優(yōu)《血紅蛋白的提取和分離》

《優(yōu)《血紅蛋白的提取和分離》》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《優(yōu)《血紅蛋白的提取和分離》（36頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、 體 驗 從 復 雜 體 系 中 提 取 生 物 大 分 子 的 基 本 過 程 和 方 法 ， 并了 解 色 譜 法 、 電 泳 法 等 分 離 生 物 大 分 子 的 基 本 原 理 。 凝 膠 色 譜 法 電 泳 法 緩 沖 溶 液 它 們 在血 紅 蛋 白 的 提 取 中 分 別 起 到 什 么 作 用 。 凝 膠 色 譜 法 分 離 蛋 白 質(zhì) 的 原 理 電 泳 法 分 離 樣 品 的 原 理 緩 沖 溶 液 的 組 成 和 作 用 機 理凝 膠 色 譜 法 的 原 理 和 方 法 樣 品 的 處 理 色 譜 柱 填 料 的 處 理 和 色 譜 柱 的 裝 填 。 1.分 離 生

2、物 大 分 子 的 基 本 思 路 ： 選 用 一 定 的 物 理 或 化 學 的 方 法 分 離 具 有 不 同 物理 或 化 學 性 質(zhì) 的 生 物 大 分 子 。2.蛋 白 質(zhì) 分 離 和 提 取 的 原 理 ： 根 據(jù) 蛋 白 質(zhì) 各 種 特 性 的 差 異 ， 如 分 子 的 形 狀 和大 小 、 所 帶 電 荷 的 性 質(zhì) 和 多 少 、 溶 解 度 、 吸 附 性 質(zhì)和 對 其 他 分 子 的 親 和 力 等 等 ， 可 以 用 來 分 離 不 同 種類 的 蛋 白 質(zhì) 。 一 、 血 紅 蛋 白 的 提 取 和 分 離3、 提 取 分 離 方 法 凝 膠 色 譜 法 凝 膠 電

3、 泳 法 （ 一 ） 凝 膠 色 譜 法 （ 分 配 色 譜 法 ）2.凝 膠 ： 大 多 數(shù) 凝 膠 是 由 多 糖 類 化 合 物 （ 如 葡 聚 糖 或 瓊脂 糖 ） 構(gòu) 成 的 多 孔 小 球 體 ， 內(nèi) 部 有 許 多 貫 穿 的 通 道 。 根 據(jù) 被 分 離 物 質(zhì) 的 蛋 白 質(zhì) 相 對 分 子 質(zhì) 量的 大 小 ， 利 用 具 有 網(wǎng) 狀 結(jié) 構(gòu) 的 凝 膠 ， 來 進 行分 離 。1.概 念 ： 3.凝 膠 色 譜 法 的 原 理 當 相 對 分 子 量 不 同 的 蛋 白 質(zhì) 通 過 凝 膠 時 ， 相 對分 子 量 較 小 的 蛋 白 質(zhì) 容 易 進 入 凝 膠 內(nèi) 部

4、 的 通 道 ，路 程 較 長 ， 移 動 速 度 較 慢 ; 相 對 分 子 量 較 大 的 蛋 白 質(zhì) 無 法 進 入 凝 膠 內(nèi) 部 的通 道 ， 只 能 在 凝 膠 外 部 移 動 ， 路 程 較 短 ， 移 動 速度 較 快 。 依 據(jù) 的 特 性 是 ： 蛋 白 質(zhì) 分 子 量 的 大 小 。 分 離 蛋 白 質(zhì) （ 二 ） 緩 沖 溶 液 1.概 念 : 在 一 定 的 范 圍 內(nèi) ， 凡 是 能 夠 抵 制 外 加 少 量 強酸 或 強 堿 的 影 響 使 原 來 溶 液 PH值 基 本 保 持 不 變 的 混合 溶 液 。 能 夠 抵 制 外 界 的 酸 和 堿 對 溶 液

