士別三日看HPLC填料中的表面多孔顆粒.doc

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1、 士別三日，看HPLC填料中的表面多孔顆粒 從上世紀(jì)60年代發(fā)展起來的HPLC填料算起，表面多孔顆粒（superficially porous particle，以下簡稱SPP）已有40多年的歷史了。但是在最近，這種擁有堅固粒核和表面薄層多孔結(jié)構(gòu)的填料又重新獲得長足發(fā)展-----粒徑低于3μm（sub-3 μm，以下簡稱亞-3μm）的表面多孔顆粒相比起粒徑低于2μm（sub-2 μm，以下簡稱亞-2μm）的全多孔顆粒，具有更好的柱效，但是壓降只有后者的一半。這次“色譜柱觀察”專欄就是要跟蹤報道SPP相關(guān)產(chǎn)品（近來一般被稱作核殼core

2、shell 、熔融核心 fused core 、多孔外殼porous shell填料）是如何在與之前超高壓液相（ultrahigh-pressure liquid chromatography，以下簡稱UHPLC）相關(guān)產(chǎn)品的競爭中士別三日，穎脫而出，并應(yīng)用于大、小分子分離的。 在傳統(tǒng)的液相色譜與高效液相色譜（high performance liquid chromatography，以下簡稱HPLC）中，全多孔填料諸如硅膠、氧化鋁、離子交換樹脂被廣泛應(yīng)用。這些填料所以行之有效，關(guān)鍵在于它們有高的表面積、樣品容量、不錯的保留時間，而且還能鍵合不同的有機官能團。 在上世紀(jì)60

3、年代早期，我們現(xiàn)在所認(rèn)識的HPLC在那時還沒出現(xiàn)。研究人員雖然從理論上預(yù)言液相色譜能變得更加高效，但是并沒有多少實際工作去證明這點。彼時，大部分的色譜工作者使用粒徑超過100μm的多孔顆粒做填料，開口玻璃柱做色譜柱。這些填料主要是通過用不同孔徑的篩網(wǎng)過濾不規(guī)則顆粒分類得來的。色譜工作者利用液體自身的重力來使流動相通過玻璃柱，在柱子出口收集目標(biāo)物，再把收集到的流出物進行離線分析，比如紫外-可見光光譜分析。用今天的標(biāo)準(zhǔn)來看，這些色譜圖的峰型是非常難看的。即使通過加壓提高流動相的速度，也只能得到更加寬的峰型，因為被測物在這些多孔填料中的吸附、解吸太慢了。為此必須做些事去提高色譜分離的速度，比如降低填

4、料上微孔的深度、縮短物質(zhì)的遷移路徑，又或者提高物質(zhì)的遷移速率。 早期的SPPs Purnell,Golay和Knox三人的理論還有氣相色譜上的實踐經(jīng)驗催生了Horvath教授的論文，其預(yù)言使用堅硬物質(zhì)做核心，粒核外面再覆蓋一層薄薄的多孔固體作為固定相能提高物質(zhì)的遷移速率。Horvath與其同事最先發(fā)布這種叫多孔層珠（porous layer bead ，簡稱PLB，可以看作其是有一層薄膜或表面多孔的顆粒，即SPP）的填料，并把它用于核苷酸的離子交換色譜分離。這種SPP填料以玻璃作為顆粒的核心，外面覆蓋著一層薄薄的聚苯乙烯-二乙烯苯聚合樹脂，樹脂上再鍵合陰離子交換官能團。圖1

5、展示了其與之前的大孔顆粒的不同。圖1a是早期使用的典型大多孔顆粒。當(dāng)物質(zhì)進入柱子，其會擴散到這些顆粒的孔中（流經(jīng)柱子的過程其實就是上百萬次反復(fù)吸附、解吸的過程），由于進出粘滯流動相時的擴散速度慢，這需要耗去相當(dāng)長的時間，也就是說物質(zhì)需要很長的時間才能被洗出。緩慢的物質(zhì)遷移速率是色譜圖中峰型變寬的原因。當(dāng)然，通過提高色譜柱的使用溫度可以降低流動相的粘度，但是這只能帶來小許的改善而且在 當(dāng)時也顯得不大方便使用。圖1b展示了SPP的原理。直徑40μm 圖1 的球形玻璃珠被用作基體，球體的外面覆蓋了一層薄薄的離子交換

