掃描電子顯微鏡(制樣).ppt
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掃描電子顯微鏡(ScanningElectronMicroscopySEM),材化0801孟巖李民王洪志張俊,,掃描電子顯微鏡(ScanningElectronMicroscopySEM)1942年第一臺掃描電子顯微鏡60年代分辨率和圖像質(zhì)量的大大的改善80年代廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域90年代高分辨型掃描電鏡的分辨率0.2nm,,,掃描電鏡與透射電鏡結(jié)構(gòu)比較1照明系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和原理基本相同都是由電子槍和聚光鏡等來完成照明工作2SEM沒有中間鏡和投影鏡,但增加了二次電子探測器、掃描偏轉(zhuǎn)線圈、顯像管等3SEM樣品室比TEM大,位置不同4SEM與TEM真空系統(tǒng)、水冷系統(tǒng)和電源系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能基本相似。,●如細菌、血細胞、培養(yǎng)細胞的整體形態(tài)、大小、表面突起和細胞間的相互關(guān)系●消化道、血管等空腔組織的表面結(jié)構(gòu)●骨等硬組織形貌以及生物材料的形狀結(jié)構(gòu)等,景深長,視野廣、圖像富有立體感用于觀察組織細胞的表面和斷面的形貌,掃描電鏡特點,1、電子光學(xué)系統(tǒng)(鏡筒)2、信號檢測及顯示系統(tǒng)3、電源和真空系統(tǒng),一、掃描電鏡的基本結(jié)構(gòu),第一節(jié)掃描電鏡的結(jié)構(gòu)和工作原理,,,鏡中圖像,電子槍和透鏡:電子槍產(chǎn)生電子經(jīng)透鏡會聚成電子束(探針)投射在樣品表面(約10nm)掃描線圈:(偏轉(zhuǎn)線圈)位于透鏡和物鏡之間,有兩組掃描線圈(在顯像管也有兩組)作用是控制電子束在X、Y兩個方向規(guī)律的運動樣品室:樣品室較大,位于物鏡的下方,室內(nèi)有樣品臺、二次電子檢測器、抽氣管道和更換樣品的窗口,(一)電子光學(xué)系統(tǒng)(鏡筒),二次電子探測器:由收集器、閃爍體、光導(dǎo)管和光電倍增管成二次電子探器是掃描電鏡的眼睛,其作用是收集掃描樣品發(fā)生的二次電子信號并將它變成顯像管的圖像信號顯示系統(tǒng):顯像管及電路組成,將電信號處理成最終影像,(二)信號檢測及顯示系統(tǒng),(三)電源和真空系統(tǒng),&電子槍發(fā)射電子,經(jīng)透鏡聚焦形成很細的電子束班(約10nm)稱電子探針&電子探針打在樣品表面,把樣品表面原子外層的電子打落形成二次電子(二次電子的產(chǎn)生率主要與樣品表面材料的性質(zhì)及入射角的角度有關(guān),入射角越大,二次電子的發(fā)射就越多),,二、掃描電鏡的工作成像原理,,二次電子信息被收集轉(zhuǎn)換和放大,變成可供觀察和拍攝的影像由于二次電子產(chǎn)生的多少與電子束入射角度及樣品表面的起伏有關(guān),所以在熒光屏上會得到樣品表面形貌的立體圖像,,,,,,,,,,,生物樣品分為二大類:含水組織含水量少的組織,第二節(jié)掃描電子顯微鏡樣品制備技術(shù),,,樣品臺,此類樣品一般含有硅質(zhì)、鈣質(zhì)、角質(zhì)等成分表面不易變形和收縮(如毛發(fā)、牙齒等)這類標(biāo)本處理較簡單,只需表面清潔,就可直接噴鍍金屬膜進行電鏡觀察,1、含水量少的硬組織,這類組織在生物樣品中占多數(shù)大多數(shù)生物組織的含水量都在80%以上必須對樣品進行特殊處理:經(jīng)固定、脫水、干燥、鍍膜導(dǎo)電等過程,2、另一類是含水量較高的組織,樣品制備過程中必須注意的三個關(guān)鍵技術(shù):1、生物樣品觀察面的暴露盡可能暴露出所觀察組織的原貌2、生物樣品的干燥在脫去組織中水分的同時又不引起形態(tài)的