干擾素制備的工藝流程

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1、干 擾 素 制 備 的 工 藝 流 程 什 么 是 干 擾 素 ？v 概 念 (interferon,IFN)： 機(jī) 體 免疫 細(xì) 胞 產(chǎn) 生 的 一 類 細(xì) 胞 因 子 ， 是機(jī) 體 受 到 病 毒 感 染 時(shí) ， 免 疫 細(xì) 胞通 過(guò) 抗 病 毒 應(yīng) 答 反 應(yīng) 而 產(chǎn) 生 的 一組 結(jié) 構(gòu) 類 似 、 功 能 接 近 的 生 物 調(diào)節(jié) 蛋 白 。v 根 據(jù) 分 子 結(jié) 構(gòu) 和 抗 原 性 的 差 異 分為 、 、 、 等 4個(gè) 類 型 。 干 擾 素 又 依 其 結(jié) 構(gòu) 分 為 1b、 2a、 2b等 亞 型 其 區(qū) 別 在 于 個(gè) 別 氨 基 酸的 差 異 上 ， 早 期 干 擾 素

2、是 用病 毒 誘 導(dǎo) 人 白 血 球 產(chǎn) 生 的 ，產(chǎn) 量 低 、 價(jià) 格 昂 貴 ， 不 能 滿足 需 要 ， 現(xiàn) 在 可 利 用 基 因 工程 技 術(shù) 并 在 大 腸 桿 菌 中 發(fā) 酵 、表 達(dá) 來(lái) 進(jìn) 行 生 產(chǎn) 。 v 目 的 基 因 的 分 離克 隆 載 體 目 的 基 因 與 克 隆載 體 的 體 外 重 組 重 組 體 導(dǎo) 入 大 腸 桿 菌 K12 受 體 菌 的 培 養(yǎng) 及 篩 選 從 受 體 菌 中 獲 取 目 的 基 因表 達(dá) 載 體 重 組 質(zhì) 粒導(dǎo) 入 大 腸 桿 菌 受 體 菌 的 篩 選 ， 表 達(dá) 性 、 穩(wěn) 定 性 等 檢 測(cè) 工 程 菌 基 因 工 程 菌

3、 的 制 備 一 、 目 的 基 因 的 分 離 與 獲 得v 1. 設(shè) 計(jì) 合 成 干 擾 素 基 因 的 兩 端 引 物 （ 完 全 的 ） ， 每 條 引 物內(nèi) 或 5 -端 最 好 有 內(nèi) 切 酶 酶 切 位 點(diǎn) 。v 2. 有 藥 物 誘 導(dǎo) 細(xì) 胞 ， 如 佛 波 酯 ， 使 細(xì) 胞 表 達(dá) 干 擾 素 升 高 。v 3. 破 碎 細(xì) 胞 ， 提 取 細(xì) 胞 總 mRNA.v 4. 用 逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒 逆 轉(zhuǎn) 錄 ， 把 總 mRNA逆 轉(zhuǎn) 錄 成 cDNAv 5. 以 cDNA為 模 板 、 干 擾 素 引 物 為 引 物 ， PCR， 得 到 完 全 的 干擾 素 基

4、因 的 PCR產(chǎn) 物 二 、 目 的 基 因 與 克 隆 載 體 進(jìn) 行 體 外 重 組v 1. 提 取 載 體 （ 質(zhì) 粒 、 病 毒 等 ） ， 雙 酶 切 ， 再 把 干 擾 素 基 因的 PCR產(chǎn) 物 用 相 應(yīng) 的 酶 酶 切 ， 用 連 接 酶 連 接EcoR I BamH IEcoR I BamH I 2.連 接 完 成 后 分 離 純 化 ， 測(cè) 序 ， 與 原 干 擾 素 序 列 比 對(duì) 。 3.鑒 定 序 列 無(wú) 誤 后 （ 無(wú) 義 突 變 也 行 ） ， 導(dǎo) 入 受 體 細(xì) 胞 ， 篩 選 三 、 重 組 體 引 入 宿 主 細(xì) 胞 將 cDNA克 隆 到 含 有 四 環(huán)

