性狀。 目 錄噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNA克?。┛寺。〦MBL系列（置換型，適用基因組克隆）系列（置換型，適用基因組克隆）2. 噬菌體噬菌體(phage) M13噬菌體噬菌體DN
25、A改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列3. 粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒(cosmid)酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)細菌人工染色體細菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)動物病毒動物病毒DNA改造的載體改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他其他二、重組DNA技術基本原理基本原理基本原理目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導入受體菌導入受體菌外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇
26、和構建克隆載體的選擇和構建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達克隆基因的表達 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過過 程程目 錄（一）目的基因的獲取1. 化學合成法化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。2.基因組基因組DNA文庫文庫(genomic DNA library)3. cDNA文庫文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR) （見第（見第22章）章） * 化學合成法獲取目的基因化學合成法獲取目的基因由
27、已知氨基酸序列推測可能的由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列序列組織或細胞染色體組織或細胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組載體所攜帶的所有基因組DNA的集合的集合* 從基因組從基因組DNA文庫獲取文庫獲取目的基因目的基因目 錄限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限
28、制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應連接反應 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫基因文庫目 錄mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復制復制* 從從cDNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T目 錄（三）外源基因與載體的連接1. 1. 粘
29、性末端連接粘性末端連接方式：方式：(1)同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接不同限制酶切位點連接配伍末端連接配伍末端連接非配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構建Bam H切割反應切割反應 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GC C T A GGC C T A GGC C T A GGC C T A GG A T C CGG A T C CGG A T C CGG A T C CG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGG
30、ATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接目 錄不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接G A A TTCCTTA A GA G A TCTTCTA G AEco R切割位點切割位點GC T T A AAT C T A GA A T T CGG A T C TABg l切割位點切割位點A A T T CGAT C T A GA A TTCGG A TC TAAATTCGAT
31、CTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GC T T A AAT C T A GA A T T CGG A T C TAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的連接配伍末端的連接情況和同一限制酶切情況和同一限制酶切位點連接相似。位點連接相似。目 錄2. 平端連接平端連接適用于：適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連目 錄3.
32、同聚物加尾連接同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。連接。5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機械剪切限制酶或機械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)
33、nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體目 錄4. 4. 人工接頭人工接頭(linker)連接連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接而進行粘端連接。 人工接頭及其應用人工接頭及其應用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目 錄受體菌條件受體菌條件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent) 導入方式導入方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)感染感染 (inf
34、ection)（四）重組DNA導入受體菌（五）重組體的篩選（五）重組體的篩選 1. 直接選擇法直接選擇法(1) 抗藥性標記選擇抗藥性標記選擇(2) 標志補救標志補救(marker rescue)(3) 分子雜交法分子雜交法原位雜交原位雜交Southern印跡印跡 2. 免疫學方法免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等如免疫化學方法及酶免檢測分析等( (插入失活法插入失活法) )抗藥性標記選擇抗藥性標記選擇目 錄組氨酸缺陷組氨酸缺陷型大腸桿菌型大腸桿菌無組氨酸無組氨酸的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因酸脫水酶基因促進組氨酸合成促進組氨酸合成 DNADNA重組體重組體標志補
35、救標志補救目 錄 互補互補目 錄 互互補補的的檢檢測測目 錄原位原位雜交雜交目 錄Southern印跡印跡目 錄雞的雞的肌球蛋白的克隆和檢出肌球蛋白的克隆和檢出目 錄重組重組DNADNA技術操作過程可形象歸納為技術操作過程可形象歸納為 小小 結結分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 重組重組DNA技術操作的主要步驟技術操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制