變形3、生物樣品的導(dǎo)電使樣品具有導(dǎo)電性并能得到清晰的二次電子像,更多內(nèi)容歡迎蒞臨天馬行空官方博客:,取材充分暴露并保護好觀察面↓(10mm25mm)清洗用生理鹽水仔細漂洗觀察面↓固定2%戊二醛和1%鋨酸固定↓脫水丙酮脫水,醋酸異戊酯置換↓干燥臨界點干燥↓鍍膜離子濺射鍍膜或真空鍍膜↓SEM觀察,常規(guī)樣品制備程序,取材的基本要求和TEM樣品制備相同樣品可大一些(8~10mm2,高度可達5mm)掃描觀察的部位常常是標(biāo)本的表面如氣管表面、胃、腸粘膜表面等要把觀察的結(jié)構(gòu)暴露出來對易卷曲的樣品可固定在濾紙上以充分暴露待觀察的組織表面,,,,(一)取材,掃描電鏡對樣品表面的清潔要求十分嚴格表面血液、粘液等必須清洗干凈可采用以下方法:1.等滲生理鹽水或緩沖液仔細地漂洗或用針筒反復(fù)沖洗2.對粘液物質(zhì)過分粘稠,難以去除的標(biāo)本可采用酶消化方法進行處理3.用5%的蘇打水清洗,(二)清洗,清洗后應(yīng)立即固定由于樣品體積較大,固定時間應(yīng)適當(dāng)延長逐級增高濃度的丙酮或乙醇脫水然后進入中間液(醋酸異戊酯:與CO2互溶性很好)置換,(三)固定,(四)脫水,★樣品經(jīng)脫水后,仍被脫水劑占有必須除去脫水劑,使其真正干燥★干燥會引起樣品體積變化和表面改變,要保存生物樣品表面的微細結(jié)構(gòu)又要使生物樣品達到干燥的目的就要避免表面張力的影響現(xiàn)有的方法:1、臨界點干燥法2、冷凍干燥法3、空氣干燥法等。,(五)干燥,▲目的是避免表面張力的影響,較好地保存樣品的微細結(jié)構(gòu)▲利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)時表面張力等于零的特性,使樣品的液體完全氣化并以氣體方式排掉,來達到標(biāo)本干燥的目的,,,1.臨界點干燥法,物質(zhì)有固體、液態(tài)和氣態(tài)三種狀態(tài)通常以單相狀態(tài)存在,溫度和壓力改變時互相轉(zhuǎn)化每一種物質(zhì)都有所謂“臨界狀態(tài)”(即臨界溫度,此時,液體的表面張力系數(shù)為零),物質(zhì)不能以液態(tài)繼續(xù)存而要變成氣體,這時的氣體無論在多大的壓強下都不會變成液體,利用液體CO2(臨界狀態(tài)31℃)置換醋酸異戊酯,原理:,生物樣品經(jīng)過脫水、干燥處理后,其表面不帶電,導(dǎo)電性能也差,當(dāng)入射電子束打到標(biāo)本上時,就會產(chǎn)生電荷的積累,形成充電和放電效應(yīng),影響周圍電子束的掃描和二次電子的發(fā)射,嚴重影響成像甚至無法成像因此,必須給標(biāo)本噴鍍一層薄薄的導(dǎo)電金屬,使樣品具有導(dǎo)電性,增加二次電子發(fā)射量,提高樣品的亮度和反差。方法有:1.離子濺射法2.金屬噴鍍法等,(六)鍍膜,☆將需要噴鍍的金屬制成陰極靶,樣品放在陽極上容器內(nèi)抽真空并通入一些惰性氣體如氮、氖等☆兩極間加電場后產(chǎn)生輝光放電↓氣體電離產(chǎn)生的陽離子轟擊陰極金屬靶↓使金屬原子濺射出來在電場的加速下飛向樣品,1.離子濺射法(Ionsputter),,,,,,,●○●○○●○←●○●○●○,,,,,,,,,,,,,,陰極,陽極,樣品,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,氣體,兩極間加電場后,產(chǎn)生輝光放電↓氣體電離產(chǎn)生陽離子轟擊陰極金屬靶↓金屬原子濺射出來飛向樣品,,,,,,,,,,在真空條件下把所要噴鍍的金屬加熱使其在真空下蒸發(fā)并噴射到標(biāo)本表面在樣品表面形成一層金屬膜使樣品導(dǎo)電常用:金、鉑、鈀等,2、金屬噴鍍法,制作人:,孟巖,李民,王洪志,張俊,- 1.請仔細閱讀文檔,確保文檔完整性,對于不預(yù)覽、不比對內(nèi)容而直接下載帶來的問題本站不予受理。
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