5、 素 、 氨 芐 青 霉 素 抗 性 基 因 的 質(zhì)粒 pBR322中 ， 轉(zhuǎn) 化 到 大 腸 桿 菌 ， 重 組 的 載 體 DNA 分 子 在 一定 條 件 下 轉(zhuǎn) 化 入 大 腸 桿 菌 ， 形 成 攜 帶 質(zhì) 粒 的 菌 株 。 四 、 從 大 腸 桿 菌 k12獲 取 目 的 基 因 由 于 質(zhì) 粒 重 組 時(shí) 有 3種 基 本 方 式 ， 即 ： 目 的 基 因 與 克 隆 載 體重 組 ， 目 的 基 因 片 段 與 目 的 基 因 片 段 重 組 ， 克 隆 載 體 與 克 隆載 體 重 組 ； 另 外 重 組 過(guò) 程 可 能 會(huì) 發(fā) 生 基 因 突 變 情 況 v 流 程 ：

6、 步 驟 一 ： 將 細(xì) 菌 涂 布 到 含 氨 芐 青 霉 素 的 培 養(yǎng) 基 上 培 養(yǎng) ，就 可 得 到 質(zhì) 粒 PBR322或 重 組 質(zhì) 粒 的 細(xì) 菌 單 菌 落 。 v 步 驟 二 ： 步 驟 一 獲 得 的 每 一 個(gè) 細(xì) 菌 單 菌 落 標(biāo) 記 為 a、 b、c、 d等 ， 在 每 一 個(gè) 單 菌 落 中 挑 取 部 分 細(xì) 菌 轉(zhuǎn) 涂 到 含 有 四 環(huán) 素的 培 養(yǎng) 基 上 ， 不 能 生 長(zhǎng) 的 是 絕 大 部 分 含 有 重 組 質(zhì) 粒 的 細(xì) 菌 及少 量 可 能 發(fā) 生 突 變 的 非 重 組 質(zhì) 粒 的 細(xì) 菌 單 菌 落 。 原 因 ： 因 為PBR322含

7、有 抗 四 環(huán) 素 基 因 ， 重 組 質(zhì) 粒 中 目 的 基 因 插 在 抗 四 環(huán)素 基 因 中 ， 使 其 結(jié) 構(gòu) 破 壞 ， 失 去 抗 四 環(huán) 素 作 用 。 五 、 提 取 重 組 質(zhì) 粒v 1、 對(duì) 上 一 步 獲 得 含 目 的 基 因 的 大 腸 桿 菌 在 含 有 氯 霉 素 的 培養(yǎng) 基 中 擴(kuò) 大 培 養(yǎng) 15h。 培 養(yǎng) 時(shí) 間 ： 前 人 實(shí) 驗(yàn) 證 實(shí) 大 腸 桿 菌 K12生 長(zhǎng) 前 6h為 遲 緩 期 , 615. 5h為 對(duì) 數(shù) 增 時(shí) 期 , 15. 5 19. 5h為 穩(wěn) 定 期 , 19. 5h后 為 衰 亡 期 。 氯 霉 素 ： 氯 霉 素 可 抑

8、 制 宿主 的 蛋 白 質(zhì) 合 成 ， 結(jié) 果 阻 止 了 細(xì) 菌 染 色 體 的 復(fù) 制 ， 然 而 ， 松弛 型 質(zhì) 粒 仍 可 繼 續(xù) 復(fù) 制 。v 2、 細(xì) 菌 的 收 獲 和 裂 解 ） 用 合 適 轉(zhuǎn) 頭 于 4 以 4000轉(zhuǎn) /分 離 心 15分 鐘 ， 棄 上 清 ， 敞開(kāi) 離 心 管 口 并 倒 置 離 心 管 使 上 清 全 部 流 盡 。 v ） 將 細(xì) 菌 沉 淀 重 懸 于 100ml用 冰 預(yù) 冷 的 STE中 。STE0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)按 步 驟 ） 所 述 方 法 離

9、心 ， 以 收 集 細(xì) 菌 細(xì) 胞 。v 3、 堿 裂 解 法 ） 將 冼 過(guò) 的 500ml 培 養(yǎng) 物 的 細(xì) 菌 沉 淀 物 來(lái) 自 收 獲 細(xì) 菌 的步 驟 3 重 懸 于 10ml（ 18ml） 溶 液 中 。溶 液 :50mmol/L葡 萄 糖25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)溶 液 可 成 批 配 制 ， 在 10 lbf/in2(6.895x104Pa)高 壓 下 蒸氣 滅 菌 15分 鐘 ， 貯 存 于 。 v ） 加 1ml(2ml)新 配 制 的 溶 菌 酶 溶 液 10mg/ml,溶 于10mmol/L Tris.Cl

