生物化學 酶PPT課件

《生物化學 酶PPT課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《生物化學 酶PPT課件（178頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、第一節(jié)第一節(jié) 酶的概念及作用特點酶的概念及作用特點第二節(jié)第二節(jié) 酶的命名和分類酶的命名和分類第三節(jié)第三節(jié) 酶的作用機理酶的作用機理第四節(jié)第四節(jié) 影響酶促反應(yīng)速度的因素影響酶促反應(yīng)速度的因素第五節(jié)第五節(jié) 酶的活性調(diào)節(jié)酶的活性調(diào)節(jié)第六節(jié)第六節(jié) 酶的活力測定及分離提純酶的活力測定及分離提純第七節(jié)第七節(jié) 酶工程簡介酶工程簡介第八節(jié)第八節(jié) 維生素和輔酶維生素和輔酶第1頁/共178頁第一節(jié) 酶的概念及作用特點第2頁/共178頁酶學研究簡史 公元前兩千多年，我國已有釀酒記載。公元前兩千多年，我國已有釀酒記載。 一百余年前，一百余年前，PasteurPasteur認為發(fā)酵是酵母細胞生命活動的結(jié)果。認為發(fā)酵是酵

2、母細胞生命活動的結(jié)果。 18771877年，年，KuhneKuhne首次提出首次提出EnzymeEnzyme一詞。一詞。 18971897年，年，BuchnerBuchner兄弟用不含細胞的酵母提取液，實現(xiàn)了兄弟用不含細胞的酵母提取液，實現(xiàn)了發(fā)酵。發(fā)酵。 19261926年，年，SumnerSumner首次從刀豆中提純出脲酶結(jié)晶。證實酶的首次從刀豆中提純出脲酶結(jié)晶。證實酶的蛋白質(zhì)本質(zhì)蛋白質(zhì)本質(zhì)，獲，獲19461946年諾貝爾獎。年諾貝爾獎。 19821982年，年，CechCech首次發(fā)現(xiàn)首次發(fā)現(xiàn)RNARNA也具有酶的催化活性，提出也具有酶的催化活性，提出核核酶酶(ribozyme)(ribo

3、zyme)的概念。的概念。CechCech等獲得等獲得19891989年諾貝爾化學獎。年諾貝爾化學獎。 19951995年，年，Jack W.SzostakJack W.Szostak研究室首先報道了具有研究室首先報道了具有DNADNA連接連接酶活性酶活性DNADNA片段，稱為片段，稱為脫氧核酶脫氧核酶(deoxyribozyme)(deoxyribozyme)。第3頁/共178頁一、酶的催化特點( (一一) ) 酶與一般催化劑的共性酶與一般催化劑的共性 1 1本身反應(yīng)前后無變化本身反應(yīng)前后無變化 酶與一般催化劑一樣，在化學反應(yīng)前后都沒酶與一般催化劑一樣，在化學反應(yīng)前后都沒有質(zhì)和量的改變。有質(zhì)

4、和量的改變。 2 2不改變化學反應(yīng)平衡常數(shù)不改變化學反應(yīng)平衡常數(shù) 酶只催化熱力學允許的化學反應(yīng)，只能加速酶只催化熱力學允許的化學反應(yīng)，只能加速可逆反應(yīng)的進程，而不改變反應(yīng)的平衡點，作用可逆反應(yīng)的進程，而不改變反應(yīng)的平衡點，作用是縮短反應(yīng)達到平衡所需的時間。是縮短反應(yīng)達到平衡所需的時間。 3 3降低反應(yīng)的活化能降低反應(yīng)的活化能 活化能指的是在一定條件下，能使活化能指的是在一定條件下，能使l l摩爾底摩爾底物全部進入活化態(tài)所需要的自由能物全部進入活化態(tài)所需要的自由能( (卡摩爾卡摩爾) )。第4頁/共178頁反應(yīng)總能量改變反應(yīng)總能量改變 非催化反應(yīng)活化能非催化反應(yīng)活化能 酶促反應(yīng)酶促反應(yīng) 活化能活

5、化能 一般催化劑催一般催化劑催化反應(yīng)的活化能化反應(yīng)的活化能 能能量量 反反 應(yīng)應(yīng) 過過 程程 底物底物 產(chǎn)物產(chǎn)物 酶促反應(yīng)活化能的改變 活化能：底物分子從初態(tài)轉(zhuǎn)變到活化態(tài)所需的能量底物分子從初態(tài)轉(zhuǎn)變到活化態(tài)所需的能量。第5頁/共178頁 （二）酶的催化特性（二）酶的催化特性 1. 1. 高度的催化效率高度的催化效率 酶催化效率比非催化反應(yīng)高酶催化效率比非催化反應(yīng)高10108 8 10 102020倍；倍；比一般催化劑高比一般催化劑高10107 7 10 101313倍。倍。如：碳酸酐酶，每摩爾每分鐘能轉(zhuǎn)化如：碳酸酐酶，每摩爾每分鐘能轉(zhuǎn)化3 35 510107 7摩摩爾底物或每秒鐘爾底物或每秒鐘

6、6 610105 5摩爾底物。摩爾底物。 第6頁/共178頁 2.2.高度專一性高度專一性 作為一種生物催化劑，酶對其作用的底物有一作為一種生物催化劑，酶對其作用的底物有一定的要求，即一種酶只作用于一種或一類特定的底定的要求，即一種酶只作用于一種或一類特定的底物。酶的專一性分為兩大類：物。酶的專一性分為兩大類： 絕對特異性絕對特異性(absolute specificity)(absolute specificity)：只能作只能作用于用于 特定結(jié)構(gòu)的底物，進行一種專一的反應(yīng)，特定結(jié)構(gòu)的底物，進行一種專一的反應(yīng)，生生 成一種特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。成一種特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。 相對特異性相對特異性(rela

7、tive specificity)(relative specificity)：作用于作用于一類一類 化合物或一種化學鍵。化合物或一種化學鍵。第7頁/共178頁立體結(jié)構(gòu)特異性立體結(jié)構(gòu)特異性( (stereostereo specificityspecificity) )：作用于立作用于立 體異構(gòu)體中的一種。體異構(gòu)體中的一種。乳酸脫氫酶的乳酸脫氫酶的底物和酶的三點附著底物和酶的三點附著（tree-point tree-point attachmentattachment）理論。）理論。D(-)D(-)乳酸由于乳酸由于-OH-OH、 -COOH-COOH的的 位置正好相反，因此造成與酶的三個基團不

8、能完成結(jié)合，位置正好相反，因此造成與酶的三個基團不能完成結(jié)合，故而不能受酶的催化。故而不能受酶的催化。 第8頁/共178頁 3 3高度的不穩(wěn)定性，酶易失活高度的不穩(wěn)定性，酶易失活 多數(shù)酶是蛋白質(zhì)。決定酶的作用條件一多數(shù)酶是蛋白質(zhì)。決定酶的作用條件一般應(yīng)在般應(yīng)在溫和溫和的條件下，如中性的條件下，如中性pHpH、常溫和常壓、常溫和常壓下進行。強酸、強堿、高溫條件下易使酶失去下進行。強酸、強堿、高溫條件下易使酶失去活性?；钚?。 第9頁/共178頁 4 4酶的催化活性的可調(diào)節(jié)性酶的催化活性的可調(diào)節(jié)性 酶促反應(yīng)受多種因素的調(diào)控，以適應(yīng)機體對不酶促反應(yīng)受多種因素的調(diào)控，以適應(yīng)機體對不斷變化的內(nèi)外環(huán)境和生命