36、酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基因目的基因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交目 錄表達體系的建立表達體系的建立表達載體的構建表達載體的構建受體細胞的建立受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達1. 原核表達體系原核表達體系 （E.coli表達體系最為常用）表達體系最為常用）標準：標準：選擇標志選擇標志強啟動子強啟動子 翻譯調(diào)控序列翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點多接頭克隆位點E.coli表達體系的不足表達體系的不足 不宜表達真核基因組不宜表達真
37、核基因組DNA不能加工表達的真核蛋白質(zhì)不能加工表達的真核蛋白質(zhì)表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達大量可溶性蛋白很難表達大量可溶性蛋白大鼠胰島素原大鼠胰島素原cDNA的表達和分泌的表達和分泌目 錄優(yōu)點：優(yōu)點：可表達克隆的可表達克隆的cDNA及真核基因組及真核基因組DNA可適當修飾表達的蛋白質(zhì)可適當修飾表達的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物分區(qū)域積累表達產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點：缺點：操作技術難、費時、經(jīng)濟操作技術難、費時、經(jīng)濟轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 將表達載體導入真核細胞的過程將表達載體導入真核細胞的過程方法：方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導轉(zhuǎn)染葡聚糖
38、介導轉(zhuǎn)染電穿孔電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射顯微注射 2. 真核表達體系真核表達體系 酵母、昆蟲、乳類動物細胞酵母、昆蟲、乳類動物細胞表達載體表達載體pFASTBACI 的物理圖譜的物理圖譜目 錄目 錄（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認識疾病的分子機根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認識疾病的分子機制。制。三、重組技術與醫(yī)學的關系（二）生物制藥 重組重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)產(chǎn) 品品功功 能能組織胞漿素原激活劑組織胞漿素原激活劑抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促進凝血促進凝血顆粒細胞顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成剌激白細胞
39、生成促紅細胞生成素促紅細胞生成素剌激白細胞生成剌激白細胞生成生長因子生長因子(bFGF, EGF)刺激細胞生長與分化刺激細胞生長與分化生長素生長素治療侏儒癥治療侏儒癥胰島素胰島素治療糖尿病治療糖尿病干擾素干擾素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些腫瘤抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素白細胞介素激活、剌激各類白細胞激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗組織損傷抗組織損傷單克隆抗體單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)預防乙肝預防乙肝口服重組口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗亞單位菌體霍亂菌苗
40、預防霍亂預防霍亂目 錄基因診斷基因診斷(genetic diagnosis)是利用分子生物學及分子遺傳利用分子生物學及分子遺傳的技術和原理，在的技術和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。的置換、缺失或插入等突變。（三）基因診斷基本過程基本過程區(qū)分或鑒定區(qū)分或鑒定DNA的異常的異常分離、擴增待測的分離、擴增待測的DNA片斷片斷標準標準. 能正確擴增靶基因；能正確擴增靶基因；. 能準確區(qū)分單個堿基的差別；能準確區(qū)分單個堿基的差別；. 本底或噪聲低，不干擾本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定的鑒定;. 便于完全自動化操作，適合大面積、大
41、人群普查。便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查。（四）基因治療定義定義基因治療基因治療(gene therapy)是向有功能缺陷的細胞補充相應是向有功能缺陷的細胞補充相應功能的基因，以糾正或補償其基因的缺陷，從而達到治療的功能的基因，以糾正或補償其基因的缺陷，從而達到治療的目的。目的。方式方式體細胞基因治療體細胞基因治療 (somatic cell gene therapy)性細胞基因治療性細胞基因治療 (germ line gene therapy)1. 產(chǎn)前診斷產(chǎn)前診斷2. 攜帶者測試攜帶者測試3. 癥候前診斷癥候前診斷4. 遺傳病易感性遺傳病易感性（五）遺傳疾病的預防可接合質(zhì)粒如可
42、接合質(zhì)粒如 F 因子因子(F factor) 質(zhì)粒質(zhì)粒 細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子分子四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導的基因移位或重排稱為由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座(transposition)。DNA克隆克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體）與載體DNA接接合成一具有自我復制能力的合成一具有自我復制能力的DNA分子分子復制子復制子(replicon)，繼而，繼而通過轉(zhuǎn)化或
43、轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱分子，也稱基因克隆或重組基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。 （三）目的基因 cDNA (complementary DNA) 基因組基因組DNA (genomic DNA)（四）基因載體定義定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。分子。常用載體常用載體質(zhì)粒質(zhì)粒DNA噬菌體噬菌體DNA病毒病毒DNA載體的
44、選擇標準載體的選擇標準 能自主復制；能自主復制； 具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定； 有克隆位點（外源有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；位點，稱為多克隆位點； 分子量小，以容納較大的外源分子量小，以容納較大的外源DNA。重組重組DNADNA技術操作過程可形象歸納為技術操作過程可形象歸納為 小小 結結分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 1. 原核表達體系原核表達體系 （E.coli表達體系最為常用）表達體系最為常用）標準：標準：選擇標志選擇標志強啟動子強啟動子 翻譯調(diào)控序列翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點多接頭克隆位點E.coli表達體系的不足表達體系的不足 不宜表達真核基因組不宜表達真核基因組DNA不能加工表達的真核蛋白質(zhì)不能加工表達的真核蛋白質(zhì)表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達大量可溶性蛋白很難表達大量可溶性蛋白
沈陽藥科大學生物化學—— 基因工程PPT課件