10、(pH8.0)。 當(dāng) 溶 液 的 pH值 低 于 8.0時(shí) ， 溶菌 酶 不 能 有 效 工 作 。 ） 加 20ml(40ml)新 配 制 的 溶 液 。溶 液 :0.2mol/L NaOH(臨 用 前 用 10mol/L貯 存 液 現(xiàn) 用 現(xiàn) 稀 釋 ）1 SDS蓋 緊 瓶 蓋 ， 緩 緩 顛 倒 離 心 瓶 數(shù) 次 ， 以 充 分 混 勻 內(nèi) 容 物 。 于 室溫 放 置 5-10分 鐘 。v ） 加 15nl(20ml)用 冰 預(yù) 冷 的 溶 液 。溶 液 :5mol/L乙 酸 鉀 60ml冰 乙 酸 11.5ml水 28.5ml v 所 配 成 的 溶 液 對(duì) 鉀 是 mol/L，

11、對(duì) 乙 酸 根 是 5mol/L。封 住 瓶 口 ， 搖 動(dòng) 離 心 瓶 數(shù) 次 以 混 勻 內(nèi) 容 物 ， 此 時(shí) 應(yīng) 不 再 出 現(xiàn)分 明 的 兩 個(gè) 液 相 。 置 冰 上 放 10分 鐘 ， 應(yīng) 形 成 一 白 色 絮 狀 沉 淀 。于 0 放 置 后 所 形 成 的 沉 淀 應(yīng) 包 括 染 體 DNA、 高 分 子 量 RNA和鉀 SDS 蛋 白 質(zhì) 膜 復(fù) 合 物v ） 用 合 適 轉(zhuǎn) 頭 于 4 以 4000轉(zhuǎn) /分 離 心 15分 鐘 ， 不 開(kāi) 剎 車 而使 轉(zhuǎn) 頭 自 然 停 轉(zhuǎn) 。 如 果 細(xì) 菌 碎 片 貼 壁 不 緊 ， 可 以 5000轉(zhuǎn) /分再 度 離 心 20分

12、 鐘 ， 然 后 盡 可 能 將 上 清 全 部 轉(zhuǎn) 到 另 一 瓶 中 ，棄 去 殘 留 在 離 心 管 內(nèi) 的 粘 稠 狀 液 體 。 未 能 形 成 致 密 沉 淀 塊 的原 因 通 常 是 由 于 溶 液 與 細(xì) 菌 裂 解 物 混 合 不 充 分 v ） 上 清 過(guò) 濾 至 一 250ml離 心 瓶 中 ， 加 0.6體 積 的 異 丙 醇 ， 充分 混 勻 ， 于 室 溫 放 置 10分 鐘 。v ） 用 合 適 轉(zhuǎn) 頭 于 室 溫 以 500轉(zhuǎn) /分 離 心 15分 鐘 ， 回 收 核 酸 。如 于 4 離 心 ， 鹽 也 會(huì) 了 生 沉 淀 。v ） 小 心 倒 掉 上 清 ，

13、 敞 開(kāi) 瓶 口 倒 置 離 心 瓶 使 殘 余 上 清 液 流 盡 ，于 室 溫 用 70 乙 醇 洗 滌 沉 積 管 壁 。 倒 出 乙 醇 ， 用 與 真 空 裝 置相 聯(lián) 的 巴 期 德 吸 出 附 于 瓶 壁 的 所 有 液 滴 ， 于 室 溫 將 瓶 倒 置 放在 紙 巾 上 ， 使 最 后 殘 余 的 痕 量 乙 醇 揮 殆 盡 。v ） 用 3ml TE(pH8.0)溶 解 核 酸 沉 淀 。v 10） 純 化 。 六 、 質(zhì) 粒 DNA的 純 化v （ 一 ） 聚 乙 二 醇 沉 淀 法 提 取 質(zhì) 粒 ） 將 核 酸 溶 液 所 得 轉(zhuǎn) 入 15ml orex 管 中 ，

14、再 加 3ml 用 冰 預(yù) 冷 的5mol/L LiCl溶 液 ， 充 分 混 勻 ， 用 合 適 轉(zhuǎn) 頭 于 下 以 10 000轉(zhuǎn) /分 離 心10分 鐘 。 LiCl可 沉 淀 高 分 子 RNA。 ） 將 上 清 轉(zhuǎn) 移 到 另 一 30mlCorex管 內(nèi) ， 加 等 量 的 異 丙 醇 ， 充 分 混 勻 ， 用 SorvallSS34轉(zhuǎn) 頭 （ 或 與 其 相 當(dāng) 的 轉(zhuǎn) 尖 ） 于 室 溫 以 10 000轉(zhuǎn) /分 離 心 10分 釧 ， 回 收 沉 淀 的 核 酸 。 ） 小 心 去 掉 上 清 ， 敞 開(kāi) 管 口 ， 將 管 倒 置 以 使 最 后 殘 留 的 液 滴 流