6、樹脂、硅膠或者表面孔隙度控制在某個范圍的小珠（controlled surface porosity beads）。這外層一般有1~2μm厚。當(dāng)物質(zhì)進入色譜柱，擴散到SPP顆粒填料中時，其擴散路徑由此被限制在一個較窄的范圍內(nèi)。通過縮短填料中的孔隙深度，SPP填料縮短了物質(zhì)在粘滯流動相中的擴散路徑。這時擴散只能在填料的表面薄層上進行，物質(zhì)在兩相間的遷移速率就會大大提高。從這里我們可以看到，表面薄層越薄，物質(zhì)遷移速率越高，柱效就會越好。當(dāng)然，表面薄層變薄，容量因子（capacity factor，表現(xiàn)為柱子的柱保留 retention）與樣品容量(sample loading)就會變低。因此需要在

7、薄層厚度與容量之間取得平衡點。 相比早期LC用到的大孔顆粒，SPPs填料能使得分離速度更快（只需20~30min，而前者往往需要幾小時），分離效果更好（理論塔板高度為1~2mm），檢測靈敏度更高。用戶通過簡單的機械振動，就能把SPPs填料干法裝填到50cm與1m的不銹鋼柱子內(nèi)。許多化學(xué)基團被嘗試鍵合到薄層上，用于不同的色譜分離，比如正相、反相、離子交換色譜。在70年代早期，許多色譜分離方法的成功開發(fā)正是得益于SPP柱子的應(yīng)用。 60年代末70年代初 SPPs填料的商業(yè)化，以及在線紫外檢測器的出現(xiàn)大大促進了HPLC的發(fā)展。但是，稍后出現(xiàn)的微型全多孔硅膠顆粒在大小、裝填上取得的

8、突破性進展，柱效由此得到很大的提高，這也導(dǎo)致了早期的SPPs填料慢慢變得銷聲匿跡。圖1c展示的微型全多孔填料改善了物質(zhì)的遷移，從而使得柱效提高了至少一個數(shù)量級。除此以外，更小的多孔顆粒也預(yù)示著更大的表面積，這使得其能比SPPs填料容納更多的樣品量。這些填料也能用于制備色譜以及為取得更好的檢出限而采用的大進樣模式。 在之后的幾十年中，雖然為了解決某些特殊的分離任務(wù)，有一些新的SPPs填料得以再現(xiàn)，但不得不承認(rèn)，70年代曾大行其道的SPPs填料已從80年代初開始讓位給了微型全多孔填料，其應(yīng)用也只限于一些驗證過的舊方法或者保護柱中易于裝填的填料。 現(xiàn)代的SPPs

9、 對比直徑40μm的前輩，現(xiàn)在的SPPs填料明顯苗條多了----直徑5.0μm，薄層厚度0.25μm，孔徑300。顆粒的核心由玻璃珠變成堅固的二氧化硅，在其上面覆蓋的是一層薄薄的納米顆粒。這種SPP色譜柱被推薦用于生物大分子，比如蛋白質(zhì)的快速分離。生物大分子的擴散系數(shù)大約只有普通小分子的1/10。SPP填料上的薄層能使得這些擴散緩慢的蛋白子分子 圖2 只能在較窄的范圍內(nèi)滲透（堅硬的核心阻止了其繼續(xù)往前擴散）。對比同樣大小的全多孔顆粒，SPP具有較快的物質(zhì)遷移速率，同時能在不損失太多柱效的前提下使用較高的流速。在圖2a與圖2b中，展示了5μm粒徑的全多孔填料與5μm