9、活動的需要。其中包括斷變化的內(nèi)外環(huán)境和生命活動的需要。其中包括三方面的調(diào)節(jié)。三方面的調(diào)節(jié)。 對酶生成與降解量的調(diào)節(jié)對酶生成與降解量的調(diào)節(jié) 酶催化效力的調(diào)節(jié)酶催化效力的調(diào)節(jié) 通過改變底物濃度對酶進行調(diào)節(jié)等通過改變底物濃度對酶進行調(diào)節(jié)等 第10頁/共178頁5. 有的酶需輔助因子 有些酶是復合蛋白質(zhì)，由酶蛋白和非蛋白小分子物質(zhì)組成，后者稱為輔因子，若將它們除去，酶就失去活性。第11頁/共178頁 酶在生活細胞中產(chǎn)生，大部分酶在細胞內(nèi)起催化作用，稱為胞內(nèi)酶。如：線粒體-呼吸酶系 葉綠體-光合系統(tǒng)的酶系 細胞核-核酸合成的酶系 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上和胞質(zhì)溶膠中-蛋白質(zhì)生物合成的酶系 有些酶被分泌到細胞外發(fā)

10、揮作用，如人和動物消化道以及某些細菌所分泌的水解淀粉、脂肪和蛋白質(zhì)的酶，這類酶稱胞外酶。第12頁/共178頁二、酶專一性：決定于酶的活性中心的構(gòu)象和性質(zhì)。1 結(jié)構(gòu)專一性 概念：酶對所催化的分子（底物，Substrate）化學結(jié)構(gòu)的特殊要求和選擇 類別：絕對專一性和相對專一性絕對專一性 有的酶對底物的化學結(jié)構(gòu)要求非常嚴格，只作用于一種底物，不作用于其它任何物質(zhì)。尿素第13頁/共178頁 相對專一性 有的酶對底物的化學結(jié)構(gòu)要求比上述絕對專一性略低一些，它們能作用于一類化合物或一種化學鍵。 1） 鍵專一性 有的酶只作用于一定的鍵，而對鍵 兩端的基團并無嚴格要求。 2）基團專一性 另一些酶，除要求作用

11、于一定的鍵以外，對鍵兩端的基團還有一定要求，往往是對其中一個基團要求嚴格，對另一個基團則要求不嚴格。第14頁/共178頁消化道內(nèi)幾種蛋白酶的專一性第15頁/共178頁消化道蛋白酶作用的專一性第16頁/共178頁2 立體異構(gòu)專一性概念：酶除了對底物分子的化學結(jié)構(gòu)有要求外，對其立體異構(gòu)也有一定的要求類別：旋光異構(gòu)專一性和幾何異構(gòu)專一性旋光異構(gòu)專一性：幾何異構(gòu)專一性： 如：延胡索酸水化酶，只能催化延胡索酸即反丁烯二酸水合生成蘋果酸及其逆反應(yīng)，對順丁烯二酸沒有催化活性。第17頁/共178頁據(jù)酶分子組成分類單純蛋白質(zhì)酶類：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖 核酸酶等結(jié)合蛋白質(zhì)酶類酶蛋白質(zhì)輔助因子（輔酶或輔基）金

12、屬離子金屬有機物小分子有機物三、酶的化學本質(zhì)及類別全酶(holoenzyme）= 酶蛋白 + 輔因子輔酶：與酶蛋白結(jié)合比較松弛，用透析法可以除去的小分子有機物。輔基：與酶蛋白結(jié)合比較緊密，用透析法不易除去的小分子物質(zhì)。往 往以共價鍵和酶蛋白結(jié)合，如細胞色素氧化酶中的鐵卟啉、黃 素蛋白中的FAD等。第18頁/共178頁單體酶：只有一條多肽鏈，屬于這一類的酶很少，一般是催化水解反應(yīng)的酶，相對分子質(zhì)量為13000一35000。寡聚酶：由幾個甚至幾十個亞基組成，這些亞基可以是相同的，也可以是不同的。亞基之間以非共價鍵結(jié)合。相對分子質(zhì)量從35000到幾百萬。多酶復合體：是由幾個酶聚合(嵌合)而成的復合體

13、。相對分子質(zhì)量一般都在幾百萬以上。據(jù)酶蛋白特征分類核酶：具有催化活性的RNA分子。第19頁/共178頁第二節(jié)、酶的分類及命名1. 1. 酶的分類酶的分類* 每一種酶有一個編號,如乳酸脫氫酶（EC1.1.1.27） EC 1. 1. 1. 27 大類 亞類 亞亞類 序號第20頁/共178頁 第21頁/共178頁CH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO(2)(2) 轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶 TransferaseTransferase 轉(zhuǎn)移酶催化基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個底物分子的基團或轉(zhuǎn)移酶催化基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個底物分子的基團或原子轉(zhuǎn)移

14、到另一個底物的分子上。原子轉(zhuǎn)移到另一個底物的分子上。例如，例如， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。第22頁/共178頁H2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OH（3 3）水解酶水解酶 HydrolaseHydrolase水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、蔗糖酶及脂肪酶主要包括淀粉酶、蛋白酶、蔗糖酶及脂肪酶等。等。例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化脂的水解反應(yīng)催化脂的水解反應(yīng)第23頁/共178頁HOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOH(4) 裂解酶裂解酶 Lya

15、seLyase 裂合酶催化從底物分子中移去一個基團或裂合酶催化從底物分子中移去一個基團或 原子原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。 主要包括醛縮酶、水化酶、脫羧酶及脫氨酶等。主要包括醛縮酶、水化酶、脫羧酶及脫氨酶等。 例如，例如， 延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。第24頁/共178頁OCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOH(5) 異構(gòu)酶異構(gòu)酶 IsomeraseIsomerase異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團或原子的重排過程。物分子內(nèi)基團或原子的重排過程。例如，例如，6-

16、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。第25頁/共178頁(6)(6) 合成酶合成酶 Ligase or SynthetaseLigase or Synthetase 合成酶，又稱為連接酶，能夠催化合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-CC-C、C-OC-O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATPATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。 A + B + ATP =AB + ADP +Pi A + B + ATP =AB + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)丙酮酸丙酮酸 +

17、 + COCO2 2 草酰乙酸草酰乙酸第26頁/共178頁33333333335555555555BBBBBPPP+POHPPBBBBPPPPPBP（7 7）核酸酶（催化核酸）核酸酶（催化核酸） RibozymeRibozyme核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一類特殊的核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一類特殊的RNARNA，能夠催化，能夠催化RNARNA分子中的磷酸酯鍵的水解分子中的磷酸酯鍵的水解及其逆反應(yīng)。及其逆反應(yīng)。第27頁/共178頁2. 酶的命名(1)習慣命名法:1.根據(jù)其催化底物來命名；2.根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名；3.結(jié)合上述兩個原則來命名；4.有時在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點

