《血紅蛋白的提取和分離》教學設計

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1、 《血紅蛋白的提取和分離》教學設計 教學目標 （一）知識與技能 1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白 2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理 （二）過程與方法 體驗血紅蛋白提取和分離的實驗的嚴格要求，注意按照操作提示進行相關步驟 （三）情感、態(tài)度與價值觀 初步形成科學的思維方式，發(fā)展科學素養(yǎng)和人文精神 教學重難點 課題重點 凝膠色譜法的原理和方法 課題難點 樣品的預處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填

2、教學工具 多媒體 教學過程 （一）引入新課 蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔者， 是細胞內(nèi)含量最高的有機化和物。 對蛋白質(zhì)的研究有助于 人們對生 命過程的認識和理解。所以需要從細胞中提取蛋白質(zhì)進行研究。怎樣提取蛋白質(zhì) 呢？ （二）進行新課 1．基礎知識 蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差 萬 別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。 1．1 凝膠色譜法（分配色譜法）： （ 1）原理：（圖 5- 13a）分子量大的分子通過多孔凝

3、膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分 子量小的 分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢。 （ 2 ）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。 ( 3 ) 分離過程： ( 圖 5 — 13b) 混合物上柱 T 洗脫 T 大分子流動快、小分子流動慢 T 收集大分子 T 收集小分子 * 洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。 1. 2 緩沖溶液 (1) 原理：由弱酸和相應的強

4、堿弱酸鹽組成 ( 如 H2C0— NaHC03HC— NaC NaH2PO4/Na2HPO4 等 ) ，調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同 pH的緩沖液。 (2) 緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液 pH 的干擾而保持 pH 穩(wěn)定。 1. 3 凝膠電泳法： ( 1 ) 原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、 方 向、阻力不同，導致不同 蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。 ［思考］閱讀教材 后，填寫下表： 決定運動方

5、簡 旳成庫侖力 Q 形成阻力 4 決定運頑速率 電荷牲質(zhì)鼻 電荷曇 Q “ 2| 分干形狀工 A 分子天 ?卜# 1 4 2 (2) 分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經(jīng)膠電泳等。 (3) 分離過 程：在一定 pH 下，使蛋白質(zhì)基團帶上正電或負電；加入帶負電荷多的 SDS形 成 “蛋白質(zhì) - SDS復合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。 2?實驗設計 2.1 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為哪些基本步驟？ 樣品處理、粗分離、

6、純化、純度鑒定。 思考：是否所有種類的蛋白質(zhì)的提取和分離都是這樣的？為什么？ 不是。因為蛋白質(zhì)的來源和性質(zhì)不同，分離方法差別很大。 2.2 選擇實驗材料 （1）你認為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？ 哺乳動物血液。因為該細胞中沒有細胞核，血紅蛋白含量高。 （ 2）請閱讀教材，認識哺乳動物血液組成及血紅蛋白性質(zhì)。并思考回答下列問題： 血液由 和 兩部分 組成。 血細胞中 細胞數(shù)量最多，細胞的含量最高的化合物是 。 該化合物是由 和 構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有

7、一個能與 02 和 C02 結(jié)合的 基團。 2.3 從紅細胞中分離出血紅蛋白的過程為：洗滌紅細胞、釋放血紅蛋白、分離血紅蛋白、透 析。洗滌紅 細胞的目的是什么？ 除去血漿蛋白的雜蛋白，有利于后續(xù)步驟的分離純化。 紅細胞的洗滌過程為 血液 +檸檬酸鈉 T 低速短時離心 T 吸出上層血漿 T 紅細胞 + 5 倍體積生理鹽水 T 緩慢攪拌 10min T 低速短時離心 T 吸出上清液 T 反復洗滌直至上清液無黃色 思考：加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、

8、短時離心？為什么要緩慢攪拌？ 防止血液凝固；防止白 細胞沉淀；防止紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。 思考：你有什么方法將紅細胞中的血紅蛋白釋放出來？ 加入蒸餾水，用玻璃棒快速攪拌一段時間。 補充： 加入蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要相同。 加入甲苯的目的是溶解細胞膜， 有 利于血紅蛋白的釋放和分離。 此時， 紅細胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白， 而且還含有細 胞破碎 物、 脂質(zhì)、甲苯有機溶劑等。 怎樣除去這些雜質(zhì)呢？由于它們的密度不同， 科學家采 取了離心分離 的方法： 紅細胞破碎混合液 T 中速長時離