5、PH值 的 影 響 ，維 持 PH基 本 不 變 。2.作 用 : 思 考 ： 說 出 人 體 血 液 中 緩 沖 對 。 NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3 通 常 由 1 2 種 緩 沖 劑 溶 解 于 水 中 配 制 而 成 。 調(diào) 節(jié)緩 沖 劑 的 使 用 比 例 就 可 以 制 得 在 不 同 PH范 圍 內(nèi) 使 用 的緩 沖 液 。 4.提 問 ： 在 本 課 題 中 使 用 的 緩 沖 液 是 :_ , 利 用 緩 沖 液 模 擬 細 胞 內(nèi) 的 PH環(huán) 境 ， 保 證 血 紅 蛋 白 的 正 常 結(jié) 構(gòu) 和 功 能 ， 便 于 觀 察 (紅 色 )和 科 學

6、 研 究 (活 性 ) 磷 酸 緩 沖 液3.緩 沖 溶 液 的 配 制 :其 目 的 是 : 帶 電 粒 子 在 電 場 作 用 下 發(fā) 生 遷 移 的 過 程 。 許 多 重 要 的 生 物 大 分 子 ， 如 多 肽 、 核 酸 等 都 具有 可 解 離 的 基 團 ， 在 一 定 的 PH下 ， 這 些 基 團 會 帶上 正 電 或 負 電 。 在 電 場 的 作 用 下 ， 這 些 帶 電 分 子 會 向 著 與 其 所帶 電 荷 相 反 的 電 極 移 動 。 分 離 樣 品 中 各 種 分 子 帶 電 性 質(zhì) 的 差 異 以 及 分 子本 身 的 大 小 ， 形 狀 的 不 同

7、， 使 帶 電 分 子 產(chǎn) 生 不 同的 遷 移 速 度 ， 從 而 實 現(xiàn) 樣 品 中 各 種 分 子 的 分 離 。 影 響 蛋 白 質(zhì) 分 子 運 動 速 度 的 因 素 決 定運 動 方 向 形 成庫 侖 力 形 成阻 力 決 定運 動 速 率電 荷 性 質(zhì)電 荷 量分 子 形 狀分 子 大 小 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 、 聚 丙 稀 酰 胺 凝 膠 電 泳 。 1、 測 定 蛋 白 質(zhì) 分 子 量 :常 用 十 二 烷 基 硫 酸 鈉（ SDS） 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 。 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 是 由 單 體 丙 烯 酰 胺 和 交 聯(lián) 劑 N,N -亞 甲

8、基 雙 丙 烯 酰 胺 在 引 發(fā) 劑 和 催 化 劑 的 作 用 下 聚 合 交 聯(lián)成 的 具 有 三 維 網(wǎng) 狀 結(jié) 構(gòu) 的 凝 膠 。 N,N-亞 甲 基 雙 丙 烯 酰 胺 （ 形 成 交 聯(lián) ） 丙 烯 酰 胺 和 交 聯(lián) 劑N,N-亞 甲 基 雙 丙 烯 酰 胺 的 交 聯(lián) 共 聚 反 應 蛋 白 質(zhì) 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 中 的 遷 移 率 取 決于 它 所 帶 凈 電 荷 的 多 少 以 及 分 子 的 大 小 等 因 素 。2.原 理 ： SDS能 使 蛋 白 質(zhì) 發(fā) 生 完 全 變 性 。 解 聚 成 單 條肽 鏈 ， 因 此 測 定 的 結(jié) 果 只 是 單 條

9、肽 鏈 的 分 子 量 。SDS能 與 各 種 蛋 白 質(zhì) 形 成 蛋 白 質(zhì) SDS復 合 物 ，SDS所 帶 負 電 荷 的 量 大 大 超 過 了 蛋 白 質(zhì) 分 子 原 有的 電 荷 量 。 因 而 掩 蓋 了 不 同 種 蛋 白 質(zhì) 間 的 電 荷 差別 ， 使 電 泳 遷 移 率 完 全 取 決 于 分 子 的 大 小 。3. SDS作 用 機 理 : 用 SDS測 定 蛋 白 質(zhì) 分 子 量 的 方 法 使 用 SDS 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 測 定 蛋白 質(zhì) 的 分 子 量 時 ， 可 選 用 一 組 已 知 分 子 量的 標 準 蛋 白 同 時 進 行 電 泳 ，