18、。第28頁/共178頁(2)國際系統(tǒng)命名法 系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個酶字。例如： 習慣名稱:谷丙轉(zhuǎn)氨酶 系統(tǒng)名稱:丙氨酸：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶 酶催化的反應(yīng): 谷氨酸谷氨酸 + + 丙酮酸丙酮酸 - -酮戊二酸酮戊二酸 + + 丙氨丙氨酸酸第29頁/共178頁一些酶的命名舉例編號編號推薦名稱推薦名稱系系 統(tǒng)統(tǒng) 名名 稱稱催催 化化 的的 反反 應(yīng)應(yīng)EC1.4.1.3谷氨酸谷氨酸L-谷氨酸：谷氨酸：NAD+L-谷氨酸谷氨酸 + H2O + NAD+脫氫酶脫氫酶氧化還原酶氧化還原酶 -酮戊二酸酮戊二酸 + NH3 + NADHEC2.6.1.1 天冬氨酸氨天冬氨酸氨L-天冬

19、氨酸：天冬氨酸： -酮酮L-天冬氨酸天冬氨酸+ -酮戊二酸酮戊二酸基轉(zhuǎn)移酶基轉(zhuǎn)移酶戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶草酰乙酸草酰乙酸 +L-谷氨酸谷氨酸EC3.5.3.1 精氨酸酶精氨酸酶L-精氨酸脒基水解酶精氨酸脒基水解酶L-精氨酸精氨酸 + H2O L-鳥氨酸鳥氨酸+ 尿素尿素EC4.1.2.13 果糖二磷酸果糖二磷酸D-果糖果糖1，6-二磷酸：二磷酸：D-果糖果糖1，6-二磷酸二磷酸醛縮酶醛縮酶D-甘油醛甘油醛3-磷酸裂合酶磷酸裂合酶磷酸二羥丙酮磷酸二羥丙酮 + D-甘油醛甘油醛3-磷酸磷酸EC5.3.1.9 磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖D-葡萄糖葡萄糖6-磷酸酮醇磷酸酮醇D-葡萄糖葡萄糖6-磷酸

20、磷酸異構(gòu)酶異構(gòu)酶異構(gòu)酶異構(gòu)酶D-果糖果糖6-磷酸磷酸EC6.3.1.2 谷氨酰胺谷氨酰胺L-谷氨酸：氨連接酶谷氨酸：氨連接酶ATP + L-谷氨酸谷氨酸 + NH3合成酶合成酶ADP+磷酸磷酸 + L-谷氨酰胺谷氨酰胺編號編號推薦名稱推薦名稱系系 統(tǒng)統(tǒng) 名名 稱稱催催 化化 的的 反反 應(yīng)應(yīng)EC1.4.1.3谷氨酸谷氨酸L-谷氨酸：谷氨酸：NAD+L-谷氨酸谷氨酸 + H2O + NAD+脫氫酶脫氫酶氧化還原酶氧化還原酶 -酮戊二酸酮戊二酸 + NH3 + NADHEC2.6.1.1 天冬氨酸氨天冬氨酸氨L-天冬氨酸：天冬氨酸： -酮酮L-天冬氨酸天冬氨酸+ -酮戊二酸酮戊二酸基轉(zhuǎn)移酶基轉(zhuǎn)移酶

21、戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶草酰乙酸草酰乙酸 +L-谷氨酸谷氨酸EC3.5.3.1 精氨酸酶精氨酸酶L-精氨酸脒基水解酶精氨酸脒基水解酶L-精氨酸精氨酸 + H2O L-鳥氨酸鳥氨酸+ 尿素尿素EC4.1.2.13 果糖二磷酸果糖二磷酸D-果糖果糖1，6-二磷酸：二磷酸：D-果糖果糖1，6-二磷酸二磷酸醛縮酶醛縮酶D-甘油醛甘油醛3-磷酸裂合酶磷酸裂合酶磷酸二羥丙酮磷酸二羥丙酮 + D-甘油醛甘油醛3-磷酸磷酸EC5.3.1.9 磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖D-葡萄糖葡萄糖6-磷酸酮醇磷酸酮醇D-葡萄糖葡萄糖6-磷酸磷酸異構(gòu)酶異構(gòu)酶異構(gòu)酶異構(gòu)酶D-果糖果糖6-磷酸磷酸EC6.3.1.2 谷氨酰胺谷

22、氨酰胺L-谷氨酸：氨連接酶谷氨酸：氨連接酶ATP + L-谷氨酸谷氨酸 + NH3合成酶合成酶ADP+磷酸磷酸 + L-谷氨酰胺谷氨酰胺第30頁/共178頁 第三節(jié) 酶的作用機理一、一、酶的催化作用與分子活化能酶的催化作用與分子活化能二、二、酶催化的中間產(chǎn)物理論酶催化的中間產(chǎn)物理論三、三、酶的活性中心和必需基團酶的活性中心和必需基團四、四、酶作用專一性機理酶作用專一性機理五、五、與酶的高效率有關(guān)的主要因素與酶的高效率有關(guān)的主要因素第31頁/共178頁一、酶的催化作用與分子活化能活化能：分子由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)所需的能量。 即：活化能指在一定溫度下，1mol底物全部進入活化態(tài)所需要的自由能，單位是

23、Jmol。 酶降低反應(yīng)活化能的機理是通過改變反應(yīng)途徑，使反應(yīng)沿一個低活化能的途徑進行。第32頁/共178頁酶的催化機理是降低活化能酶的催化機理是降低活化能第33頁/共178頁二、酶催化的中間產(chǎn)物理二、酶催化的中間產(chǎn)物理論論1kSE 1kES 2kEP E+SP+ EES能量水平反應(yīng)過程 G E1 E2 酶（E）與底物（S）結(jié)合生成不穩(wěn)定的中間物（ES），再分解成產(chǎn)物（P）并釋放出酶，使反應(yīng)沿一個低活化能的途徑進行，降低反應(yīng)所需活化能，所以能加快反應(yīng)速度。第34頁/共178頁第35頁/共178頁第36頁/共178頁使底物靠攏使底物分子產(chǎn)生應(yīng)力使底物分子電荷變化第37頁/共178頁概念：酶的活性中

24、心是指酶分子結(jié)構(gòu)中，能直接與底物結(jié)合，并概念：酶的活性中心是指酶分子結(jié)構(gòu)中，能直接與底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。和酶催化作用直接有關(guān)的部位。 酶活性中心是酶分子中具有三維結(jié)構(gòu)的區(qū)域，或為裂縫，酶活性中心是酶分子中具有三維結(jié)構(gòu)的區(qū)域，或為裂縫，或為凹陷，深入到酶分子內(nèi)部，常為氨基酸殘基的疏水基團組或為凹陷，深入到酶分子內(nèi)部，常為氨基酸殘基的疏水基團組成的。成的。三、酶的活性中心第38頁/共178頁必需基團必需基團(essential group)酶分子中氨基酸殘基側(cè)鏈酶分子中氨基酸殘基側(cè)鏈的化學基團中的化學基團中，一些與酶活性密一些與酶活性密切相關(guān)的化學基團切相關(guān)的化學基團。第39頁

25、/共178頁活性中心內(nèi)的必需基團活性中心內(nèi)的必需基團結(jié)合基團結(jié)合基團binding group催化基團催化基團(catalytic group)催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物 位于活性中心以外，維持酶活性中心應(yīng)有位于活性中心以外，維持酶活性中心應(yīng)有的空間構(gòu)象所必需。的空間構(gòu)象所必需。 活性中心外的必需基團活性中心外的必需基團常見：常見：His His 咪唑基；咪唑基；Ser Ser 羥基；羥基； Cys Cys 巰基；巰基；Glu Glu 羧基羧基第40頁/共178頁與催化作用相關(guān)的結(jié)構(gòu)特點(1)活性中心：酶分子中直接和底物結(jié)合并起催化反應(yīng)的空間局限（部位）。 第41頁/共178頁第42