15、盡 。 于室 溫 用 70 乙 醇 洗 滌 沉 淀 及 管 壁 ， 流 盡 乙 醇 ， 用 與 真 空 裝 置 相 連 的 巴 其德 吸 管 吸 去 附 于 管 壁 的 所 有 液 滴 ， 敞 開(kāi) 管 口 并 將 管 侄 置 ， 在 紙 巾 上 放 置幾 分 鐘 ， 以 使 最 后 殘 余 的 痕 量 乙 醇 蒸 發(fā) 殆 盡 。 ） 用 500 l含 無(wú) DNA酶 的 胰 RNA酶 (20 g/ml ） 的 TE（ pH8.0） 溶 解 沉 淀 ，將 溶 液 轉(zhuǎn) 到 一 微 量 離 心 管 中 ， 于 室 溫 放 置 30分 鐘 。 v ） 加 500 l含 13 （ w/v)聚 乙 二 醇

16、（ PEG 8000） 的1.6mol/L NaCl,充 分 混 合 ， 用 微 量 離 心 機(jī) 于 以12000g離 心 分 鐘 ， 以 回 收 質(zhì) 粒 。 ） 吸 出 上 清 ， 用 400 l TE(pH8.0)溶 解 質(zhì) 粒 DNA沉 淀 。用 酚 、 酚 ： 氯 仿 、 氯 仿 各 抽 次 。 ） 將 水 相 轉(zhuǎn) 到 另 一 微 量 離 心 管 中 ， 加 100 l 10mol/L乙 醇 銨 ， 充 分 混 勻 ， 加 倍 體 積 （ 約 1ml） 乙醇 ， 于 室 溫 放 置 10分 鐘 ， 于 4 以 12 000g離 心 5分 鐘 ，以 回 收 沉 淀 的 質(zhì) 粒 。 ） 吸

17、 去 上 清 ， 加 200 l處 于 4 以 12 000g離 心 2分 鐘 。 ） 吸 去 上 清 ， 敞 開(kāi) 管 口 ， 將 管 置 于 實(shí) 驗(yàn) 桌 上 直 到 最后 可 見(jiàn) 的 痕 量 乙 醇 蒸 發(fā) 殆 盡 。10） 用 500 l TE（ pH8.0） 溶 解 沉 淀 1:100稀 釋 用 TE（ pH8.0) 后 測(cè) 量 OD 260， 計(jì) 算 質(zhì) 粒 DNA的 濃 度（ 1OD260 50 g質(zhì) 粒 DNA/ml） ， 然 后 將 DNA貯 于 20 。 七 、 對(duì) 重 組 質(zhì) 粒 的 檢 測(cè) 與 目 的 基 因 提 取v 目 的 基 因 獲 取v 對(duì) 獲 得 的 質(zhì) 粒 進(jìn)

18、行 雙 酶 切 ， 獲 得 目 的 基 因 與 PBR322質(zhì) 粒 片段 ， 通 過(guò) 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 ， 由 于 目 的 基 因 與 PBR322質(zhì) 粒 片段 相 對(duì) 分 子 量 不 同 ， 在 電 泳 過(guò) 程 中 產(chǎn) 生 不 同 的 條 帶 ， 通 過(guò) 與已 知 基 因 長(zhǎng) 度 的 對(duì) 比 ， 我 們 可 以 選 出 相 應(yīng) 的 目 的 基 因 ， 接 著利 用 Qiagen純 化 柱 回 收 純 化 DNA。 具 體 ： 用 3倍 體 積 的 特 殊高 鹽 溶 液 于 55 融 化 帶 有 目 的 基 因 的 DNA片 段 的 瓊 脂 糖 凝 膠塊 ， 將 DNA釋 放 到 水