10、 根 據(jù) 已 知 分 子量 的 標 準 蛋 白 的 電 泳 區(qū) 帶 位 置 ， 可 以 測 定未 知 蛋 白 質(zhì) 的 分 子 量 。 市 場 上 有 高 分 子 量 、次 高 分 子 量 及 低 分 子 量 的 標 準 蛋 白 試 劑 出售 。 二 、 實 驗 操 作樣 品 處 理 粗 分 離 純 化 純 度 鑒 定1.樣 品 處 理 ：（ 一 ） 蛋 白 質(zhì) 提 取 和 分 離 步 驟（ 二 ） 操 作 過 程 可 選 用 豬 、 牛 、 羊 或 其 他 脊 椎 動 物 的 血 液 來分 離 血 紅 蛋 白 。 血液 血 漿 水 分固 體 物 質(zhì) ： 血 漿 蛋 白 、 無 機 鹽 、 磷

11、脂 、 葡 萄 糖 等血 細 胞 白 細 胞血 小 板紅 細 胞（ 最 多 ） 血 紅 蛋 白（ 90 ） 兩 個 肽 鏈兩 個 一 肽 鏈四 個 亞 鐵 血 紅 素 基 團2.提 問 ： 血 液 有 哪 些 成 分 ？ 1.提 問 ： 用 雞 的 紅 細 胞 提 取 DNA， 用 豬 、 牛 、 羊 的紅 細 胞 提 取 血 紅 蛋 白 的 原 因 是 什 么 ？ 雞 的 紅 細 胞 具 有 細 胞 核 ， 含 有 DNA， 便 于 進 行 DNA的 提 取 ； 人 的 紅 細 胞 無 細 胞 核 ， 結(jié) 構(gòu) 簡 單 ， 血 紅 蛋白 含 量 豐 富 ， 便 于 提 取 血 紅 蛋 白 。

12、血 紅 蛋 白 兩 個 肽 鏈兩 個 一 肽 鏈四 個 亞 鐵 血 紅 素 基 團每 個 肽 鏈 環(huán) 繞 一 個 亞 鐵 血 紅 素 基 團 ，此 基 團 可 攜 帶 一 分 子 O 2或 一 分 子 CO 2，血 紅 蛋 白 因 含 有 血 紅 素 而呈 紅 色 。 血 紅 蛋 白 的 特 點 ： (1)紅 細 胞 的 洗 滌 :去 除 雜 質(zhì) 蛋 白 ， 利 于 后 續(xù) 血 紅 蛋 白 的 分 離 純 化 .1、 采 集 血 樣2、 低 速 短 時 間 離 心 （ 速 度 越 高 和 時 間 越 長 ， 會 使 白 細 胞 等 一 同 沉 淀 ， 達 不 到 分 離 的 效 果 ）3、 吸

13、 取 血 漿 ： 上 層 透 明 的 黃 色 血 漿 。4、 鹽 水 洗 滌 ： 下 層 暗 紅 色 的 紅 細 胞 +五 倍 體 積 的 0.9 的 NaCl溶 液 洗 滌 ， 攪 拌 10min5、 低 速 短 時 間 離 心 ：6、 重 復 3、 4、 5步 驟 三 次 上 清 液 中 已 沒 有 黃 色 ： 紅 細 胞 洗 滌 干 凈 。 目 的 : 操 作 ：洗 滌 次 數(shù) 過 少 ,無 法 除 去 血 漿 蛋 白 。 加 蒸 餾 水 到 原 血 液 體 積 ，加 40 體 積 的 甲 苯 （ 溶 解 細 胞 膜 ）置 于 磁 力 攪 拌 器 攪 拌 10min（ 加 速 細 胞 破