26、頁/共178頁第43頁/共178頁第44頁/共178頁第45頁/共178頁底 物 活性中心以外的必需基團結(jié)合基團催化基團 活性中心 第46頁/共178頁AspHisSer活性中心重要基團: His57 , Asp102 , Ser195第47頁/共178頁為Tyr 248為Arg 145為Glu 270為底物ZnZn羧肽酶活性中心示意圖第48頁/共178頁四、 酶作用專一性機理 鎖鑰學說：將酶的活性中心比喻作鎖孔，底物分子象鑰匙，底物能專一性地插入到酶的活性中心。 誘導契合學說：酶的活性中心在結(jié)構(gòu)上具柔性，底物接近活性中心時，可誘導酶蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，這樣就使酶活性中心有關(guān)基團正確排列和定向，

27、使之與底物成互補形狀有機的結(jié)合而催化反應(yīng)進行。第49頁/共178頁酶專一性的“鎖鑰學說”第50頁/共178頁酶專一性的“誘導契合學說”第51頁/共178頁五、與酶的高效率有關(guān)的主要因素 1、 鄰近與定向效應(yīng) 第52頁/共178頁2、 誘導契合與底物扭曲變形第53頁/共178頁3、酶分子中可作為親核基團和酸堿催化的功能基團第54頁/共178頁胰凝乳蛋白酶分子中催化三聯(lián)體構(gòu)象His57Asp102Ser195Asp102His57Ser195His57102AspSer195A.酶分子中的電荷中繼網(wǎng)B.加上底物后，從Ser轉(zhuǎn)移一個質(zhì)子給His，帶正電荷的咪唑基通過帶負電荷的Asp靜電相互作用被穩(wěn)定

28、Ser195102AspHis57底物六、胰凝乳蛋白酶的催化機理第55頁/共178頁結(jié)合底物His57 質(zhì)子供體形成共價ES復合物C-N鍵斷裂底物第56頁/共178頁?；a(chǎn)物釋放四面體中間物的瓦解水親核攻擊羧基產(chǎn)物釋放第57頁/共178頁第58頁/共178頁胰蛋白酶、彈性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的比較相同點：1、一級結(jié)構(gòu)相似，40%同，特別是活性部位中195位Ser周圍的氨基酸順序，都是Gly-Asp-Ser-Gly-Pro2、X射線分析揭示出的三個酶的活性中心構(gòu)象十分相似。3、三個酶中都存在Asp102-His57-Ser195的催化三聯(lián)體組合結(jié)構(gòu)，因而具有相同的催化機制。4、三個酶合成后分泌出

29、來均為無活性前體形式，經(jīng)單一肽鍵斷裂而被激活。第59頁/共178頁不同點：底物專一性完全不同。專一性的差異與活性中心底物結(jié)合部位的氨基酸序列特性有關(guān)。胰凝乳蛋白酶為一個較寬大的、疏水的“口袋”，主要由非極性氨基酸組成，“口袋”上部為兩個Gly，利于芳香族氨基酸進入；胰蛋白酶的“口袋”上部的構(gòu)象與胰凝乳蛋白酶相似，但“口袋”底部的殘基Asp189，有利于帶正電的堿性氨基酸結(jié)合；彈性蛋白酶“口袋”上部為Val126和Thr226，口袋較小，可防止大側(cè)鏈的氨基酸進入，而只是允許小的丙氨酸進入。第60頁/共178頁七、溶菌酶的作用機制 溶菌酶催化作用中既有活性中心基團的酸堿催化，也有底物敏感鍵的扭曲變

30、形和微環(huán)境影響。第61頁/共178頁八、酶原和酶原的激活：l 酶原：沒有活性的酶的前體。l 酶原的激活：酶原在一定條件下經(jīng)適當?shù)奈镔|(zhì)作用可轉(zhuǎn)變成有活性的酶。酶原轉(zhuǎn)變成酶的過程稱為酶原的激活。l 本質(zhì)：酶原的激活實質(zhì)上是酶活性部位形成或暴露的過程。第62頁/共178頁 酶原激活的機理酶原激活的機理酶酶 原原分子構(gòu)象發(fā)生改變分子構(gòu)象發(fā)生改變形成或形成或暴露出酶的活性中心暴露出酶的活性中心 一個或幾個特定的一個或幾個特定的肽鍵斷裂肽鍵斷裂，水解，水解掉一個或幾個短肽掉一個或幾個短肽在特定條件下在特定條件下第63頁/共178頁賴賴纈纈天天天天天天天天甘甘異異賴賴纈纈天天天天天天天天纈纈組組絲絲甘甘異異

31、纈纈組組絲絲第64頁/共178頁第65頁/共178頁 在組織細胞中，某些酶以酶原形式存在，具有重要的生物學意義： 一則可保護分泌酶原的組織不被水解破壞； 二則酶原激活是有機體調(diào)控酶活的一種形式。 酶原激活進一步說明了酶的功能是以酶的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。第66頁/共178頁第四節(jié) 影響酶促反應(yīng)速度的因素 （酶促反應(yīng)動力學）一一、酶促反應(yīng)速度的測定 測定單位時間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的成量。二、影響酶反應(yīng)速度的因素斜率=P/ t = V（初速度）Pt第67頁/共178頁當S足夠過量，其它條件固定且無不利因素時，v=kE二、影響對酶反應(yīng)速度的因素2、底物濃度3、pH （最適 pH的概念）4、 溫度 （最適溫

32、度的概念）5、激活劑6、抑制劑1、酶濃度第68頁/共178頁2、底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響1）、）、酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線 （MichaelisMenten曲線）曲線）2）、）、米氏方程的提出及推導米氏方程的提出及推導3）、）、米氏常數(shù)的意義米氏常數(shù)的意義4）、）、米氏常數(shù)的測定米氏常數(shù)的測定第69頁/共178頁1）酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線第70頁/共178頁2）單分子酶促反應(yīng)的米氏方程及Km推導原則：從測定反應(yīng)的初速度、酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照 “穩(wěn)態(tài)平 衡”假說的設(shè)想進行推導。1kSE 1kES2kEP SKSVvmmax121kkkKm米氏

33、方程:米氏常數(shù):第71頁/共178頁米氏方程的推導 121kkkESSESSEt令：Kmkkk121將（4）代入（3），則： SKSVvmmax1kES 1kES2kEP ESEt SESES生成速度： SESEkvt11，ES分解速度：ESkESkv212即： ESkESkSESEkt211則： SSESESKmtE(1)經(jīng)整理得： SKSEmtES由于酶促反應(yīng)速度由ES決定，即ESkv22kvES，所以(2)將（2）代入（1）得： SKSEkvmt2 SKSEkmt2v(3)當酶反應(yīng)體系處于恒態(tài)時：21vv 當Et=ES時，mVv tmEkV2(4)所以 第72頁/共178頁3）米氏常數(shù)的