19、 溶 液 中 。 然 后 將 其 通 過(guò) Qiagen純 化 柱 ，經(jīng) 過(guò) 如 圖 結(jié) 合 洗 滌 洗 脫 步 驟 ， 直 接 得 到 純 化 的 DNA樣 品 。 v 利 用 核 酸 探 針 雜 交 法 鑒 定 目 的 基 因 八 、 目 的 基 因 與 表 達(dá) 載 體 的 組 合 與 導(dǎo) 入v 表 達(dá) 載 體 ： PBV220,， 將 PBV220和 目 的 基 因 用 雙 酶 切 法 處 理 ，退 火 后 連 接 ， 構(gòu) 建 重 組 質(zhì) 粒 ， 利 用 CaCl2法 導(dǎo) 入 到 宿 主 大 腸桿 菌 中 ， 構(gòu) 建 工 程 菌 ， 在 培 養(yǎng) 基 中 培 養(yǎng) ， 利 用 干 擾 素 性

20、質(zhì) 鑒定 目 的 工 程 菌 ， 分 離 工 程 菌 ， 擴(kuò) 大 培 養(yǎng) ， 提 取 出 質(zhì) 粒 ， 分 析質(zhì) 粒 穩(wěn) 定 性 。 干 擾 素 的 發(fā) 酵 工 藝 過(guò) 程啟 開(kāi) 種 子 制 備 種 子 液 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 粗 提 精 提 半 成 品 制 備 半 成 品 檢 定 分 裝 凍 干 成 品 檢 定 成 品 包 裝 v 1 菌 種 制 備 取 70 下 保 存 的 甘 油 管 菌 種 （ 工 作 種子 批 ） ， 于 室 溫 下 融 化 。 然 后 ， 接 入 搖 瓶 ， 培 養(yǎng) 溫 度 30 ，pH7.0， 250 r/min活 化 培 養(yǎng) 18 2小 時(shí) 后 ， 進(jìn) 行 吸 光 值

21、 測(cè) 定和 發(fā) 酵 液 雜 菌 檢 查 。v 2 種 子 罐 培 養(yǎng) 將 已 活 化 的 菌 種 接 入 裝 有 30L培 養(yǎng) 基 的種 子 罐 中 ， 接 種 量 10%， 培 養(yǎng) 溫 度 30 ， pH7.0， 級(jí) 聯(lián) 調(diào) 節(jié) 通氣 量 和 攪 拌 轉(zhuǎn) 速 ， 控 制 溶 解 氧 為 30%， 培 養(yǎng) 3 4小 時(shí) ， 轉(zhuǎn) 入發(fā) 酵 罐 中 ， 同 時(shí) 取 樣 發(fā) 酵 液 進(jìn) 行 顯 微 鏡 檢 查 和 LB培 養(yǎng) 基 劃 線檢 查 ， 控 制 雜 菌 v 3.發(fā) 酵 罐 培 養(yǎng) 將 種 子 液 通 入 300L培 養(yǎng) 基 的 發(fā) 酵 罐 中 ， 接種 量 10%， 培 養(yǎng) 溫 度 30

22、， pH7.0。 級(jí) 聯(lián) 調(diào) 節(jié) 通 氣 量 和 攪 拌 轉(zhuǎn)速 ， 控 制 溶 解 氧 30%， 培 養(yǎng) 4小 時(shí) 。 然 后 控 制 培 養(yǎng) 溫 度 20 ，pH6.0， 溶 解 氧 60%， 繼 續(xù) 培 養(yǎng) 5 6.5小 時(shí) 。 同 時(shí) 進(jìn) 行 發(fā) 酵 液雜 菌 檢 查 ， 當(dāng) OD值 達(dá) 9.0 1.0后 ， 用 5 冷 卻 水 快 速 降 溫 至15 以 下 ， 以 減 緩 細(xì) 胞 衰 老 。 或 者 將 發(fā) 酵 液 轉(zhuǎn) 入 收 集 罐 中 ，加 入 冰 塊 使 溫 度 迅 速 降 至 10 以 下 。v 4. 菌 體 收 集 將 已 降 溫 的 發(fā) 酵 液 轉(zhuǎn) 入 連 續(xù) 流 離 心