14、 裂 ）紅 細 胞 破 裂 ， 釋 放 出 血 紅 蛋 白 (3)分 離 血 紅 蛋 白 溶 液 ： 過 程 ： 將 攪 拌 好 混 合 液 轉(zhuǎn) 移 到 離 心 管 內(nèi) ， 以 2000r/min的 速度 離 心 10 min。 試 管 中 溶 液 層 次 ：第 1層 （ 最 上 層 ） ： 甲 苯 層 （ 無 色 透 明 ） ；第 2層 （ 中 上 層 ） ： 脂 溶 性 物 質(zhì) 沉 淀 層 （ 白 色 薄 層 固 體 ） ；第 3層 （ 中 下 層 ） ： 血 紅 蛋 白 的 水 溶 液 層 （ 紅 色 透 明 液 體 ） ；第 4層 （ 最 下 層 ） ： 雜 質(zhì) 沉 淀 層 （ 暗 紅

15、 色 ） 。 分 離 ：濾 紙 過 濾 ： 除 去 脂 溶 性 沉 淀 層 ，分 液 漏 斗 中 靜 置 ： 分 出 下 層 的 紅 色 透 明 液體 。 甲 苯 層 （ 無 色 透 明 ） 白 色 薄 層 固 體 紅 色 透 明 液 體雜 質(zhì) 沉 淀 層 （ 暗 紅 色 ） 試 管 中 溶 液 層 次 (4)透 析 ： 過 程 ：取 1ml的 血 紅 蛋 白 溶 液 裝 入 透析 袋 中 ， 將 透 析 袋 放 入 盛 有300ml的 20mmol/l的 磷 酸 緩 沖液 中 （ pH為 7.0） ， 透 析 12h 目 的 ：除 去 樣 品 中 分 子 量 較 小 的 雜 質(zhì) 和 離 子

16、?；?用 于 更 換 樣 品 的 緩 沖 液 。 20mmol/L磷 酸 緩 沖 液1mL 2.凝 膠 色 譜 操 作 :（ 1） 凝 膠 色 譜 柱 的 制 作 ： 取 長 40厘 米 ， 內(nèi) 徑 1.6厘 米 的 玻 璃 管 ， 兩 端 磨 平 。 底 塞 的 制 作 ： 打 孔 挖 出 凹 穴 安 裝 移 液 管 頭 部 覆 蓋 尼 龍 網(wǎng) ， 再 用100目 尼 龍 紗 包 好 ， 插 到 玻 璃 管 的 一 端 。 注 意 事 項 ： 玻 璃 管 的上 部 不 得 超 出 橡 皮 塞 的 凹 穴 底 面 ， 否 則 難 以 鋪 實 尼 龍 網(wǎng) ， 還會 導 致 液 體 殘 留 ， 蛋

17、 白 質(zhì) 分 離 不 徹 底 。 頂 塞 的 制 作 ： 打 孔 安 裝 玻 璃 管 。 組 裝 ： 將 上 述 三 者 按 相 應 位 置 組 裝 成 一 個 整 體 。 安 裝 其 他 附 屬 結(jié) 構(gòu) 。 （ 2） 凝 膠 色 譜 柱 的 裝 填 凝 膠 的 選 擇 ：A、 材 料 ： 交 聯(lián) 葡 聚 糖 凝 膠 （ G-75） 。B、 代 表 意 義 ： “ G” 表 示 凝 膠 的 交 聯(lián) 程 度 ， 膨 脹 程 度 及 分 離 范 圍 。 75表 示 凝 膠 的 得 水 值 ， 即 每 克 凝 膠 膨 脹 時 吸 水 7.5克 。 凝 膠 的 前 處 理 ： 配 置 凝 膠 懸 浮