34、意義當v=Vmax/2時，Km=S（ Km的單位為濃度單位: ） *是酶在一定條件下的特征物理常數(shù)，通過測定Km的數(shù)值，可鑒別酶。* 當k-1 k2 可近似表示酶和底物親合力，Km愈小，E對S的親合力愈大，Km愈大，E對S的親合力愈小。*在已知Km的情況下，應(yīng)用米氏方程可計算任意s時的v，或任何v下的s。（用Km的倍數(shù)表示） 練習題：已知某酶的Km值為0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反應(yīng)速度達到最大反應(yīng)速度的80時底物的濃度應(yīng)為多少？ 第73頁/共178頁4） 米氏常數(shù)的測定基本原則： 將米氏方程變化成相當于y=ax+b的直線方程，再用作圖法求出Km。 例：雙倒數(shù)作圖法（Linewea

35、ver-Burk法） 米氏方程的雙倒數(shù)形式： 1 KmKm 1 1 = . + v Vmax S Vmax 第74頁/共178頁酶動力學的雙倒數(shù)圖線 1 KmKm 1 1 = . + v Vmax S Vmax 第75頁/共178頁3、pH對酶反應(yīng)速度的影響 酶的最適PH不是固定的常數(shù)，其數(shù)值受酶的純度、底物的種類和濃度、緩沖液的種類和濃度等的影響。因此酶的最適PH只在一定條件下才有意義。 過酸過堿導致酶蛋白變性 影響底物分子解離狀態(tài) 影響酶分子解離狀態(tài) 影響酶的活性中心構(gòu)象pH最適 pHv第76頁/共178頁4、溫度與酶反應(yīng)速度的關(guān)系 在達到最適溫度以前，反應(yīng)速度隨溫度升高而加快 酶是蛋白質(zhì)

36、，其變性速度亦隨溫度上升而加快 酶的最適溫度不是一個固定不變的常數(shù)v溫度第77頁/共178頁5、激活劑對酶作用的影響類別 金屬離子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+ 、 Co2+、Fe2+ 陰離子： Cl-、Br- 有機分子 還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金屬螯合劑：EDTA凡是能提高酶活性的物質(zhì)，稱為酶的激活劑（activator）第78頁/共178頁 有些物質(zhì)能與酶分子上某些必須基團結(jié)合（作用),使酶的活性中心的化學性質(zhì)發(fā)生改變，導致酶活力下降或喪失，這種物質(zhì)稱為酶的抑制劑。 凡能使酶的催化活性下降而凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白變性的作用不引

37、起酶蛋白變性的作用稱為酶的抑制作用稱為酶的抑制作用（inhibitor)。 酶的抑制劑一般具備兩個方面的特點：a.在化學結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似。b.能夠與酶的活性中心以非共價或共價的方式形成比較穩(wěn)定的復合體或結(jié)合物。6、抑制劑對酶作用的影響第79頁/共178頁 抑制作用的類型不可逆性抑制 (irreversible inhibition)可逆性抑制 (reversible inhibition)：競爭性抑制競爭性抑制 (competitive inhibition)非競爭性抑制非競爭性抑制 (non-competitive inhibition)反競爭性抑制反競爭性抑制

38、(uncompetitive inhibition) 區(qū)別于酶的變性區(qū)別于酶的變性 抑制劑對酶有一定選擇性抑制劑對酶有一定選擇性 引起變性的因素對酶沒有選擇性引起變性的因素對酶沒有選擇性第80頁/共178頁(1) 不可逆性抑制作用* * 概念概念抑制劑通常以抑制劑通常以共價鍵共價鍵與與酶活性中心酶活性中心的必需基團的必需基團相結(jié)合，使酶失活。相結(jié)合，使酶失活。 * * 舉例舉例有機磷化合物有機磷化合物 羥基酶羥基酶解毒解毒 - - - - - - 解磷定解磷定(PAM)重金屬離子及砷化合物重金屬離子及砷化合物 巰基酶巰基酶解毒解毒 - - - - - - 二巰基丙醇二巰基丙醇(BAL) 第81

39、頁/共178頁非專一性不可逆抑制劑 抑制劑作用于酶分子中的一類或幾類基團，這些基團中包含了必需基團，因而引起酶失活。類型：第82頁/共178頁ESSAsCHCHCl+CH2SHCHSHCH2OHESHSH+CH2SCHSCH2OHAsCHCHClROROPOX+HOEROROPOOE+HXClAsClCHCHCl+ ESHSHESAsSCHCHCl+2HCl有機磷化合物有機磷化合物路易士氣路易士氣失活的酶失活的酶羥基酶羥基酶失活的酶失活的酶酸酸巰基酶巰基酶失活的酶失活的酶酸酸BAL(巰基酶巰基酶BAL與砷劑結(jié)合物與砷劑結(jié)合物第83頁/共178頁專一性不可逆抑制劑 這類抑制劑選擇性很強，它只能專

40、一性地與酶活性中心的某些基團不可逆結(jié)合，引起酶的活性喪失。 實例：有機磷殺蟲劑-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX第84頁/共178頁（二） 可逆性抑制作用* * 概念概念抑制劑通常以抑制劑通常以非共價鍵非共價鍵與酶或酶與酶或酶- -底物復合物底物復合物可逆性結(jié)合，使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用可逆性結(jié)合，使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用透析、超濾等方法除去。透析、超濾等方法除去。競爭性抑制競爭性抑制非競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制反競爭性抑制 第85頁/共178頁. 競爭性抑制作用+反應(yīng)模式反應(yīng)模式定義定義抑制劑與底物的抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似結(jié)構(gòu)相似，能與底物競

41、爭，能與底物競爭酶的活性中心，從而阻礙酶底物復合物的形成，酶的活性中心，從而阻礙酶底物復合物的形成，使酶的活性降低。使酶的活性降低。這種抑制作用稱為競爭性抑這種抑制作用稱為競爭性抑制作用。制作用。 竟爭性抑制通?？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競爭能力來消除。第86頁/共178頁第87頁/共178頁第88頁/共178頁l競爭性抑制作用的速度方程：競爭性抑制作用的速度方程：iKI111m(1)VVKSVmaxmax第89頁/共178頁 * * 特點特點b)b) 抑制程度取決于抑制劑與酶的相對親和力及抑制程度取決于抑制劑與酶的相對親和力及底物濃度底物濃度；a) I與與S結(jié)構(gòu)類似，競爭酶的活性中心

42、；結(jié)構(gòu)類似，競爭酶的活性中心；c) 動力學特點：動力學特點：Vmax不變不變，表觀，表觀Km增大增大。 第90頁/共178頁* * 舉例舉例 丙二酸丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶COOH CH2 CH2COOH COOH COOH CH2 丙二酸丙二酸琥珀酸琥珀酸琥珀酸脫氫酶琥珀酸脫氫酶FADFADH2延胡索酸延胡索酸第91頁/共178頁第92頁/共178頁第93頁/共178頁 磺胺類藥物的抑菌機制磺胺類藥物的抑菌機制與與對氨基苯甲酸對氨基苯甲酸競爭競爭二氫葉酸合成酶二氫葉酸合成酶二氫蝶呤啶二氫蝶呤啶 對氨基苯甲酸對氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸二氫葉酸二氫葉酸合成酶合成酶二

43、氫葉酸二氫葉酸COOH H2N SO2NHR H2N 磺磺 胺胺 類類 藥藥 物物第94頁/共178頁2 非競爭性抑制：l酶可同時與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導至酶活性下降。由于這類物質(zhì)并不是與底物競爭與活性中心的結(jié)合，所以稱為非競爭性抑制劑。l如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競爭性抑制。l非竟爭性抑制不能通過增大底物濃度的方法來消除。第95頁/共178頁* * 反應(yīng)模式反應(yīng)模式第96頁/共178頁第97頁/共178頁l 非競爭性抑制作用的速度方程：第98頁/共178頁l非競爭性抑制作