23、 機(jī) ，16000 r/min離 心 收 集 。 進(jìn) 行 干 擾 素 含 量 、 菌 體 蛋 白 含 量 、菌 體 干 燥 失 重 、 質(zhì) 粒 結(jié) 構(gòu) 一 致 性 、 質(zhì) 粒 穩(wěn) 定 性 等 項(xiàng) 目 的 檢 測(cè) 。菌 體 于 20 冰 柜 中 保 存 時(shí) ， 不 得 超 過(guò) 12個(gè) 月 。 每 保 存 3個(gè)月 ， 檢 查 一 次 活 性 。 干 擾 素 發(fā) 酵 過(guò) 程 控 制v 在 假 單 孢 桿 菌 的 發(fā) 酵 生 產(chǎn) 中 ， 菌 體 在 培 養(yǎng) 1.5小 時(shí) 分 裂速 度 最 快 ， 到 3.5小 時(shí) 開(kāi) 始 下 降 。 而 干 擾 素 的 迅 速 合 成 出 現(xiàn)在 3.5小 時(shí) 之 后

24、， 在 4小 時(shí) 達(dá) 到 最 大 ， 然 后 由 于 降 解 而 迅 速 下降 。 可 見(jiàn) 在 發(fā) 酵 生 產(chǎn) 工 藝 中 ， 假 單 孢 桿 菌 的 生 長(zhǎng) 和 干 擾 素 的生 產(chǎn) 基 本 處 于 不 相 關(guān) 狀 態(tài) ， 可 采 用 兩 段 培 養(yǎng) 的 策 略 進(jìn) 行 過(guò) 程控 制 。 v (1) 溶 解 氧 控 制 分 別 在 生 長(zhǎng) 階 段 和 生 產(chǎn) 階 段 采 用 各 自最 佳 溶 解 氧 濃 度 ， 以 期 提 高 干 擾 素 的 發(fā) 酵 水 平 。 通 過(guò) 級(jí) 聯(lián) 調(diào)節(jié) 通 氣 量 和 攪 拌 轉(zhuǎn) 速 得 以 實(shí) 現(xiàn) 。v (2). 溫 度 控 制 假 單 孢 桿 菌 生 長(zhǎng)

25、最 適 溫 度 與 產(chǎn) 物 形 成最 適 溫 度 是 不 同 的 。 產(chǎn) 物 合 成 溫 度 控 制 在 20 可 以 有 效 防 止干 擾 素 - 2b的 降 解 ， 而 其 最 佳 生 長(zhǎng) 溫 度 則 為 30 。 質(zhì) 粒 的穩(wěn) 定 性 隨 溫 度 的 升 高 而 迅 速 下 降 ， 因 此 在 培 養(yǎng) 后 期 降 溫 可 以減 少 目 標(biāo) 產(chǎn) 物 的 降 解 ， 增 加 質(zhì) 粒 的 穩(wěn) 定 性 。v (3) pH值 發(fā) 酵 過(guò) 程 中 ， pH的 變 化 由 工 程 菌 的 代謝 、 培 養(yǎng) 基 的 組 成 和 發(fā) 酵 條 件 所 決 定 。 干 擾 素 - 的 等 電 點(diǎn)在 pH 6.

26、0附 近 ， 在 低 酸 性 條 件 下 穩(wěn) 定 ， 能 耐 受 pH 2.5的 酸 性環(huán) 境 。 因 此 可 在 發(fā) 酵 后 期 降 低 pH， 從 而 造 成 大 量 蛋 白 酶 失 活 ，減 少 干 擾 素 - 的 水 解 ， 提 高 干 擾 素 的 積 累 量 。 半 成 品 檢 定v （ 1） 效 價(jià) 測(cè) 定 用 細(xì) 胞 病 變 抑 制 法 ， 以 Wish細(xì) 胞 、 VSV病 毒 為 基 本 檢 測(cè)系 統(tǒng) ， 測(cè) 定 中 必 須 用 國(guó) 家 或 國(guó) 際 參 考 品 校 準(zhǔn) 為 國(guó) 際 單 位 。v （ 2） 蛋 白 質(zhì) 含 量 測(cè) 定v 福 林 -酚 法 ， 以 中 國(guó) 藥 品 生

27、 物 制 品 檢 定 所 提 供 的 標(biāo) 準(zhǔn) 蛋白 為 標(biāo) 準(zhǔn) 。v （ 3） 比 活 性v 效 價(jià) 的 國(guó) 際 單 位 與 蛋 白 質(zhì) 含 量 的 毫 克 數(shù) 之 比 。v （ 4） 純 度 v 電 泳 純 度 用 非 還 原 型 SDS-PAGE法 ， 銀 染 顯 色 應(yīng) 為 單 一區(qū) 帶 ， 經(jīng) 掃 描 儀 測(cè) 定 純 度 應(yīng) 在 95%以 上 。 v （ 5） 相 對(duì) 分 子 量 測(cè) 定v 還 原 型 SDS-PAGE， 加 樣 量 不 地 域 微 克 ， 同 時(shí) 用 已 知 相對(duì) 分 子 量 的 蛋 白 標(biāo) 準(zhǔn) 系 列 做 對(duì) 照 ， 以 遷 移 率 為 橫 坐 標(biāo) ， 相 對(duì)分 子