18、液 ： 計 算 并 稱 取 一 定 量 的 凝 膠 浸 泡 于 蒸 餾 水 或 洗 脫 液 中 充 分 溶 脹 后 ， 配 成 凝 膠 懸 浮 液 。 凝 膠 色 譜 柱 的 裝 填 方 法 ：A、 固 定 ： 將 色 譜 柱 裝 置 固 定 在 支 架 上 。B、 裝 填 ： 將 凝 膠 懸 浮 液 一 次 性 緩 慢 倒 入 色 譜 柱內(nèi) ， 裝 填 時 輕 輕 敲 動 色 譜 柱 ， 使 凝 膠 填 裝 均 勻注 意 ：1、 裝 填 時 盡 量 緊 密 ： 降 低 凝 膠 顆 粒 之 間 的 空 隙 。2、 裝 填 凝 膠 柱 時 不 得 有 氣 泡 存 在 ： 因 為 氣 泡 會 攪亂

19、 洗 脫 液 中 蛋 白 質(zhì) 的 洗 脫 次 序 ， 降 低 分 離 效 果 。 洗 滌 平 衡 ：連 接 緩 沖 液 洗 脫 瓶 ， 在 50cm高 的操 作 壓 下 ， 用 300ml的 20mmol/L的磷 酸 緩 沖 液 （ pH為 7.0） 充 分 洗 滌平 衡 12h。注 意 ：1、 液 面 不 要 低 于 凝 膠 表 面 ， 否 則可 能 有 氣 泡 混 入 ， 影 響 分 離 效 果2、 不 能 發(fā) 生 洗 脫 液 流 干 ， 露 出 凝膠 顆 粒 的 現(xiàn) 象 。 （ 3） 樣 品 加 入 與 洗 脫 調(diào) 節(jié) 緩 沖 液 面 ： 打 開 下 端 出 口 ， 使 緩 沖 液 下

20、降 到 與 凝 膠 面 平 齊 ， 關(guān) 閉 出 口 滴 加 透 析 樣 品 ： 吸 管 吸 1ml樣 品 加 到 色 譜 柱 的 頂 端 ， 注 意 ： 1、 不 要 觸 及 并 破 壞 凝 膠 面 。 2、 貼 壁 加 樣 3、 吸 管 管 口 貼 著 管 壁 環(huán) 繞 移 動 加 樣 樣 品 滲 入 凝 膠 床 ： 打 開 下 端 出 口 ， 使 樣 品 滲 入 凝 膠 床 內(nèi) ， 樣 品 完 全 進 入 凝 膠 層 后 ， 關(guān) 閉 下 端 出 口 洗 脫 ： 加 入 pH=7.0 的 20mmol/l的 磷 酸 緩 沖 液 到 適 當 高 度 ， 連 接 緩 沖 液 洗 脫 瓶 ， 打 開

21、 下 端 出 口 進 行 洗 脫 。 收 集 ： 待 紅 色 的 蛋 白 質(zhì) 接 近 色 譜 柱 底 端 時 ， 用 試 管 收 集 流 出 液 ， 每 5ml收 集 一 試 管 ， 連 續(xù) 收 集 。（ 如 果 紅 色 區(qū) 帶 均 勻 一 致 的 移 動 ， 說 明 色 譜 柱 制 作 成 功 ） 注 意 ： 正 確 的 加 樣 操 作 是 ： 1、 不 要 觸 及 并 破 壞 凝 膠 面 。2、 貼 壁 加 樣 。 3、 使 吸 管 管 口 沿 管 壁 環(huán) 繞 移 動 。 思 考 下 面 的 問 題 ：讓 血 紅 蛋 白 處 在 穩(wěn) 定 的 pH范 圍 內(nèi) ， 維 持 結(jié) 構(gòu) 和功 能 正

22、 常 。 1、 在 血 紅 蛋 白 純 化 的 整 個 過 程 中 不 斷 用 磷 酸 緩沖 液 處 理 的 目 的 是 什 么 ？ 2、 與 其 他 蛋 白 質(zhì) 相 比 ， 血 紅 蛋 白 有 什 么 特 點 ？這 一 特 點 對 你 進 行 血 紅 蛋 白 的 分 離 有 什 么 啟 示 ？血 紅 蛋 白 是 有 色 蛋 白 ， 因 此 在 凝 膠 色 譜 分 離 時 可 以 通 過觀 察 顏 色 來 判 斷 什 么 時 候 應 該 收 集 洗 脫 液 。 這 使 血 紅 蛋白 的 分 離 過 程 非 常 直 觀 ， 大 大 簡 化 了 實 驗 操 作 。 血 紅 蛋 白 提 取 和 分