44、用的LineweaverBurk圖 ：第99頁/共178頁* * 特點特點a) a) 抑制劑與酶活性中心外的必需基團結(jié)合，抑制劑與酶活性中心外的必需基團結(jié)合，底物與抑制劑之間底物與抑制劑之間無競爭關(guān)系無競爭關(guān)系；b)b) 抑制程度取決于抑制劑的濃度；抑制程度取決于抑制劑的濃度；c) 動力學特點：動力學特點：Vmax降低降低，表觀，表觀Km不變不變。 第100頁/共178頁. 反競爭性抑制反競爭性抑制* * 反應(yīng)模式反應(yīng)模式 抑制劑僅與酶和底物形成的中間產(chǎn)物結(jié)合，使ES的量下降。第101頁/共178頁反競爭性抑制曲線第102頁/共178頁* * 特點：特點：a) a) 抑制劑只與酶底物復合物結(jié)合

45、；抑制劑只與酶底物復合物結(jié)合；b)b) 抑制程度取決與抑制劑的濃度及抑制程度取決與抑制劑的濃度及底物的濃度底物的濃度；c) 動力學特點：動力學特點：Vmax降低降低，表觀，表觀Km降低降低。 第103頁/共178頁各種可逆性抑制作用的比較 動力學參數(shù)動力學參數(shù)表觀表觀Km Km增大增大不變不變減小減小最大速度最大速度Vmax不變不變降低降低降低降低林林-貝氏作圖貝氏作圖斜率斜率Km/Vmax增大增大增大增大不變不變縱軸截距縱軸截距1/Vmax不變不變增大增大增大增大橫軸截距橫軸截距-1/Km增大增大不變不變減小減小與與I結(jié)合的組分結(jié)合的組分EE、ESES作用特征作用特征無抑制劑無抑制劑競爭性抑

46、制競爭性抑制非競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制反競爭性抑制第104頁/共178頁第五節(jié)第五節(jié) 酶的活性調(diào)節(jié)酶的活性調(diào)節(jié)一、 別構(gòu)酶及酶的別構(gòu)（變構(gòu)）效應(yīng)二、 酶的多種分子形式 同工酶（isoenzyme）第105頁/共178頁一、酶的別構(gòu)（變構(gòu)）效應(yīng)概念：有些酶分子表面除了具有活性中心外，還存在被稱為調(diào)節(jié)位點（或變構(gòu)位點）的調(diào)節(jié)物特異結(jié)合位點，調(diào)節(jié)物結(jié)合到調(diào)節(jié)位點上引起酶的構(gòu)象發(fā)生變化，導致酶的活性提高或下降，這種現(xiàn)象稱為別構(gòu)效應(yīng)（allosteric effect）,具有上述特點的酶稱別構(gòu)酶（allosteric enzyme）。第106頁/共178頁別構(gòu)酶別構(gòu)酶(Allosteric e

47、nzyme)(Allosteric enzyme)的的特點特點：一般是寡聚酶，由多亞基組成，包括催化部位和調(diào)節(jié)（別構(gòu)）部位；具有別構(gòu)效應(yīng)。指酶和一個配體（底物，調(diào)節(jié)物）結(jié)合后可以影響酶和另一個配體（底物）的結(jié)合能力。動力學特點：不符合米曼方程雙曲線。第107頁/共178頁酶的別構(gòu)（變構(gòu)）效應(yīng)示意圖效應(yīng)劑別構(gòu)中心活性中心第108頁/共178頁a-非調(diào)節(jié)酶b-正協(xié)同別構(gòu)酶 的S形曲線 別構(gòu)酶的動力學曲線第109頁/共178頁p別構(gòu)酶舉例：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，簡稱別構(gòu)酶舉例：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，簡稱ATCase 綜上所述，對于ATcase來說底物、CTP、ATP都是它的別構(gòu)效應(yīng)劑，可以通過別構(gòu)效應(yīng)影

48、響酶的催化活性，從而有效地調(diào)節(jié)體內(nèi)嘧啶核苷酸的生物合成。第110頁/共178頁ATCase的結(jié)構(gòu)及其催化鏈的別構(gòu)過度作用無催化活性構(gòu)象無催化活性構(gòu)象(T-型型)CCCCC C T T T T T T有催化活性構(gòu)象有催化活性構(gòu)象(R-型型) CC CCC CR R R R R RATP（正效應(yīng)劑）CTP（負效應(yīng)劑）第111頁/共178頁別構(gòu)酶的序變模型SS SS SSSSSSSSSS亞基全部處于R型亞基全部處于T型依次序變化別構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)機理：序變模型和齊變模型第112頁/共178頁別構(gòu)酶的齊變模型S SSSS SSS SST狀態(tài)（對稱亞基）T狀態(tài)（對稱亞基）SSSS對稱亞基對稱亞基齊步變化第1

49、13頁/共178頁二、酶的多種分子形式同工酶 概念：存在于同一種屬或不同種屬，同一個體的不同組織或同一組織、同一細胞，具有不同分子形式但卻能催化相同的化學反應(yīng)的一組酶，稱之為同工酶（isoenzymeisoenzyme） 類別：原級同工酶；次級同工酶 實例：乳酸脫氫酶 研究意義：作為遺傳的標志；作為臨床診斷指標；研究某些代謝調(diào)節(jié)機制第114頁/共178頁乳酸脫氫酶同工酶形成示意圖多肽亞基mRNA四聚體結(jié)構(gòu)基因a b乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜+H4MH3M2H2M3HM4點樣線第115頁/共178頁不同組織中LDH同工酶的電泳圖譜LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM

50、3)LDH5(M4)心肌心肌 腎腎 肝肝 骨骼肌骨骼肌 血清血清-+原點原點第116頁/共178頁* *生理及臨床意義生理及臨床意義在代謝調(diào)節(jié)上在代謝調(diào)節(jié)上起著重要的作用；起著重要的作用；用于解釋發(fā)育用于解釋發(fā)育過程中階段特有的過程中階段特有的代謝特征；代謝特征；同工酶譜同工酶譜的改的改變有助于對疾病的變有助于對疾病的診斷；診斷；同工酶可以作同工酶可以作為遺傳標志，用于為遺傳標志，用于遺傳分析研究。遺傳分析研究。心肌梗死和肝病病人血清心肌梗死和肝病病人血清LDHLDH同工酶譜的變化同工酶譜的變化1 1酶酶活活性性心肌梗死酶譜心肌梗死酶譜正常酶譜正常酶譜肝病酶譜肝病酶譜2 23 34 45 5第

51、117頁/共178頁三、 酶的共價（化學）修飾調(diào)節(jié)共價修飾共價修飾(covalent modification)在其他酶的催化下，酶蛋白肽鏈上的一些基團可與某種化學基團發(fā)生在其他酶的催化下，酶蛋白肽鏈上的一些基團可與某種化學基團發(fā)生可逆的共價結(jié)合，從而改變酶的活性，此過程稱為共價修飾?？赡娴墓矁r結(jié)合，從而改變酶的活性，此過程稱為共價修飾。磷酸化與脫磷酸化磷酸化與脫磷酸化（最常見）（最常見）第118頁/共178頁 酶的磷酸化與脫磷酸化酶的磷酸化與脫磷酸化 酶蛋白酶蛋白SerThrTyrOH酶蛋白酶蛋白SerThrTyrOPATPADPPiH2O蛋白激酶蛋白激酶蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶第119頁/共1