10、的SPP填料。對于前者，假設(shè)物質(zhì)分子擴散到顆粒的中心位置，然后再返回，整個遷移路徑約為5μm（進出分別為2.5μm）。由于生物大分子的遷移是十分緩慢的，這會導(dǎo)致峰型的變寬，這在需要提高流速的快速分離上就顯得更加明顯。 圖2b是同樣粒徑的SPP填料，由于蛋白質(zhì)分子只需在顆粒外面的薄層進行擴散，其整個遷移路徑只有0.5μm（進出分別為0.25μm）。這距離只有前面全多孔顆粒的1/10，所以擴散的時間大大縮短，峰型變得更尖銳。即使是在高流速下，峰寬仍然比全多孔顆粒的填料窄。 從圖3a、b的色譜圖比較可以看出兩者的區(qū)別。這里分別對一組蛋白質(zhì)：lysozyme與myoglobi

11、n在752.1mm色譜柱中進行高流速色譜分離。圖3a用的是大孔徑（300 ）的全多孔硅膠填料，圖3b所用的是大孔徑（300 ）的SPPs填料。對于蛋白質(zhì)的分離，一般采用梯度分離。因為如果使用等度分離，采用 不同填料造成的柱效差異會更大。在梯度分離時，SPP填料的柱子由于具有更 快的物質(zhì)遷移速率，所以峰型比全多孔 圖3 填料的柱子明顯尖銳。在SPP填料的柱 柱溫：70℃，波長：210nm:峰1: lysozyme, 峰2： myoglobin. 子分離中，我們能輕易觀察到

12、蛋白質(zhì) lysozyme ，即峰1前面有一個不完全分離的雜質(zhì)峰。這里，我們把兩種不同填料的柱子對應(yīng)的譜圖在不同流速下做了平行比較。同時，當(dāng)流速提高，兩者的保留時間皆有縮短，梯度時間也不得不做相應(yīng)調(diào)整。 為了更好描述SPP填料的分離效率，圖4展示了八種蛋白質(zhì)在2.1mm直徑柱子中的快速梯度分離， 這過程不過僅僅耗時0.75min。 圖4 粒徑低于3μm的SPP 之前我們已經(jīng)提及孔徑為300 的SPP填料適用于大分子的快速分離。而近來亞-2μm（1.5~1.9μm）填料的發(fā)展也使得小分子的快速分離得以實現(xiàn)

13、。現(xiàn)在，裝填了亞-2μm填料的50mm短柱，其分離時間已少于1min，同時較長的柱子（大于150mm）也已具有幾萬多的理論塔板數(shù)。然而由于采用粒徑小的填料會造成柱壓增大，有時須用上超高壓液相色譜UHPLC。 最近，SPPs再次得到人們的重視。新型的SPPs雨后春筍般出現(xiàn)，名稱花樣百出，有些叫什么熔核的，也有些叫什么核殼的。這些填料顆粒直徑為2.6~2.7μm，外層的多孔層厚度為0.5μm，孔徑90~120 ，適合進行小分子的分離。相對亞-2μm的SPPs填料，此類較高粒徑的填料能提供較低的柱子壓降（比前者降低40~60%），然而仍然擁有較短的擴散路徑等其他小粒徑填料的優(yōu)點。通過特殊的

14、合成工藝，我們能控制SPP的微粒粒徑在一個很窄的范圍內(nèi)，這范圍遠比制作全多孔填料微粒時要窄。這樣，均勻的填料能更有效率地裝填到色譜柱中，這能使得范第姆特方程方程（）式中的參數(shù)A（渦流擴散項）降低。除此以外，也有研究證明參數(shù)B也會因此降低。通過同時降低范第姆特方程方程式中的三個參數(shù)，這些用粒徑為2.6~2.7 μm的SPP裝填的柱子，其柱效能媲美之前亞-2μm的SPP柱。在較低的壓 降下實現(xiàn)高柱效，這樣用戶們就能繼續(xù)使用他們原 來的LC系統(tǒng)，而不必升級到UHPLC了。