28、 量 的 對(duì) 數(shù) 為 縱 坐 標(biāo) 作 圖 ， 計(jì) 算 相 對(duì) 分 子 量 。 與 理 論 值 比較 ， 誤 差 不 得 高 于 10%。v （ 6） 殘 余 外 源 性 DNA含 量 測(cè) 定v 用 放 射 性 核 素 或 生 物 素 探 針 法 測(cè) 定 ， 每 劑 量 中 殘 余 外源 性 DNA應(yīng) 低 于 100pg。v （ 7） 殘 余 血 清 IgG含 量 測(cè) 定v 在 應(yīng) 用 抗 體 親 和 層 析 法 作 為 純 化 方 法 時(shí) 必 須 進(jìn) 行 此 項(xiàng)檢 定 。v （ 8） 殘 余 抗 生 素 活 性 測(cè) 定 v 半 成 品 中 不 應(yīng) 有 抗 生 素 活 性 存 在 。 v （ 9

29、） 紫 外 光 譜 掃 描v 檢 查 半 成 品 的 光 譜 吸 收 值 ， 最 大 吸 收 值 應(yīng) 在 280 2納米 。v （ 10） 肽 圖 測(cè) 定v 用 CNBr裂 解 法 ， 測(cè) 定 結(jié) 果 應(yīng) 符 合 干 擾 素 的 結(jié) 構(gòu) ， 且 批與 批 之 間 應(yīng) 一 致 。v （ 11） 等 電 點(diǎn) 測(cè) 定 等 電 聚 焦 電 泳 。v （ 12） 除 菌 半 成 品 應(yīng) 做 干 擾 素 效 價(jià) 測(cè) 定 、 無(wú) 菌 試 驗(yàn) 和 熱 源 質(zhì)試 驗(yàn) 。 成 品 檢 定v （ 1） 物 理 性 狀v 凍 干 品 白 色 或 微 黃 色 疏 松 體 ， 加 入 注 射 水 后 不 得含 有 肉 眼

30、 可 見(jiàn) 不 溶 物 。v （ 2） 鑒 別 試 驗(yàn)v 應(yīng) 用 ELISA或 中 和 試 驗(yàn) 檢 定 。v （ 3） 水 分 測(cè) 定v 用 卡 氏 法 ， 應(yīng) 低 于 3%。v （ 4） 無(wú) 菌 試 驗(yàn) v 同 半 成 品 。 v （ 5） 熱 原 質(zhì) 試 驗(yàn)v 同 半 成 品 檢 定 。v v （ 6） 干 擾 素 效 價(jià) 測(cè) 定v 同 半 成 品 檢 定 ， 效 價(jià) 不 應(yīng) 低 于 標(biāo) 示 量 。v （ 7） 安 全 試 驗(yàn)v 取 體 重 為 350-400克 豚 鼠 3只 ， 每 只 腹 側(cè) 皮 下 注 射量 為 成 人 每 千 克 體 重 臨 床 使 用 最 大 量 的 3倍 ， 觀

31、察 7天 ， 若 豚鼠 局 部 無(wú) 紅 腫 、 壞 死 、 總 體 重 不 下 降 ， 說(shuō) 明 成 品 合 格 。 取 體 重 18-20克 小 鼠 5只 ， 每 只 尾 靜 脈 注 射 劑 量 按 人每 千 克 體 重 臨 床 使 用 最 大 量 的 3倍 ， 觀 察 7天 ， 若 動(dòng) 物 全 部 存活 ， 說(shuō) 明 成 品 合 格 。 1.目 的 基 因 的 獲 取 為 什 么 用 mRNA而 不 是 DNA？v 基 因 組 ， 即 某 種 生 物 一 個(gè) 細(xì) 胞 內(nèi) 全 部 的 DNA信 息 。v 將 這 些 DNA打 斷 ， 連 接 到 載 體 上 并 轉(zhuǎn) 入 微 生 物 ， 使 這 些