52、78頁2ATP2ADP磷酸化酶b 激酶2Pi2H2O磷蛋白磷酸酶PPPPPP磷酸化酶b（二聚體） 無活性磷酸化酶b（二聚體） 有活性磷酸化酶b（四聚體） 低活性第120頁/共178頁共價修飾調(diào)節(jié)的特點受共價修飾的酶存在有（高）活性和無受共價修飾的酶存在有（高）活性和無（低）活性兩種形式；（低）活性兩種形式；具有瀑布效應(yīng)（級聯(lián)效應(yīng)）；具有瀑布效應(yīng)（級聯(lián)效應(yīng)）；是體內(nèi)經(jīng)濟、有效的快速調(diào)節(jié)方式。是體內(nèi)經(jīng)濟、有效的快速調(diào)節(jié)方式。第121頁/共178頁瀑布效應(yīng)第122頁/共178頁四、酶分子的聚合和解聚 大多數(shù)情況下，由于酶與一些小分子調(diào)節(jié)因子結(jié)合從而引起酶的聚合和解聚，使酶在活性和無活性形式間相互轉(zhuǎn)化

53、。 如乙酰CoA羧化酶由4種不同亞基組成，檸檬酸、異檸檬酸可使其聚合成多聚體，成為活性形式：第123頁/共178頁第六節(jié)、酶的活力測定及分離提純第124頁/共178頁第125頁/共178頁 測定酶活力常有以下幾種方法：l在一個反應(yīng)體系中，加入一定量的酶液，開始計時反應(yīng)，經(jīng)一定時間反應(yīng)后，終止反應(yīng)，測定在這一時間間隔內(nèi)發(fā)生的化學反應(yīng)量（終止時與起始時的濃度差），這時測得的是初速度。l在一定條件下，加入一定量底物（規(guī)定），再加入合適量的酶液，測定完成該反應(yīng)（底物反應(yīng)完）所需的時間，（非初速度，為一平均速度）。l動態(tài)連續(xù)測定法。在反應(yīng)體系中，加入酶，用儀器連續(xù)監(jiān)測整個酶促反應(yīng)過程中底物的消耗或產(chǎn)物的

54、生成。l快速反應(yīng)追蹤法。近年來，追蹤極短時間（10-3s以下）內(nèi)反應(yīng)過程的方法和裝置已經(jīng)應(yīng)用。其代表有停流法（stopped-flow）和溫度躍變法（temperature jump）。第126頁/共178頁IV.酶活力測定方法：l反應(yīng)計時。 終止酶反應(yīng)，常使酶立刻變性，最常用的方法是加入三氯乙酸或過氯酸使酶蛋白沉淀，也可用SDS使酶變性，或迅速加熱使酶變性。有些酶可用非變性法來停止反應(yīng)或用破壞其輔因子來停止反應(yīng) 。l反應(yīng)量的測定。測底物減少量或產(chǎn)物生成量均可。在反應(yīng)過程中產(chǎn)物是從無到有，變化量明顯，極利于測定，所以大都測定產(chǎn)物的生成量。 第127頁/共178頁具體物質(zhì)量的測定，據(jù)被測定物質(zhì)的

55、物理化學性質(zhì)通過定量分析法測定。常用的方法有：光譜分析法：酶將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄖ苯踊蜷g接）一個可用分光光度法或熒光光度法測出的化合物?；瘜W法：利用化學反應(yīng)使產(chǎn)物變成一個可用某種物理方法測出的化合物，然后再反過來算出酶的活性。 放射性化學法：用同位素標記的底物，經(jīng)酶作用后生成含放射性的產(chǎn)物，在一定時間內(nèi)，生成的放射性產(chǎn)物量與酶活性成正比。第128頁/共178頁2. 酶活力的表示方法活力單位（active unit） 習慣單位（U）: 底物(或產(chǎn)物)變化量 / 單位時間 國際單位（IU）: 1moL變化量 / 分鐘 Katal（Kat）：1moL變化量 / 秒比活力=總活力單位總蛋白mg數(shù)= U(或I

56、U) mg蛋白量度酶催化能力大小轉(zhuǎn)換系數(shù)（Kcat） 底物（ moL）/ 秒每個酶分子量度酶純度比活力（specific activity）量度轉(zhuǎn)換效率第129頁/共178頁.酶活力單位 酶活力可用單位時間內(nèi)單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量表示，單位為mol/min等。 酶活力單位的基本定義為：規(guī)定條件（最適條件）下一定時間內(nèi)催化完成一定化學反應(yīng)量所需的酶量。 據(jù)不同情況有幾種酶活力單位（activity unit）或又稱酶單位（enzyme unit）。 第130頁/共178頁a.國際單位：一般用活力單位U（Unit）表示，許多酶活力單位都是以最佳條件或某一固定條件下每分鐘催化生成1mo

57、l產(chǎn)物所需要的酶量為一個酶活力單位。一個“Katal”單位是指在一定條件下1秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量。Kat和U的換算關(guān)系：1 Kat=6107U，1U=16067n Katp在“U”和“kat”酶活力單位的定義和應(yīng)用中，酶催化底物的分子量必須是已知的，否則將無法計算。 第131頁/共178頁b.習慣單位： 在實際使用中，結(jié)果測定和應(yīng)用都比較方便、直觀，規(guī)定的酶活力單位，不同酶有各自的規(guī)定，如：-淀粉酶活力單位：每小時分解1g可溶性淀粉的酶量為一個酶單位。（QB546-80），也有規(guī)定每小時分解1mL2%可溶性淀粉溶液為無色糊精的酶量為一個酶單位。糖化酶活力單位：在規(guī)定條件下，每小時轉(zhuǎn)

58、化可溶性淀粉產(chǎn)生1mg還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量為一個酶單位。蛋白酶：規(guī)定條件下，每分鐘分解底物酪蛋白產(chǎn)生1g酪氨酸所需的酶量。DNA限制性內(nèi)切酶：推薦反應(yīng)條件下，一小時內(nèi)可完全消化1g純化的DNA所需的酶量。第132頁/共178頁.比活力（specific activity）酶的比活力是每單位（一般是mg）蛋白質(zhì)中的酶活力單位數(shù)（如：酶單位/mg蛋白），實際應(yīng)用中也用每單位制劑中含有的酶活力數(shù)表示（如：酶單位/mL（液體制劑），酶單位/g（固體制劑），對同一種酶來講，比活力愈高則表示酶的純度越高（含雜質(zhì)越少）必要條件，所以比活力是評價酶純度高低的一個指標。在評價純化酶的純化操作中，還有一

59、個概念就是回收率。 回收率=某純化操作后的總活力/某純化操作前的總活力 總活力=比活力總體積（總重量）第133頁/共178頁基本原則：提取過程中避免酶變性而失去活性；防止強酸、強堿、高溫和劇烈攪拌等；要求在低溫下操作，加入的化學試劑不使酶變性，操作中加入緩沖溶液.基本操作程序：a.選材：微生物（微生物發(fā)酵物: 胞內(nèi)酶，胞外酶），動物（動物器臟：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶等）。b.抽提：加入提取液提取。胞內(nèi)酶先要進行細胞破碎（機械研磨，超聲波破碎，反復凍融或自溶等），c.分離：先進行凈化處理（過濾，絮凝，離心脫色），再采用沉淀法分離（鹽析法，有機溶劑沉