15、 圖5 另一方面，利用UHPLC系統(tǒng)也使得我們能通過使用更長的SPP柱子，從而獲得更大的理論塔板數(shù)。圖6對比了分別使用SPPs填料與亞-2μm全多孔填料進行高柱效分離的情況?，F(xiàn)在大部分的對比試驗都傾向用較短的色譜柱進行高通量應(yīng)用，耗時一般只有幾分鐘。而圖6所示的對比試驗卻是用裝填上述兩種不同填料的長柱進行的，兩根柱子都有超過10萬的理論踏板數(shù)，尺寸皆為55cm2.1mm。可以說它們具有基本相同的塔板數(shù)和分離時間。對比后能發(fā)現(xiàn)，兩者最大的不同來自柱壓的差別。對于亞-2μm的全多孔填料，柱壓已經(jīng)超過1000bar(15000psi)，然而粒徑2.7μm的SPP填料，柱壓只有547bar

16、(8200psi)。 圖5 范第姆特方程方程 已經(jīng)商業(yè)化的現(xiàn)代SPP柱子 到目前為止，只有少數(shù)幾家公司能提供SPP柱子用于大分子和小分子的分析（見下表）。菲羅門公司除了提供2.6μm粒徑的SPP填料，還推出了1.7μm粒徑規(guī)格的填料，對比亞-2μm的全多孔填料，該種填料在相同的壓降下，能得到更好的分離效率，這對之前容易因為柱外效應(yīng)出現(xiàn)峰型變寬的UHPLC系統(tǒng)來說，的確是一個大的挑戰(zhàn)。由于SPPs能用于HPLC與UHPLC系統(tǒng)，所以可以預(yù)料在未來會有更多其他的公司推出此

17、 類產(chǎn)品。另外，針對亞-3μm的SPPs填料，越來越多的固定相也正在研發(fā)當(dāng)中，相信在不久的將來，其固定相的種類能與亞-2μm或常規(guī)的HPLC全多孔填料相當(dāng)。 結(jié)論 SPP的概念在液相色譜中出現(xiàn)已有相當(dāng)時間，如今以全新面目粉墨登場后，儼然已經(jīng)成為亞-2μm全多孔填料的強勁對手。最新的SPP產(chǎn)品不僅能為大分子也能為小分子提供快速分離，特別是進行小分子分離時，其壓降比亞-2μm的全多孔填料產(chǎn)品要低許多。雖然本文不在此做深入討論，但相對亞-2μm全多孔填料，用于分離小分子的SPPs具有較厚的微粒薄層，這樣其樣品容量不會像早期的大

18、粒徑SPPs填料那樣發(fā)生很大的下降。相對亞-2μm全多孔填料，SPPs填料的可用表面積只下降了25%，然而由于SPPs顆粒的填充密度高，相同規(guī)格的柱子里，SPP擁有的固定相基團數(shù)量基本與前者相當(dāng)?shù)?。因此，上述兩種不同類型柱子的樣品容量其實也是差不多的。無論是用于小分子分析的2.6~2.7μm 粒徑的SPP柱子，還是用于大分子分析的5μm粒徑的SPP柱子，其進出口都采用2.0μm孔徑的篩網(wǎng)密封。因此這些柱子就不會像亞-2μm粒徑填料的柱子那樣容易發(fā)生堵塞。顯然易見地，隨著用戶越來越熟悉這項技術(shù)，這種填料將會有一個美好的前景。 注：本文來自Ronald E. Majors的 “The Increasing Role of Superficially Porous Particles in HPLC”。如需轉(zhuǎn)載，請注明由本人aspoul翻譯，多謝合作，本人的聯(lián)系方式：aspoul@。 （注：文件素材和資料部分來自網(wǎng)絡(luò)，供參考。請預(yù)覽后才下載，期待你的好評與關(guān)注。）