32、 微 生 物 細(xì) 胞 內(nèi) 含有 某 生 物 的 全 部 基 因 組 。 那 么 這 些 微 生 物 就 組 成 了 基 因 組 文 庫(kù) 。v 以 上 兩 者 包 含 的 都 是 遺 傳 信 息 。 對(duì) 于 某 種 生 物 來(lái) 說(shuō) ， 任 何 一 個(gè) 細(xì) 胞 的 遺傳 信 息 都 是 相 同 的 。v cDNA是 由 細(xì) 胞 內(nèi) 的 mRNA通 過(guò) 逆 轉(zhuǎn) 錄 的 方 式 獲 得 的 ， 其 包 含 的 一 個(gè) 細(xì)胞 內(nèi) 的 表 達(dá) 信 息 。 多 細(xì) 胞 生 物 的 不 同 細(xì) 胞 的 表 達(dá) 信 息 往 往 是 不 同 的 。 若將 某 一 個(gè) 細(xì) 胞 全 部 的 mRNA（ 又 稱 為 這

33、 個(gè) 細(xì) 胞 的 轉(zhuǎn) 錄 組 ） 都 逆 轉(zhuǎn) 錄 成cDNA， 再 將 這 些 cDNA連 接 到 載 體 上 （ 基 本 上 不 打 斷 ） 并 轉(zhuǎn) 入 微 生 物 ，那 么 這 些 微 生 物 就 組 成 了 cDNA文 庫(kù) 。 v 簡(jiǎn) 單 來(lái) 說(shuō) ， 基 因 組 是 分 子 ， 基 因 組 文 庫(kù) 是 表 示 遺 傳 信 息 的 微 生 物 ，cDNA文 庫(kù) 是 表 示 表 達(dá) 信 息 的 微 生 物 。 2、 選 擇 大 腸 桿 菌 作 為 宿 主 細(xì) 胞 的 原 因 ：v 第 一 ,大 腸 桿 菌 是 一 種 常 見(jiàn) 菌 種 .人 們 對(duì) 其 細(xì) 胞 形 態(tài) 及 生 理 生 化 特

34、性 已 經(jīng) 了解 比 較 深 入 ,對(duì) 于 培 養(yǎng) 基 配 制 與 運(yùn) 載 體 導(dǎo) 入 的 具 體 技 術(shù) 等 方 面 也 就 更 容 易把 握 .v 第 二 ,細(xì) 菌 質(zhì) 粒 (游 離 于 細(xì) 菌 等 微 生 物 細(xì) 胞 質(zhì) 中 的 小 型 環(huán) 狀 DNA分 子 )是基 因 工 程 常 用 的 運(yùn) 載 體 (與 目 的 基 因 結(jié) 合 的 工 具 ),而 大 腸 桿 菌 質(zhì) 粒 又 是 最常 用 的 質(zhì) 粒 ,因 為 大 腸 桿 菌 質(zhì) 粒 上 有 諸 如 抗 青 霉 素 基 因 等 易 于 檢 測(cè) 的 標(biāo) 記基 因 ,并 且 容 易 使 目 的 基 因 在 宿 主 細(xì) 胞 中 復(fù) 制 和

35、表 達(dá) .而 最 適 合 大 腸 桿 菌 質(zhì)粒 完 成 使 命 的 場(chǎng) 所 當(dāng) 然 就 是 它 的 天 然 來(lái) 源 大 腸 桿 菌 .v 第 三 ,大 腸 桿 菌 是 一 種 典 型 兼 性 厭 氧 行 細(xì) 菌 ,由 于 體 積 小 ,表 面 積 與 體 積的 比 例 很 大 ,并 且 能 利 用 氧 氣 進(jìn) 行 徹 底 生 物 氧 化 釋 放 大 量 能 量 ,因 而 能 夠 與外 界 迅 速 進(jìn) 行 物 質(zhì) 和 能 量 交 換 ,并 在 體 內(nèi) 迅 速 轉(zhuǎn) 化 .這 樣 一 來(lái) 使 大 腸 桿 菌 新陳 代 謝 極 其 迅 速 ,就 如 同 一 個(gè) 效 率 極 高 的 化 工 廠 ,而 與 真 正 化 工 廠 相 比 所 需反 應(yīng) 條 件 又 很 溫 和 ,容 易 達(dá) 到 ,其 經(jīng) 濟(jì) 效 益 是 顯 而 易 見(jiàn) 的 . v 綜 合 以 上 考 慮 大 腸 桿 菌 常 選 為 宿 主 菌 用 于 基 因 工 程 也 就 不 足 為 怪 了