60、淀法，超離心等）。d.純化：可采用離子交換層析，凝膠過濾，液相色譜，親和色譜和超濾等方法。二、酶的分離純化二、酶的分離純化第134頁/共178頁第六節(jié) 酶工程簡介 將酶學和工程學相結(jié)合，產(chǎn)生了酶工程( (enzyme enzyme engineering)engineering)這樣一個新的領(lǐng)域。 酶工程是圍繞著酶所特有的生物催化性能使其在工農(nóng)業(yè)，醫(yī)學及其它方面發(fā)揮作用的一門應(yīng)用技術(shù)，是酶學基本原理與化學工程技術(shù)及DNADNA重組技術(shù)有機結(jié)合的產(chǎn)物。廣義地講，酶工程還應(yīng)包括酶的生產(chǎn)、分離和純化： 酶工程主要研究酶的生產(chǎn)、純化、固定化技術(shù)、酶分子結(jié)構(gòu)的修飾和改造以及在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和理論研究等

61、方面的應(yīng)用。第135頁/共178頁一、化學酶工程 天然酶 固定化酶 化學修飾酶 人工模擬酶二、生物酶工程 克隆酶 突變酶 新酶第136頁/共178頁固定化酶 將水溶性酶用物理或化學方法處理，固定于高分子支持物(或載體)上而成為不溶于水，但仍有酶活性的一種酶制劑形式，稱固定化酶(immobilized enzyme)。包埋法 吸附法共價偶聯(lián)法交聯(lián)法第137頁/共178頁溴化氰亞氨碳酸基偶聯(lián)法OHOHBrCNH2OOOC=N-EO-CO-NH-EOHO-C-NH-E NHOHH2N-E（多羥基載體）O-CONH2OH（惰性）OOC=NH（活潑）OC NOH第138頁/共178頁戊二醛交聯(lián)法 OHC

62、(CH2)3CHO戊二醛H2N-EN -HC=N-E-N=CH（CH2）3-CH=N- E-NCHCH第139頁/共178頁酶的改造和模擬 酶的改造：功能基團的化學修飾酶 酶蛋白側(cè)鏈的化學修飾 酶分子內(nèi)或間的交聯(lián)反應(yīng)酶的模擬：根據(jù)酶作用的原理摸擬酶的活性中心和催化機理，用化學方法制備結(jié)構(gòu)較簡單,高效、高選擇性、穩(wěn)定性能好的新型催化劑,可以是無機化合物、有機化合物或小肽。第140頁/共178頁生物酶工程示意圖酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能新酶分子藍圖選擇性修飾方案突變酶突變酶 新酶新酶克隆酶克隆酶產(chǎn)品效用發(fā)展酶基因遺傳設(shè)計遺傳修飾DNA重組技術(shù)DNA重組技術(shù)第141頁/共178頁第七節(jié) 維生素和輔酶一、 維

63、生素及其與輔酶的關(guān)系 維生素（vitamin）維持機體正常生命活動不可缺少的一類小分子有機化合物，人和動物不能合成它們，必須從食物中攝取。 維生素可分為脂溶性（A，D，K，E）和水溶性兩大類。 多數(shù)水溶性維生素作為輔酶的主要成分，或本身就是輔酶參與體內(nèi)代謝過程。 第142頁/共178頁第143頁/共178頁二、主要可溶性維生素和相應(yīng)輔酶 維生素維生素 輔酶輔酶 功能功能1. B1(硫胺素硫胺素) TPP -酮酸氧化脫羧酮酸氧化脫羧2. B2(核黃素核黃素 ) FMN、FAD 氫載體氫載體3. PP 尼克酸（酰胺）尼克酸（酰胺） NAD+、NADP+ 氫載體氫載體4. 泛酸（遍多酸）泛酸（遍多酸

64、） CoASH ?；d體?；d體5. B6 吡哆醇（醛、酸）吡哆醇（醛、酸） 磷酸吡哆醇（醛）磷酸吡哆醇（醛） 轉(zhuǎn)氨、脫羧、消旋轉(zhuǎn)氨、脫羧、消旋6. 葉酸葉酸 FH4(THFA) 一碳基團載體一碳基團載體7. 生物素生物素 羧化輔酶羧化輔酶8. C（抗壞血酸）抗壞血酸） 氧化還原作用氧化還原作用9.硫辛酸硫辛酸 ?；d體、氫載體?；d體、氫載體10. B12（氰鈷氨素）氰鈷氨素） 變位酶輔酶變位酶輔酶 一碳基團載體一碳基團載體第144頁/共178頁共同特點易溶于水，故易隨尿液排出。易溶于水，故易隨尿液排出。體內(nèi)不易儲存，必須經(jīng)常從食物中攝取。體內(nèi)不易儲存，必須經(jīng)常從食物中攝取。第145頁/共1

65、78頁1、維生素B1維生素維生素B1又名又名硫胺素硫胺素(thiamine)體內(nèi)活性形式為體內(nèi)活性形式為焦磷酸硫胺素焦磷酸硫胺素(TPP)第146頁/共178頁 焦磷酸硫胺素焦磷酸硫胺素(TPP) TPP是催化丙酮酸或酮戊二酸脫羧反應(yīng)酶的輔酶，又稱脫羧輔酶。NNCH3CH2NH2SCHN+CH3CH2CH2O POHOOPOOHOH第147頁/共178頁TPP是是-酮酸氧化脫羧酶的輔酶，也是酮酸氧化脫羧酶的輔酶，也是轉(zhuǎn)酮醇酶的輔酶。轉(zhuǎn)酮醇酶的輔酶。在神經(jīng)傳導中起一定的作用，抑制膽在神經(jīng)傳導中起一定的作用，抑制膽堿酯酶的活性。堿酯酶的活性。腳氣病，末梢神經(jīng)炎腳氣病，末梢神經(jīng)炎第148頁/共178

66、頁2、維生素B2（2）生化作用及缺乏癥生化作用：生化作用：FMN及及FAD是體內(nèi)氧化還原酶是體內(nèi)氧化還原酶的輔基，主要起氫傳遞體的作用。的輔基，主要起氫傳遞體的作用。缺乏癥：口角炎，唇炎，陰囊炎等。缺乏癥：口角炎，唇炎，陰囊炎等。第149頁/共178頁FMNAMPFAD核黃素FMN +2H FMNH2FAD+2H FADH2維生素B2和黃素單核苷酸（FMN）.黃素腺嘌呤二核苷（FAD）第150頁/共178頁3、泛酸（1）化學本質(zhì)及性質(zhì)泛酸泛酸(pantothenic acid)又名遍多酸又名遍多酸體內(nèi)活性形式為體內(nèi)活性形式為輔酶輔酶A(CoA) ?；d體蛋白?；d體蛋白(ACP) （2）生化作用及缺乏癥CoA及及ACP是?；D(zhuǎn)移酶的輔酶，參與?；酋；D(zhuǎn)移酶的輔酶，參與?；霓D(zhuǎn)移作用。的轉(zhuǎn)移作用。第151頁/共178頁 CoA的結(jié)構(gòu)式SH第152頁/共178頁4、維生素PP維生素維生素PP包括包括尼克酸尼克酸(nicotinic acid)尼克酰胺尼克酰胺(nicotinamide)第153頁/共178頁N+OCH2OPOOHPOOOHOOHOOPOHOHNNNNNH2OCH2OOHC