23、離 的 程 序 包 括 ：樣 品 處 理 、 粗 分 離 、 純 化 和 純 度 鑒 定 。樣 品 的 處 理 ： 通 過 洗 滌 紅 細 胞 、 血 紅 蛋 白 的 釋 放 、 離 心 等 操 作 收 集 到 血 紅 蛋 白 溶 液 ，樣 品 的 粗 分 離 :透 析 去 除 分 子 量 較 小 的 雜 質(zhì)樣 品 的 純 化 ： 凝 膠 色 譜 法 除 去 相 對 分 子 質(zhì) 量 較 大 的 雜 質(zhì) 蛋 白純 度 鑒 定 :聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 進 行 純 度 鑒 定 。3、 你 能 描 述 血 紅 蛋 白 分 離 的 完 整 過 程 嗎 ？ 鑒 定 血 紅 蛋 白 純 度 。

24、3.方 法 步 驟 ： （ 略 ） 觀 察 處 理 的 血 液 樣 品 離 心 后 是 否 分 層 ， 如 果 分 層 不 明 顯 ，可 能 是 洗 滌 次 數(shù) 少 、 未 能 除 去 血 漿 蛋 白 的 原 因 。 此 外 ， 離 心 速 度 過 高 和 時 間 過 長 ， 會 使 白 細 胞 和 淋 巴 細 胞一 同 沉 淀 ， 也 得 不 到 純 凈 的 紅 細 胞 ， 影 響 后 續(xù) 血 紅 蛋 白 的 提 取純 度 。 三 、 實 驗 結(jié) 果 分 析 與 評 價 1、 你 是 否 完 成 了 對 血 液 樣 品 的 處 理 ？ 你 能 描 述 處理 后 的 樣 品 發(fā) 生 了 哪 些

25、 變 化 嗎 ？ 2、 你 裝 填 的 凝 膠 色 譜 柱 是 否 有 氣 泡 產(chǎn) 生 ？ 你 的 色 譜柱 裝 填 得 成 功 嗎 ？ 你 是 如 何 判 斷 的 ？1、 由 于 凝 膠 是 一 種 半 透 明 的 介 質(zhì) ， 因 此 可 以 在 凝 膠 柱 旁 放一 支 與 凝 膠 柱 垂 直 的 日 光 燈 ， 檢 查 凝 膠 是 否 裝 填 得 均 勻 。2、 加 入 大 分 子 的 有 色 物 質(zhì) ， 例 如 藍 色 葡 聚 糖 2000或 紅 色葡 聚 糖 ， 觀 察 色 帶 移 動 的 情 況 。 如 果 色 帶 均 勻 、 狹 窄 、 平整 ， 說 明 凝 膠 色 譜 柱 的

26、性 能 良 好 。3、 色 譜 柱 出 現(xiàn) 紋 路 或 是 氣 泡 ， 輕 輕 敲 打 柱 體 以 消 除 氣 泡 ，消 除 不 了 時 要 重 新 裝 柱 。 紅 色 區(qū) 帶 ： 均 勻 、 狹 窄 、 平 整 ， 隨 著 洗 脫 液 緩 慢 流 出 ；說 明 凝 膠 色 譜 柱 裝 填 得 很 成 功 、 分 離 操 作 也 正 確紅 色 區(qū) 帶 ： 歪 曲 、 散 亂 、 變 寬 ， 說 明 分 離 的 效 果 不 好 ，這 與 凝 膠 色 譜 柱 的 裝 填 有 關(guān) 。 3、 你 能 觀 察 到 蛋 白 質(zhì) 的 分 離 過 程 中 紅 色 區(qū) 帶 的 移動 嗎 ？ 請 描 述 紅 色 區(qū) 帶 的 移 動 情 況 ， 并 據(jù) 此 判 斷 分 離效 果 ？ 啟 動 Internet Explorer 瀏 覽 器 .lnk