9、心 （2000c/min x 10min） T 濾紙過濾除去脂質(zhì) T 分液漏斗分 離出血紅蛋白 2.4 如何除無機鹽離子和小分子有機物質(zhì)呢？。 透析。半透膜的選擇透過性，大分子物質(zhì)不能通過半透 膜，離子和小分子能夠通過半透膜。 在透析過程中，血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過半透膜擴散進入到 pH= 7 的磷酸緩 沖液中。 思考：為何使用 pH= 7 的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠多于血紅蛋白溶液量？ 維持血紅蛋白的正常 特性。有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴散。 總結(jié)：通過以上四個基

10、本過程， 紅細胞中的血紅蛋白就被提取出來。 但其中還含有其他種類 的蛋白質(zhì) 分子 ( 如呼吸酶等 ) 。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開來呢？我們來研究蛋白質(zhì)提 取和分離的第二個步驟 一一粗分離 ( 凝膠色譜操作 ) 。 2.5 凝膠色譜分離蛋白質(zhì)包括：制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。 根據(jù)教材圖 5 - 19, 說出制作色譜柱需要的材料。 橡皮塞 2 個、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)、玻璃管、尼龍管等。 色譜柱的制作過程：準備材料 T 加工橡皮塞 T 安裝色譜柱 下面進行第二步 -

11、-- 凝膠色譜柱的裝填。請閱讀教材 : 色譜柱的裝填過程。 歩驟門 ①" 色謂枉垂亶固宦在支架斗 ? 操作鑒求昇 : 計算穗量 ifi 膠』 根據(jù)色厝柱怖積計算讖膠用堡屮 蘆膠顆粒亠蒸矍水 」充分溶脹 J 配制懸》拿襪門 凝膠 IS 粒+洗脫液 f 涕水浴 裝填懸浮液 一次性緩 幔倒入：輕 輕敲打 ⑤ 亠 緩沖液洗滌平衡 立刻用隣 酸緩神液洗湊平衝 樣品加入和洗脫。其基本過程是：

12、 調(diào)節(jié)緩沖液面 T 加入蛋白質(zhì)樣品 T 調(diào)節(jié)緩沖液面 T 洗脫 T 收集分裝蛋白質(zhì) 至此，血紅蛋白即可得到粗分離。在整個操作過程中，應當注意以下事項： ( 1 ) 紅細胞的洗滌： 洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。 ( 2 ) 凝膠的預處理： 沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡 ( 3 ) 色譜柱的裝填： 裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。 (4) 色譜柱成功標志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。課后小結(jié) 本課題重在讓學生了解生物科學在

13、蛋白質(zhì)領域的進展， 說明提取、分離高純度的蛋白質(zhì)的重 要性 和必要性， 并學習一些蛋白質(zhì)分離和提取的基本技術。 教師可以發(fā)揮學生的主動性， 讓 學生介紹當 前有關蛋白質(zhì)研究的新進展， 激發(fā)學生的學習興趣， 然后指出本課題的學習意義， 讓薛生初步體會分離純化蛋白質(zhì)的過程和方法 課后習題 1. 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)是（ ） A. 對其他分子的親和力 B. 溶解度 C. 所帶電荷多少 D. 相對分子質(zhì)量的大小 2. 凝膠色譜法中所用的凝膠化學

14、本質(zhì)大多是（ ） A. 糖類化合物 B. 脂質(zhì) C. 蛋白質(zhì) D. 核酸 3. 選用紅細胞作為分離蛋白質(zhì)的實驗材料，有何好處（） A. 血紅蛋白是有色蛋白 B. 紅細胞無細胞核 C. 紅細胞蛋白質(zhì)含量高 D. 紅細胞 DNA含量高 4. 將攪拌好的混合液離心來分離血紅蛋白溶液時，第二層是（ ） A. 甲苯 B. 血紅蛋白水溶液 C. 脂溶性物質(zhì)的沉淀層 D. 其他雜質(zhì)的沉淀 5. 血紅蛋白因含有（ ）而呈紅色 A. O2 B. CO C. CO2 D. 血紅素 答案： 1. D 2.A 3.A 4.D 5.D 板書 課題 3 血紅蛋白的提取和分離 1．基礎知識 2．實驗設計 2.1 蛋白質(zhì)的提取和 分離一般分為哪些基本步驟？